Name: ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶ、ウズラ胚の卵黄嚢膜から一次内胚葉上皮細胞を培養する方法。コラゲナーゼ処理による細胞収集の改善と脂質輸送メカニズムの解明に有用な鳥類発生モデルを確立する技術です。

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現在のプロトコルの開発のための資金調達、特に国立台湾大学の「トップ大学の計画のねらい」によってサポートされ、台湾（グラントID-104R350144）、ならびに台湾の科学技術省（グラントID：MOST 104 -2313-B-002から039-MY3）。我々は、特に現在の研究のための動物室と実験室のスペースを提供するために国立台湾大学のバイオテクノロジーセンターに感謝します。

注：この手順では、バウアーら 2013と中澤らによって開発された鶏のモデル培養プロトコルの変形例であり、2011年2,9 1.健康な胚5日目胚ウズラからの準備<ol><li>同じケージで一緒に男性1人と女性3性的に成熟した日本のウズラを置きます。サプライ飼料と水を自由 。光の14時間と闇の10時間に動物室に光を調整します。 </li><li>午後には毎日のビニール袋に受精卵を収集し、胚の成長率を遅らせるために16℃の冷蔵庫に保管してください。 </li><li> 2週間の期間内に卵の十分な数を収集した後、5日間通気性のいい37℃のインキュベーター中で受精卵を培養します。 </li></ol> 2.基礎培地と洗浄ソリューションを準備します<ol><li>増殖培地として（pH7.2に調整）、DMEM / F-12培地を使用し、それを補完10％新生ウシ血清（NBCS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン両性で。ソリューション（PSA;ペニシリン、10 5単位/ L;ストレプトマイシン、100 mg / Lで、アムホテリシンB、0.25 mg / Lで）。 </li><li>貯蔵のために10倍濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を調製します。卵黄嚢膜しばらく洗浄し、湿らせる（pHを7.2に調整;のKCl、2.667ミリモル; KH 2 PO 4、1.471ミリモル;のNa 2 HPO 4・7H 2 O、8.06のNaCl、137.93ミリモルを含む）1×PBS溶液を使用卵黄とアルブミンから内胚葉を分離します。 </li><li>内胚葉ペレットを再懸濁する（pHを7.2に調整）DMEM培地を使用してください。 </li></ol>ウズラYSMsからプライマリEECSの3コレクション<ol><li> 5日間（ステップ1.3）のために収集した卵をインキュベートします。正常な胚発生を確認するために検卵器によって卵を調べます。 注：胚5日目に、YSMの中胚葉の境界が非常に明確であり、3胚層が少ない一緒に緊密にリンクされているので、OBするのは簡単ですTainの内胚葉。 YSMコレクションの正常な毛細血管循環の発達を示す卵のみを使用します。 </li><li>慎重に新鮮な水と75％エタノールを使用して卵殻を清掃してください。ハサミによって空気セル位置から卵殻を開き、そっと出て剥離し、37℃、1×PBSで満たされた10cmの培養皿で鉗子と場所によって全体YSMを集めます。 </li><li>はさみのペアを使用すると、胚、卵黄と卵白を削除し、穏やかに1×PBSで3回YSMを洗浄し、10cmの培養皿にPBS溶液中でYSMを配置します。 </li><li> YSMから外胚葉を除去するために鉗子やハサミを使用してください。 2ピンセットを使用し、一方はしっかりと内胚葉細胞層を保持し、他方は、毛管中胚葉を保持します。 </li><li>解剖顕微鏡下で、引き離すと胚に向かう方向に中胚葉の端から内胚葉を分離します。 37°Cワットで増殖培地15ml中ドロッパーと場所を使用して、50ml遠心管中で淡黄色胚葉を収集ER浴すべての組織のコレクションは完了するまで。 </li></ol>コラゲナーゼ消化により内胚葉スライスの4消化<ol><li>たてDMEM 10ml中のIV型コラゲナーゼの6.5単位を溶解します。 </li><li>遠心分離を室温で3分間、130×gで50mlチューブ（3.4）。培地を吸引し、ピペットを用いてを6cm培養皿内のすべての内胚葉を配置します。この培養皿に1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を追加します。 </li><li>各スライスのサイズが約2〜3mm程度になるまで、湾曲したハサミで2ウズラ胚から収集した内胚葉をスライス。新鮮なコラゲナーゼ溶液の9ミリリットルと一緒に50ミリリットルの遠心分離管にすべてのスライスを収集し、スポイトを使用してください。 </li><li> 175 rpmで37℃の振とう水浴中で30分間コラゲナーゼで組織を消化します。コラゲナーゼとこの部分消化は、外植片の細胞増殖を改善するために使用されます。 </li><li> RTで3分間130×gで遠心分離し、静かにピペットを用いて上清画分を除去。 20ミリリットルDMEM中に懸濁することによってペレットを洗浄し、3分間130×gで遠心分離後の上清画分を除去します。 </li><li>成長培地（10％NBCSと1％のPSAを含むDMEM / F12）の12ミリリットルでペレットを再懸濁し、（500μlの細胞溶液で各ウェル）を24ウェルプレートに穏やかに均等に種子。 </li><li>細胞は組織外に増殖することを可能にする2日間空気中に5％、37℃でCO 2の組織外植片をインキュベートします。 </li><li>さらに2日間、細胞をインキュベートし、細胞生存率アッセイプロトコルによって、細胞生存率を特徴付ける。15 注：生細胞は、細胞質ゾル内の還元環境を維持します。レサズリン、活性成分は、色が青色と実質的に非蛍光性である非毒性、細胞透過性化合物です。細胞培養物に添加した場合に、レサズリンは、ミトコンドリア酵素によって細胞質にレゾルフィンに還元されます。レゾルフィンの色は赤と非常に蛍光性です。生存細胞が連続レサズリンをレゾルフィンに変換、incre細胞周囲の培地の全体的な蛍光と色をasing。 </li><li>説明したように内胚葉上皮細胞の全RNAの単離を行い、逆転写し、マーカー遺伝子のmRNA発現の定量的リアルタイムPCR。16,17 <ol><li> SOAT1 mRNAを検出するために、逆転写酵素PCRを使用してください（センス：5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;;アンチセンス：5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; PCR産物= 168 bp）をEEC細胞に特異的なマーカーとして。 βアクチンのmRNAを使用し（センス：5&#39;TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;;アンチセンス：5&#39;GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; PCR産物= 151 bp）のハウスキーピング遺伝子および内部コントロールとして。 </li><li> RT-qPCRのの製品サイズを検出するために、ゲル電気泳動を使用してください。 1％アガロースゲルを準備し、2μlのローディング色素と10μlの定量PCR産物を混合します。 1％アガロースゲル中の各ウェルに負荷10μlの混合物を、30分間100Vてゲルを実行します。 </li></ol></li></ol>

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競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。民間企業から資金提供を受けていませんでした。

前培養系のみ限定された成功を有しているので、より良好な培養系が必要です。日本ウズラYSM内胚葉は、ex vivoでの外植片でより良い成長の性能を達成するために、細胞間結合を緩めコラゲナーゼのようなタンパク質分解酵素で処理することが必要です。我々のデータは、部分消化処理の細胞数は、2日間（ 図1）のために播種した後、未消化組織培養からより大きかったことを示しています。したがって、部分的なタンパク質分解消化はYSMから細胞収量を改善するための重要なステップです。 現在の培養プロトコルにおける重要な変更は、部分的なタンパク質分解性消化です。この処理は大幅に細胞収率とライブEECSを得るための成功率を高めました。過剰消化が組織から細胞を分離し、細胞は、プレートに付着しないので、下の消化から少ない細胞収量が得られたのに対し、消化時間は非常に重要です組織外植片。我々は、上記の条件を用いて、30〜40分間の消化が最適であることを見出しました。 現在のプロトコルは、EECSを得るために、高い技術トレーニングを...

鳥類胚の主要な栄養リソースは、胚発生の間に33％脂質、17％のタンパク質、および1％の灰分から成る卵黄、。1で、卵黄嚢膜（YSM）は、胚腹腔内から成長し、次第に卵黄をカバー表面。胚2日目で開始し、脂質代謝と血管新生に関連した遺伝子発現が徐々にYSMに増加し、YSMはゆっくり絨毛状突起を開発しています。8,9これらの予測は、胚発生をサポートするために、卵黄の栄養素の吸収を増加させます。 YSMは、三胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉が含まれている胚体外組織である。14卵黄嚢の外胚葉は優しく卵黄嚢をカバーするために卵黄膜と卵白とリンクに直面しています。内胚葉上皮細胞は、卵黄に向かって直接直面し、などの栄養素の利用ポータルを提供しています。6 YSMが拡大するにつれて、内胚葉上皮細胞（EECS）SHAPによって分割することができています二つのグループ、地域の卵黄と血管野にeと機能性。7 エリア卵黄は、内胚葉細胞で構成され、胚から遠いです。血管野は、中胚葉細胞で構成され、血管や結合組織に分化さEECSを覆っています。胚5日目までに、卵黄を完全にYSMの外胚葉と内胚葉で覆われていると血管領域が急速に成長してきました。 YSMは、胚の循環系に、吸収し再構成すると解放（卵黄由来の超低密度リポタンパク質など）、脂質やタンパク質。9、2はしたがって、我々は脂質のメカニズムを研究するために、主要な日本のウズラ胚性内胚葉上皮細胞培養系を確立しました鳥類の胚発生時のYSMで利用。 このようなトリアシルグリセロール、レシチン、リン脂質とコレステロールエステル（CE）などの脂質は、鳥類の胚のための一次エネルギー源です。開発の初期段階で、卵黄脂質は、Cでありますわずか1.3％のCEのomposed、それは鳥類の胚発生3、11の中期で10から15%に上昇する。コレステロールエステルは、鳥類の胚YSMにステロールO-アシルトランスフェラーゼ1（SOAT1）によってコレステロールから合成される。4 コレステロールの貯蔵形態は、CE、CEはリポタンパク質で運ばれており、リポタンパク質は、組織への循環によって輸送される。13週ハッチの前に鳥類の胚の急速な成長があります。約卵黄の残りの脂質含有量の68％は、この段階で吸収される。10脂質はEEC研究モデルによって明らかにすることができる利用されている卵黄れる機構。鶏のEEC培養プロトコルは、この研究の目標を達成するために設立されました。2、9しかし、改善されたEEC細胞培養手順はによって栄養利用を媒介に特定の酵素やタンパク質の機能を研究するために必要とされる組織外植片の低い成功率に開発中に鳥類の胚。

<table><tbody><tr><td>Dulbeccoの変更されたイーグルミディアム</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>EECsペレット</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>EECsの培養における基礎媒体として</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>EECsの培養における供給血清として</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho.Solution</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>感染の可能性を弱めるために&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV型</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp;コラゲナーゼは、Pro-XGly-Pro配列中の中性アミノ酸(X)とグリシンとの間の結合に特異性を持つプロテアーゼです。初代組織からの細胞の解離のためのプロテアーゼとして。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>FALCON&reg;</td><td>REF-353047</td><td>EECが50</td></tr><tr><td>ml PP遠心分離管</td>を取り付けたり延長したりする場合 <td>Corning&reg; CentriStarTM</sup</td><td>>430829</td><td>膜の輸送と酵素消化用</td></tr><tr><td>キャップ付き 50ml 円錐底チューブ</td><td>キャップ付き PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>膜の輸送と酵素消化用</td></tr><tr><td>レシプロカルシェイキングバス</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>膜上での酵素消化を向上させるため</td></tr></tbody></table>

ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

我々は、開発中に、鳥類の胚によって栄養利用を媒介に特定の酵素やタンパク質の機能を研究するための内胚葉上皮細胞培養モデル（EEC）を設立しました。受精したウズラの卵を、5日間37℃でインキュベートし、次いで嚢膜（YSM）がEEC培養システムを確立するために収集された卵黄ました。我々はYSMから胚の胚葉層を単離し、そして2内膜をスライス - 3mmの小片と部分的に24ウェル培養プレートに播種する前に、コラゲナーゼで消化しました。 EECSは、組織の外に増殖し、細胞培養研究のための準備ができています。我々は、ステロールO-アシルトランスフェラーゼ、およびリポタンパク質リパーゼの発現、例えば、EECSがインビボで YSMの典型的な特徴を有していること脂肪滴の蓄積を見出しました。部分的消化処理が大幅EEC文化の成功率を増加させました。 EECSを利用して、我々はSOAT1の発現がcAMPのDによって調節されることを実証しましたependentタンパク質は、関連経路キナーゼ。このプライマリ日本ウズラEEC培養システムは、胚脂質輸送を研究すると鳥類の胚発生の間YSMに栄養利用を媒介に関与する遺伝子の役割を明確にするために便利なツールです。

一貫性のある有用な細胞モデルを確立する目的を達成するために、我々は、トリEECSの増殖速度と性能を拡張し、安定させる必要があります。我々は、部分的に、このようなコラゲナーゼまたはコラゲナーゼプラスディスパーゼの0.6 Uのようなタンパク質分解酵素で消化内胚葉と無酵素消化と内胚葉の直接のインキュベーションを比較しました。ディスパーゼは、非極性アミノ酸残基のN末端のペプチド結合を加水分解するアミノ - エンドペプチダーゼです。プロテアーゼ消化治療はなし消化（ 図1）と比較して細胞増殖を増加させたのに対し、細胞増殖は、5日間のインキュベーション（ 図2）の後に2つの酵素処置間著しく異なっていませんでした。しかし、コラゲナーゼ処理は、より良好な成長曲線をもたらし、EECSは6-9日（ 図2）のために着実に増殖することを示しました。このように、部分的コラゲナーゼ消化からEECSの成長を改善しex vivoでの外植片と十分かつ機能的なEECを取得することをお勧めします。 <p...

鳥類の胚発生後期における卵黄嚢膜の脂質利用メカニズムを研究するために、私たちは初代ニホンウズラ胚性内胚葉上皮細胞培養システムを確立しました。

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

このex vivo組織片採取手順の全体的な目的は、鳥類胚による栄養利用を媒介する酵素およびタンパク質の機能を研究するため、鳥類内胚葉上皮細胞の回収を改善し、その応用範囲を拡大することです。本手法は、発生の後期において卵黄脂質がどのようにパッケージ化され、卵黄から胚へと輸送されるかなど、鳥類胚発生中の脂質利用に関する重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、ウズラの卵黄嚢膜から機能的な内胚葉上皮細胞を正常に切り出し、鳥類胚発生の研究モデルとして利用できる点にあります。まず、テキストプロトコルに従って10x PBS溶液を作製します。このストック溶液を10倍に希釈して1x PBSを調製し、内胚葉の剥離時に卵黄嚢膜の洗浄に使用します。内胚葉上皮細胞（EEC）用の増殖培地を調製するには、まずDMEM/F-12に10% newborn calf serumと1% penicillin streptomycin amphotericin solutionを添加します。その後、pHメーターのプローブをあらかじめ調製したDMEMに挿入します。pHが7.2になるまで、3N HClを培地中に一滴ずつ加えます。約24個の受精ウズラ卵を回収し、気室のある幅広く尖っていない側が上を向くように、卵容器に垂直に配置します。次に、卵を37°Cに設定した換気の良いインキュベーターに移します。5日間の incubation 後、検卵器で卵を調べます。胚が正常に発達していれば、気室の下に毛細血管の円形構造が見られます。正常な毛細血管の発達が見られる卵を選択し、殻を真水と75% ethanolで洗浄します。次に、はさみを使用して気室の位置から卵殻を開きます。ピンセットを用いて、卵の内容物を空の10 cm培養皿にゆっくりと注ぎ出します。次に、ハサミを使用して、胚、卵黄、およびアルブミンを卵黄嚢膜（YSMと略記）から切り離します。YSMを単離した後、1x PBSで3回洗浄し、PBSを含む新しい10 cmディッシュに移します。その後、ディッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。次に、ハサミを用いて、YSMの外側外胚葉層に接している残りの卵白を除去します。続いて、ピンセットを使用して、卵黄嚢膜の中胚葉の端から、半透明の外胚葉と赤色の毛細血管構造を持つ中胚葉を持ち上げます。その後、外胚葉と中胚葉を一緒にゆっくりとはがし、下層の内胚葉細胞層を単離します。次に、1組のピンセットで膜の黄色い内胚葉細胞層をしっかりと保持します。もう1組のピンセットで毛細管中胚葉を掴み、中胚葉と内胚葉の接合端から中胚葉を引き離します。ハサミを用いて、残った黄色い内胚葉層を切り離し、成長培地を満たした6cm培養皿に移します。スポイトを使用して、YSM回収後の6 cm培養皿から淡黄色の内胚葉を15 mL遠心チューブに移し、あらかじめ調製した増殖培地15 mLを加えます。すべての組織回収が完了するまで、コニカルチューブを37 °Cのウォーターバスに入れておきます。まず、6.5 unitsのIV型コラゲナーゼを10 mLのDMEMに溶解させて開始します。次に、内胚葉を含むチューブを室温で130 ×gで3分間遠心分離します。遠心分離後、培地を吸引し、スポイトを用いてすべての内胚葉サンプルを6 cm培養皿に移します。その後、皿に1 mLのコラーゲン溶液を加えます。曲剪刀を用いて、4羽のウズラ胚から採取した内胚葉を約2〜3 mmの大きさに細切します。その後、切り出した組織片を50 mL遠心チューブに回収し、あらかじめチューブに入れておいた9 mLの新鮮なコラゲナーゼ溶液に懸濁させます。外植片培養段階での細胞増殖を促進するため、チューブを37 °Cに設定した振盪恒温水槽に入れます。次に、コニカルチューブを30分間インキュベートし、コラゲナーゼで組織を部分的に消化します。この部分的なタンパク質分解消化は、卵黄嚢膜内胚葉からの細胞回収率を向上させるために最も重要なステップです。当社のデータでは、コラゲナーゼ消化処置により、細胞培養の成功率と細胞増殖が大幅に改善されることが示されています。コラゲナーゼ消化後、組織を室温で130 ×gにて3分間遠心分離し、ピペットで上清画分を除去します。次に、ペレットを20 mLのDMEMに再懸濁して洗浄します。前述の手順でチューブを遠心分離し、その後、上清を除去してペレットを12 mLの増殖培地に再懸濁します。次に、懸濁液を500 µLずつ24ウェルプレートの各ウェルに静かに分注します。内胚葉外植片を37 °C、5% CO2条件下で2日間インキュベートします。この期間に、組織から細胞が増殖して広がることが期待されます。次に、細胞をさらに2日間インキュベートします。その後、細胞生存率アッセイを行い、プレートリーダーを用いて結果を可視化します。続いて、RT-qPCRを実施してEECにおける標的マーカーの発現レベルを評価し、テキストプロトコルに記載されている通り、ゲル電気泳動によってRT-qPCRの産物サイズを確認します。これらのグラフに示され、対応のあるt検定によって判定されたように、未処理の外植片と比較して、コラゲナーゼで部分消化した外植片では細胞増殖が有意に増加しており、本培養システムの有効性が実証されました。他の酵素の影響を評価するため、コラゲナーゼとディスパーゼで処理した組織、およびコラゲナーゼのみで処理した組織について細胞生存率アッセイを実施しました。培養開始後の5日間において、細胞増殖は両方の条件で同様でした。しかしながら、6日目から9日目にかけては、コラゲナーゼ処理したEECのみが安定して増殖したため、この酵素による部分消化が成長を促進し、優先的に使用されるべきであることが示唆された。培養したEECを可視化したところ、ここで示すように、大きな円形の脂質滴という脂肪細胞のような特徴が認められた。また、これらの細胞は、通常脂肪細胞の同定に用いられるOil Red O染色においても陽性であった。これらの形態学的データを裏付けるように、リアルタイム定量PCRにより、培養されたEECは、コレステロールからコレステロールエステルを合成するタンパク質であるSOAT1を高レベルで発現していることが明らかになりました。このことは、培養EECが脂肪細胞としての正しい生理学的特性を備えていることをさらに示唆しています。重要な点として、サイクリックアデノシンモノリン酸（cAMP）レベルを上昇させる因子であるIBMXおよびフォルスコリンにEECを曝露させ、24時間培養したところ、いずれの処理においてもSOAT1の発現が促進されました。この結果は、YSMにおけるSOAT1の調節および脂質利用の可能なメカニズムを示唆しています。この手法を習得すれば、約4時間で完了することができ、その間に少なくとも3つのサンプルを回収することが可能です。本手順に続き、SOAT1などの手法やその他の酵素活性測定、および同様の視覚的確認を行うことができます。このようなアッセイは、特定のタンパク質やマクロ栄養素が胚発生の後期段階にどのように関与しているかなど、さらなる疑問を解明するのに役立ちます。本手法の開発により、鳥類胚モデルにおける栄養素の利用および輸送の潜在的なメカニズムを探索することが可能となり、胚の栄養利用分野の研究者に道が開かれました。このビデオを視聴することで、鳥類胚から内胚葉組織を採取する方法を習得し、さらに鳥類モデルを用いた胚の栄養輸送および利用の研究に向けたEECの培養方法を理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養

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