ウズラ胚の卵黄嚢の膜からの一次内胚葉上皮細胞培養

このex vivo組織片採取手順の全体的な目的は、鳥類胚による栄養利用を媒介する酵素およびタンパク質の機能を研究するため、鳥類内胚葉上皮細胞の回収を改善し、その応用範囲を拡大することです。本手法は、発生の後期において卵黄脂質がどのようにパッケージ化され、卵黄から胚へと輸送されるかなど、鳥類胚発生中の脂質利用に関する重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、ウズラの卵黄嚢膜から機能的な内胚葉上皮細胞を正常に切り出し、鳥類胚発生の研究モデルとして利用できる点にあります。

まず、テキストプロトコルに従って10x PBS溶液を作製します。このストック溶液を10倍に希釈して1x PBSを調製し、内胚葉の剥離時に卵黄嚢膜の洗浄に使用します。内胚葉上皮細胞（EEC）用の増殖培地を調製するには、まずDMEM/F-12に10% newborn calf serumと1% penicillin streptomycin amphotericin solutionを添加します。

その後、pHメーターのプローブをあらかじめ調製したDMEMに挿入します。pHが7.2になるまで、3N HClを培地中に一滴ずつ加えます。約24個の受精ウズラ卵を回収し、気室のある幅広く尖っていない側が上を向くように、卵容器に垂直に配置します。

次に、卵を37°Cに設定した換気の良いインキュベーターに移します。5日間の incubation 後、検卵器で卵を調べます。胚が正常に発達していれば、気室の下に毛細血管の円形構造が見られます。

正常な毛細血管の発達が見られる卵を選択し、殻を真水と75% ethanolで洗浄します。次に、はさみを使用して気室の位置から卵殻を開きます。ピンセットを用いて、卵の内容物を空の10 cm培養皿にゆっくりと注ぎ出します。

次に、ハサミを使用して、胚、卵黄、およびアルブミンを卵黄嚢膜（YSMと略記）から切り離します。YSMを単離した後、1x PBSで3回洗浄し、PBSを含む新しい10 cmディッシュに移します。その後、ディッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。

次に、ハサミを用いて、YSMの外側外胚葉層に接している残りの卵白を除去します。続いて、ピンセットを使用して、卵黄嚢膜の中胚葉の端から、半透明の外胚葉と赤色の毛細血管構造を持つ中胚葉を持ち上げます。その後、外胚葉と中胚葉を一緒にゆっくりとはがし、下層の内胚葉細胞層を単離します。

次に、1組のピンセットで膜の黄色い内胚葉細胞層をしっかりと保持します。もう1組のピンセットで毛細管中胚葉を掴み、中胚葉と内胚葉の接合端から中胚葉を引き離します。ハサミを用いて、残った黄色い内胚葉層を切り離し、成長培地を満たした6cm培養皿に移します。

スポイトを使用して、YSM回収後の6 cm培養皿から淡黄色の内胚葉を15 mL遠心チューブに移し、あらかじめ調製した増殖培地15 mLを加えます。すべての組織回収が完了するまで、コニカルチューブを37 °Cのウォーターバスに入れておきます。まず、6.5 unitsのIV型コラゲナーゼを10 mLのDMEMに溶解させて開始します。

次に、内胚葉を含むチューブを室温で130 ×gで3分間遠心分離します。遠心分離後、培地を吸引し、スポイトを用いてすべての内胚葉サンプルを6 cm培養皿に移します。その後、皿に1 mLのコラーゲン溶液を加えます。

曲剪刀を用いて、4羽のウズラ胚から採取した内胚葉を約2〜3 mmの大きさに細切します。その後、切り出した組織片を50 mL遠心チューブに回収し、あらかじめチューブに入れておいた9 mLの新鮮なコラゲナーゼ溶液に懸濁させます。外植片培養段階での細胞増殖を促進するため、チューブを37 °Cに設定した振盪恒温水槽に入れます。

次に、コニカルチューブを30分間インキュベートし、コラゲナーゼで組織を部分的に消化します。この部分的なタンパク質分解消化は、卵黄嚢膜内胚葉からの細胞回収率を向上させるために最も重要なステップです。当社のデータでは、コラゲナーゼ消化処置により、細胞培養の成功率と細胞増殖が大幅に改善されることが示されています。

コラゲナーゼ消化後、組織を室温で130 ×gにて3分間遠心分離し、ピペットで上清画分を除去します。次に、ペレットを20 mLのDMEMに再懸濁して洗浄します。前述の手順でチューブを遠心分離し、その後、上清を除去してペレットを12 mLの増殖培地に再懸濁します。

次に、懸濁液を500 µLずつ24ウェルプレートの各ウェルに静かに分注します。内胚葉外植片を37 °C、5% CO2条件下で2日間インキュベートします。この期間に、組織から細胞が増殖して広がることが期待されます。

次に、細胞をさらに2日間インキュベートします。その後、細胞生存率アッセイを行い、プレートリーダーを用いて結果を可視化します。続いて、RT-qPCRを実施してEECにおける標的マーカーの発現レベルを評価し、テキストプロトコルに記載されている通り、ゲル電気泳動によってRT-qPCRの産物サイズを確認します。

これらのグラフに示され、対応のあるt検定によって判定されたように、未処理の外植片と比較して、コラゲナーゼで部分消化した外植片では細胞増殖が有意に増加しており、本培養システムの有効性が実証されました。他の酵素の影響を評価するため、コラゲナーゼとディスパーゼで処理した組織、およびコラゲナーゼのみで処理した組織について細胞生存率アッセイを実施しました。培養開始後の5日間において、細胞増殖は両方の条件で同様でした。

しかしながら、6日目から9日目にかけては、コラゲナーゼ処理したEECのみが安定して増殖したため、この酵素による部分消化が成長を促進し、優先的に使用されるべきであることが示唆された。培養したEECを可視化したところ、ここで示すように、大きな円形の脂質滴という脂肪細胞のような特徴が認められた。また、これらの細胞は、通常脂肪細胞の同定に用いられるOil Red O染色においても陽性であった。

これらの形態学的データを裏付けるように、リアルタイム定量PCRにより、培養されたEECは、コレステロールからコレステロールエステルを合成するタンパク質であるSOAT1を高レベルで発現していることが明らかになりました。このことは、培養EECが脂肪細胞としての正しい生理学的特性を備えていることをさらに示唆しています。重要な点として、サイクリックアデノシンモノリン酸（cAMP）レベルを上昇させる因子であるIBMXおよびフォルスコリンにEECを曝露させ、24時間培養したところ、いずれの処理においてもSOAT1の発現が促進されました。この結果は、YSMにおけるSOAT1の調節および脂質利用の可能なメカニズムを示唆しています。

この手法を習得すれば、約4時間で完了することができ、その間に少なくとも3つのサンプルを回収することが可能です。本手順に続き、SOAT1などの手法やその他の酵素活性測定、および同様の視覚的確認を行うことができます。このようなアッセイは、特定のタンパク質やマクロ栄養素が胚発生の後期段階にどのように関与しているかなど、さらなる疑問を解明するのに役立ちます。

本手法の開発により、鳥類胚モデルにおける栄養素の利用および輸送の潜在的なメカニズムを探索することが可能となり、胚の栄養利用分野の研究者に道が開かれました。このビデオを視聴することで、鳥類胚から内胚葉組織を採取する方法を習得し、さらに鳥類モデルを用いた胚の栄養輸送および利用の研究に向けたEECの培養方法を理解することができます。