Name: 蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ、蛍光顕微鏡を用いてKinesin-1の貨物を同定する方法。HeLa細胞でモーターレスKIF5B変異体を用い、c-MYCやp53などの貨物を可視化する技術です。分子モーター研究に応用可能です。

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Rocheの出版助成金は、この記事のフリーアクセスの出版と制作をカバーしました。著者はまた、原稿の支援と批判的な読み方に対して、E.プレムクマール・レディ、リチャード・V・メットス、スティーブン・C・コゼンツァ、サウ・イン・イップ、ソル・D・グロリアに感謝します。

tdTomatoタグ付き野生型とモータレスKIF5Bタンパク質の1クローニング<ol><li> 表1のプライマーを用いてヒト野生型とモータレスKIF5Bタンパク質のためのcDNAを増幅し、Taq DNAポリメラーゼ（100μlの5単位）、dNTPミックス（各デオキシヌクレオチド2ミリモル）および30サイクルの10×緩衝液。各サイクルは、変性工程（30秒間、95℃）、アニーリングステップ（30秒45°C）と伸長工程（3分間72°C）からなります。 </li><li>等量のフェノール/クロロホルムを用いて増幅されたDNA産物を抽出し（1：1）。 注：フェノールは可燃性で火傷を引き起こす可能性があります。クロロホルムは危険です。彼らとの直接接触を避け、化学ヒュームフードの下でそれらを使用しています。あるいは、PCR産物は、種々のキットによって精製することができます。 <ol><li> 1分間室温で微量で18,000×gでスピン。新しいチューブに水溶液に移し、等量のクロロホルムで抽出します。 </li><li>スピン0.5分間、室温で微量で18,000×gで。新しいチューブに水溶液を移します。 </li><li> 3 M酢酸Na、無水エタノールの2容積の10分の1の体積の水溶液を混ぜます。 </li><li>室温で5分間微量で18,000×gでスピン。水溶液を捨てます。 </li><li> 75％エタノールの2つのボリュームでDNAペレットを洗浄します。 5分間室温でDNAペレットを乾燥させた水溶液と空気を捨てます。 34μlの水でDNAペレットを再懸濁します。 </li></ol></li><li>制限酵素SalIを（10単位）とBamHI（10単位）と2時間37℃でその10×緩衝液4μlの40μlの最終容量で増幅産物を消化します。臭化エチジウム（0.2μgの/ ml）を含むアガロースゲル（100 Vで1.0％）で消化された製品を解決します。 注：エチジウムブロマイドは、強力な突然変異誘発物質であり、皮膚を介して吸収することができます。したがって、W直接的または間接的な接触を避けることが重要ですi番目の臭化エチジウム。 </li><li>カラムによる精製のための正しいバンドを切り出します。 DNA断片を含むアガロースゲルを秤量します。その後、約20分間37℃で可溶化緩衝液（0.1グラム、300μL）でそれを溶解します。 </li><li> 5秒間、室温で微量の列とスピンに得られた溶液を追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>ステップ1.5を繰り返して、0.5ミリリットルの可溶化緩衝液でカラムを洗浄します。ステップ1.5を繰り返して、0.75ミリリットル洗浄緩衝液で再びカラムを洗浄。残りの洗浄緩衝液を取り除くために2分間の列をスピン。 </li><li>ステップ1.5を繰り返して、50μlの水を有するDNA断片を溶出します。臭化エチジウム（0.2μgの/ ml）を含むアガロースゲル（100 Vで1.0％）でDNAサイズラダーに対してそれのアリコートを実行して、DNA断片の濃度を推定します。 </li><li>以前番目で消化ptdTomato-C1ベクター17（約100 ngの）で精製品（約100 ngのを）連結E同じ制限を16時間室温でT4 DNAリガーゼ（2,000単位）および1μlの10×ライゲーション緩衝液を用いて、10μlの酵素。 注：野生型およびモータレス変異体は、それぞれ、2 963から963と584のアミノ酸が含まれています。以前は、より大きなモータレスKIF5B変異体は、その機能9を同定するために使用しました。より小さいモータレスKIF5B変異体は、その発現レベルを増加させるために、本研究に使用しました。 </li></ol> 2.免疫蛍光顕微鏡<ol><li>生細胞または、又は40X以下の倍率との間接蛍光イメージング、1mlの完全培地中に0.2〜0.3百万HeLa細胞を播種の各ウェルの[ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清（DMEM）（FBS）] 6ウェルプレート。 5％CO 2で37℃で成長します。 </li><li>空気乾燥それらの中に、短時間無水エタノールに、40倍以上の倍率との間接免疫蛍光研究のために、（1.5厚さのx 18ミリメートル18ミリメートル）カバーガラスを洗います安全キャビネット内部の6ウェルプレートのウェルは、汚染を回避します。 <ol><li> 1種0.2〜0.3百万個の細胞を6ウェルプレートの各ウェルにDMEM培地を完了mLです。 </li></ol></li><li>トランスフェクション複合体の調製<ol><li>次の日は、バイオセーフティキャビネット内、貨物候補タンパク質のための発現プラスミドの存在下または非存在下でtdTomatoタグ付き野生型またはモータレスKIF5Bのための発現プラスミドの0.6μgの（合計）希薄（pTagCFP-C-MYC 5 ）1.6ミリリットルマイクロ遠心チューブで0.1ミリリットルトランスフェクション培地と。 注：ベクトルpTagCFP-C-MYCはTagCFPタグ付きのc-MYCを発現します。 </li><li>別の1.6ミリリットルのマイクロチューブに0.1ミリリットルトランスフェクション培地にトランスフェクション試薬の1.8μlを添加します。一般的に、12個のサンプルのための十分な希釈トランスフェクション試薬のマスターミックスを調製します。 </li><li>室温で、5分間インキュベートします。 </li><li>希釈した0.1ミリリットルのDNAに希釈した0.1ミリリットルトランスフェクション試薬を追加します。ミチューブを反転させて内容をxは。微量で5秒間チューブをスピン。 </li><li>室温で、45分間インキュベートします。 </li></ol></li><li>細胞の洗浄<ol><li>トランスフェクション複合体の形成のためのインキュベーション期間中に播種した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。 </li><li>各ウェル0.8ミリリットルと予め温めたトランスフェクション培地中で播種した細胞の培地を交換してください。 37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li></ol></li><li>細胞のトランスフェクション<ol><li> 45分のインキュベーションの後、（ステップ2.3で調製した）DNA /トランスフェクション試薬複合体0.2 mlを加え、プレートの各ウェルに滴下しました。 </li><li>彼らは、37℃のインキュベーターに戻される前に、5秒間穏やかに6ウェルプレートを揺らし。 </li><li> 6-8時間後、完全DMEM培地で培地を交換してください。 </li></ol></li><li>ライブセル蛍光イメージング18 <ol><li>インキュベーションaの追加の16時間後トン37°Cは、1μMの最終濃度になるように培地にDNA挿入染色ヘキスト33342を追加します。 注：ヘキスト33342は、細胞核を染色する細胞透過性、DNAインターカレート色素です。 </li><li> 40倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡によって蛍光タンパク質の発現のためにそれらを検査する前に、37℃のインキュベーター中で10分間トランスフェクトされた細胞を培養します。 DAPI、CFP、FITCおよびCy3用のフィルターセットはそれぞれ、（Ex350 nmの/ Em460のnm）を、（Ex436 nmの/ Em480のnm）を、（Ex470 nmの/ Em525のnm）を（Ex545 nmの/ Em605のnm）です。 注：バックグラウンドが原因で完全DMEM培地の自己蛍光に高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用しています。 </li></ol></li></ol>間接免疫学3. <ol><li>パラホルムアルデヒド溶液の調製<ol><li>パラホルムアルデヒド粉末（100ミリリットルPBSあたり4グラム）を計量し、PBSに追加します。 注：パラホルムアルデヒドは、可燃性固体と潜在的な癌ハザルですD。それは、目、呼吸器系および皮膚を刺激します。したがって、との接触またはパラホルムアルデヒドの吸入を避けることが重要です。 </li><li>溶液（150μlの10 NのNaOH / 100ミリリットル）に水酸化ナトリウムを追加します。 </li><li>時折振とうしながら2〜3時間、37〜42℃で溶液を保管してください。 </li><li>パラホルムアルデヒド粉末を溶解させた後に溶液（約75マイクロリットル/ 100ミリリットル）に氷酢酸を加えることによって、pHを7.0に調整します。 </li></ol></li><li>ターゲットタンパク質染色<ol><li> 37℃で16時間さらにインキュベートした後、5秒間6ウェルプレートを旋回することによりPBSで一度室温でトランスフェクトされた細胞を洗浄します。 </li><li>ウェルあたり新たに調製し、4％パラホルムアルデヒド溶液1mlで細胞を固定してください。室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 5秒間6ウェルプレートを旋回させることにより、一度PBSで細胞を洗浄。ソリューションを捨てます。 </li><li> 30分間室温にて（PBS中）0.1％トリトンX-100の1mlで細胞をインキュベートします。 DETトリトンX-100は、それらの細胞内標的への抗体のアクセスを可能にするために、細胞膜を透過しますergent。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回細胞を洗浄。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li><li> 4時間揺動することにより、室温でPBS溶液中で、10％FBS中で、（0.1 / mlのC-MYCのウサギ抗体またはp53マウス抗体）一次抗体の1ミリリットルで細胞をインキュベートします。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回洗浄します。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li><li> 2時間揺動することによって暗所で室温でPBS中10％FBS中で、蛍光色素結合二次抗体（0.5 / mlのアレクサフルオロ488結合抗ウサギまたは抗マウスIgG抗体）1mlでインキュベートします。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回洗浄します。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li></ol></li><li>核染色および取り付け<ol><l10分間、暗所で、室温でPBS中、（0.5 / mlのDAPI）i&gt;はDNA挿入色素4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを1mlで細胞をインキュベートします。何のカバーガラスが使用されていない場合3.4に進みます。 注：DAPIは細胞核を染色するDNAインターカレート色素です。 </li><li>各顕微鏡スライド上にマウント溶液10μlを適用します。顕微鏡スライド上にマウントソリューションの上に、各カバーガラスをマウントします。 </li><li>暗所で一晩中、室温でインキュベートします。 </li><li>マニキュアでカバーガラスの端をシールします。一晩マニキュア煙を除去するために、ヒュームフード内部の暗所に置きます。 </li></ol></li><li>蛍光顕微鏡19 <ol><li>翌日、40倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡によって細胞を調べます。 DAPI、CFP、FITCおよびCy3用のフィルターセットはそれぞれ、（Ex350 nmの/ Em460のnm）を、（Ex436 nmの/ Em480のnm）を、（Ex470 nmの/ Em525のnm）を（Ex545 nmの/ Em605のnm）です。 </li></ol></li></ol>

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記載の方法は、微小管に沿って移動する能力を欠くモータレスKIF5B変異体の特性を利用するが、野生型KIF5Bと二量体を形成し、それによって、四量体タンパク質は、同一の積荷タンパク質と相互作用することを可能にする能力を保持します野生型KIF5Bなど。モータレスKIF5Bは、したがって、その貨物に集約しmislocalizedドミナントネガティブ変異体やフォームとして機能します。この方法は、キネシン-1貨物のc-myc（ 図1）5 を識別するために実証されています。この記事では、同一のモータレスKIF5B変異体は、キネシン-1の別の潜在的なカーゴ（ 図2）としてのp53を同定しました。これは、方法は、キネシン-1の他の貨物を識別することが可能であることを示しています。さらに、変異体の特異性は、陰性対照タンパク質のc-Fosの（ 図3）上の変異の効果の欠如によって提供されます。 このプロトコルでは、tdTomatoタグ付き野生TYPEまたはモータレスKIF5Bタンパク質は、他の蛍光タンパク質タグ付き候補貨物のタンパク質と同時発現されます。この場合、生細胞の蛍光顕微鏡および画像化が行われます。凝集体の形成は、タイムラプスイメージングにより追跡することができます。あるいは、tdTomatoタグ付きタンパク質を単独で発現され、その生理学的なレベルで、候補貨物タンパク質は特異的抗体を用いた間接免疫蛍光顕微鏡法によって可視化されます。蛍光タンパク質tdTomatoは、その明るさと光安定17のために選択されます。背景は完全DMEM培地の自己蛍光に起因する高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用します。 モータレスKIF5B変異体は、化学量論的に野生型KIF5Bと二量体を形成します。したがって、その機能を阻害するために、野生型対応物との二量体を形成し、凝集体を形成するモータレスKIF5B変異体の十分な量を発現することが重要です。 、exprの最適化をこの問題に対処するために、モータレス変異体のessionが不可欠です。これは、二量体化ドメインを含む小さなモータレス変異体を使用することによって達成されます。さらに、適切なトランスフェクション試薬とプロトコルの最適化も必要です。 DNA /トランスフェクション試薬でHeLa細胞のインキュベーションの持続時間は、外因性タンパク質の発現および細胞生存率を、HeLa細胞中で最適化しました。インキュベーション期間は、他の細胞株のために最適化されなければなりません。 40Xへ4X間の倍率については、何のカバーガラスは必要ありません。細胞を直接ウェルに調べることができます。したがって、この場合には、プロトコルは、安価で便利です。 40X上記倍率のために、細胞を染色した後、油浸対物レンズ下の検査のために顕微鏡スライド上にマウントされ、ウェル中のカバーガラス上で増殖させています。 モータレスKIF5Bタンパク質の凝集の観察は、細胞質のサイズによって制限されます。検出が容易です多くの哺乳動物細胞中での集合体。しかし、細胞質の容積が核周囲および神経突起における小さい場合に神経細胞内凝集体を観察することは比較的困難です。 プロトコルは 、インビボ酵母ツーハイブリッドおよび生化学的プルダウンアッセイ13-16に加えKIF5Bと貨物との間の関連を示すために使用されます。すべてのこれらのアッセイは、異なる物理的条件下での関連性を決定し、それらの結果は、お互いを補完することができます。また、他のアッセイに対するこの蛍光アッセイの利点は、KIF5Bによって貨物の細胞内局在化（ 図1及び2）の調節を示すことができることです。 プロトコルは、KIF5Bに限定されるものではなく、そのような他のいくつかのキネシンモーター3と貨物3の細胞内輸送に使用されるミオシンモーター23,24の一部として、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。これらのモータータンパク質はまた、オリゴマー化のためのキネシンモーターとミオシンモーター用マイクロフィラメント、およびコイルドコイルセグメントのための微小管に沿って移動用モータドメインを含みます。それらのほとんどは、ホモ二量体3,23を形成します 。したがって、同様の戦略は、その貨物を識別するために、それらのモータレスドミナントネガティブ変異体を作成することによって、それらを適用することができます。

キネシン-1は、その貨物1,2の順行性輸送を媒介するモータータンパク質です。これは、キネシン軽鎖1（KLC1）とキネシン重鎖の2つのサブユニット（KHCs）の二つのサブユニットのヘテロ四量体です。 KIF5B 1、KHCは、そのN末端 ​​、ATPを加水分解し、微小管に沿った移動のための機械的エネルギーに化学エネルギーに変換するにモータードメインが含まれています。そのC末端領域は、貨物と関連付けるKLC1、と相互作用する二量体化ドメインが含まれています。キネシン-1は、小胞、細胞小器官およびmRNAを3,4として貨物を輸送します。最近、KIF5Bは細胞質5プロテオソーム分解の核転写因子のc-MYCを輸送することが示されました。三つの方法（化学的阻害剤は、siRNA / shRNAのドミナントネガティブ変異体）は、キネシン-1機能を阻害するために使用されました。彼らはすべての細胞質中でのc-MYCの凝集を誘導しました。最後の方法論では、c-MYCのみが支配的negatの影響を受けましたアイブKIF5Bの変異体ではなく、別の関連KIF5Aモータータンパク質のそれによって、変異体は、（微小管破壊など）の細胞内成分上またはタンパク質凝集の一般的な影響を及ぼさないことを示唆しています。 KIF5Bのドミナントネガティブ変異体はまた、転写因子の一般的な効果を発揮しないことを示唆している、他の転写因子に影響を及ぼしませんでした。むしろ、それは、ドミナントネガティブ変異体は、その貨物の特定の効果を発揮することを示唆しています。 ドミナントネガティブ変異体の使用は、モータータンパク質の分野では一般的です。キネシンとミオシンの類似モータレス変異体は、以前に使用されました。これらは主に貨物の細胞内局在にまたは6-12細胞機能の変異体の効果を実証するために使用されました。あまり重点が変異体およびそれらによって影響を受けた貨物の間の空間的関係に置かれました。しかし、いくつかの発生率では、変異体は、そのCAと共局在することが観察されましたrgos 6,10。 KIF5Bおよびその関連タンパク質との間の相互作用は、以前のインビボ酵母ツーハイブリッドアッセイなどの共免疫沈降およびインビトロプルダウンアッセイ13-16 における生化学的プルダウンアッセイにより確認されました。この記事では、蛍光顕微鏡を使用して追加の視覚的方法は、KIF5B貨物タンパク質を同定するために記載されています。この方法は、ドミナントネガティブ変異体として機能するモータレスKIF5B変異体を使用しています。これは、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。 17 tdTomato蛍光タンパク質と野生型およびモータレスKIF5B変異体のタグ付けは、蛍光顕微鏡によって、その可視化を可能にします。タグ付けされたKIF5Bタンパク質は、適切にKIF5Bタグから分離されたスペクトル特性を有する異なる蛍光タンパク質に融合された候補タンパク質と共発現させることができます。タグ付けされたタンパク質は、生きた細胞内で直接観察されます蛍光顕微鏡下で。モータレスKIF5B変異によって候補タンパク質の凝集の誘導は、候補タンパク質がKIF5B の in vivoでの貨物であることを確認します。また、tdTomatoタグKIF5Bタンパク質は、内因性の積荷タンパク質に対するそれらの効果を研究するために細胞内で単独で発現させることができます。その後、免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素と結合し、適切な二次抗体、続いて、トランスフェクトした細胞を固定し、内因性候補タンパク質に対して特異的な抗体で染色された中で行われます。この場合には、その生理的なレベルで内因性の候補タンパク質が検討されています。他のモータータンパク質の類似モータレス変異体は、その貨物を識別するために調製することができます。

<table><tbody><tr><td>無水エタノール (200プルーフ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト 33342</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (トランスフェクションメディウム)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>51985</td><td></td></tr><tr><td>プロロングダイヤモンド退色防止封入剤</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ P36961</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、パラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA トランスフェクション試薬</td><td>ロシュ</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR グレードヌクレオチドミックス (dNTP ミックス)</td><td>ロシュ</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp;</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC ウサギ抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 マウス抗体</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフロー 488-標識抗ウサギIgG抗体</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488標識抗マウスIgG抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパスのIX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イメージング用コンピュータソフトウェア</td><td>&nbsp;セルセンサ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡法は、キネシン-1カーゴを識別するために採用されています。最近、キネシン-1(KIF5B)の重鎖が核転写因子c-MYCを輸送し、細胞質内でのプロテオソーム分解を行うことが示されました。ここで説明する方法は、蛍光顕微鏡法のためのモーターレスKIF5B変異体の研究を含む。野生型でモーターレスのKIF5Bタンパク質には、蛍光タンパク質tdTomatoがタグ付けされています。野生型のtdTomato-KIF5Bは細胞質に均一に現れますが、モーターのないtdTomato-KIF5B変異体は細胞質内に凝集体を形成します。モーターレスKIF5B変異体の凝集は、細胞質内のそのカーゴc-MYCの凝集を誘導します。したがって、この方法は、キネシン-1の貨物を識別するための視覚的な手段を提供します。同様の戦略を利用して、他のモータータンパク質のカーゴを同定することができます。

外因的には、c-MYCは、核（図1A）に主に現れ、一方、野生型KIF5Bは、細胞質中に均一に見えた発現しました。しかし、モータレスKIF5B変異体は、細胞質（図1A）で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの集約は、c-MYCの凝集を誘導しました。野生型KIF5Bを発現する細胞内で凝集TagCFPタグのc-MYCを発現する細胞の割合は低かったです。しかし、モータレスKIF5Bが（図1A）を共発現させたときに有意に高かったです。 C-MYCと変異KIF5Bの観察された共局在（図1）は、KIF5Bをc-MYCの細胞内局在を調節およびc-MYCのキネシン-1の貨物であることを示唆しています。構築物は、単独で発現された負の対照は、図1Aの下のパネルに含まれています。結果は、蛍光emissioの有意なブリードスルーがなかったことを示しn個。モータレスKIF5Bはまた、内因性のc-MYC（図1B）および転写因子p53の（ 図2）の凝集を誘導したことを示します c-MYCおよびp53の両方キネシン1の貨物であり、KIF5Bは、両方の内因性タンパク質の細胞内局在を調節します。一緒にキネシン-1阻害剤は、C-MYCおよびp53 5の両方のために高分子量種のベンガルラクトン（RBL）20誘発形成を上昇した結果と、p53はおそらくキネシン1の貨物です。 c-MYCのような核内転 ​​写因子であるp53は、また、プロテアソーム分解21,22のための核から細胞質へ輸出されることに注意することは興味深いことです。 KIF5Bによる転写因子の動きがモータレスKIF5B変異体の発現は、細胞内局在のc-Fosのに影響を与えるか、それが（ 図3）を集約することはありませんでしたので、特異的であるように思われる。上記のデータは、メトことを実証しています本書に使用さdはキネシン1貨物の高特異性の同定を可能にします。同様の戦略は、他のモータータンパク質にも適用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> 図1：モータレスKIF5B変異体の発現は、細胞質におけるc-MYCの凝集を誘導する （A）HeLa細胞をtdTomatoタグ化野生型（WT）KIF5B（赤）及びTagCFPタグC-MYC（青）でトランスフェクトしました。 TagCFPタグ付きのc-MYCは核で主に登場しながらtdTomatoタグ付きWT KIF5Bは、細胞質に主に登場しました。しかし、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質中の糸状または点状凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、c-MYCの凝集を誘導しました。変異KIF5Bおよびc-MYCが一緒に共局在（ピンク）。 CFP-C-MYC（％）の凝集を示す細胞（％）の割合が示されています。結果は以下のように示されています平均±SD（N = 3）。 tdTomatoタグ付きKIF5Bタンパク質または空のベクター（V）と一緒にTagCFPタグ付きのc-MYCの発現を有するネガティブコントロールは、下のパネルに示されています。 （B）同様の結果がtdTomatoタグ付きWTまたはモータレスKIF5Bタンパク質（赤）を発現させた内因性のc-MYC（緑）で得られました。 tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体は、細胞質内で凝集体を形成し、内因性のc-MYCの凝集を誘導しました。細胞質（オレンジ色）で一緒に共局在凝集体の両方の種類。核染料ヘキスト33342、またはDAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> 図2：モータレスKIF5B変異体の発現は、トンで、内因性のp53の凝集を誘発します彼は、HeLa細胞では細胞質、外因性tdTomatoタグ付き野生型（WT）KIF5B（赤）、内因性のp53（緑）は、主に核内に登場している間、細胞質で主に登場。これとは対照的に、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質内で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、細胞質（黄色）でKIF5Bの共局在とp53で、その結果、p53の凝集を誘導しました。実験は3回行いました。核色素DAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> 図3：モータレスKIF5B変異体の発現は細胞質中でのc-Fosのの凝集を誘導しない tdTomatoタグ付き野生型（WT）KIF5B（赤）が登場しました主に、HeLa細胞の細胞質に、EGFP-C-Fosの（緑色）、一方、核に主に現れました。逆に、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質内で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、c-Fosのの凝集を誘導しませんでした。実験は4回行いました。細胞の核を染色DAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>共通のリバースプライマー</td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td>野生型KIF5Bフォワードプライマー</td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td>モータレスKIF5Bフォワードプライマー</td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>表1：野生型およびモータレスKIF5Bタンパク質をクローニングするためのプライマー配列。

ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

この方法論の全体的な目標は、蛍光顕微鏡を使用してキネシン-1カーゴを同定することです。この方法は、キネシンとミオシンによって運ばれている貨物など、分子モーターの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、優性ネガティブなKIF5B変異体が、蛍光顕微鏡を用いてこのカーゴを視覚的に同定するのに役立つことです。まず、40倍以下での生細胞または間接蛍光イメージングの場合、6ウェルプレートの各ウェルで1ミリリットルの完全培地に0.2〜30万個のHeLa細胞を供給します。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で成長させます。40倍以上の倍率で間接免疫蛍光染色を行う場合は、汚染を避けるためにバイオセーフティキャビネットで無水アルコールを使用してカバーグラスを洗浄し、6ウェルプレートのウェルに立てて風乾します。カバースリップが乾いたら、ウェルに寝かせ、プレートの各ウェルに1ミリリットルの完全DMEMに0.2〜30万個の細胞を播種します。細胞を一晩培養します。翌日、バイオセーフティキャビネット内で、0.1ミリリットルのトランスフェクション培地を使用して、候補カーゴタンパク質を発現するプラスミドの有無にかかわらず、tdTomatoタグ付き野生型またはモーターレスKIF5B発現プラスミドの0.6マイクログラムを希釈します。別の1.6ミリリットルの微量遠心チューブに、0.1ミリリットルのトランスフェクション培地に1.8マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。その後、室温で5分間インキュベートします。次に、希釈したDNAサンプルに0.1ミリリットルの希釈トランスフェクション試薬を加えます。チューブを反転させて内容物を混ぜ合わせ、5秒間スピンダウンします。次に、サンプルを室温で45分間インキュベートします。トランスフェクション複合体の形成のためのインキュベーション期間中に、PBSを使用して細胞を3回洗浄します。次に、0.8ミリリットルの予熱済みトランスフェクション培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。希釈したトランスフェクション試薬を45分間インキュベートした後、プレートの各ウェルに0.2ミリリットルの溶液を滴下します。6ウェルプレートを5秒間静かに揺さぶり、摂氏37度のインキュベーターに6〜8時間戻します。次に、完全なDMEMを使用してメディアを交換します。さらに16時間のインキュベーション後にライブセルイメージングを行うには、DNAインターカレート染色剤Hoechst 33342を培地に最終濃度1マイクロモルまで加え、細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、40倍対物レンズを使用して、細胞の蛍光タンパク質の発現を調べます。トランスフェクション試薬でインキュベートした細胞に対して間接免疫蛍光染色を行うには:テキストプロトコルに従ってパラホルムアルデヒドを調製した後、室温PBSを使用して、6ウェルプレートを5秒間渦巻いて細胞を洗浄します。ウェルごとに新たに調製した4%パラホルムアルデヒドとPBSを1ミリリットル加え、室温で30分間インキュベートします。次に、PBSを使用してプレートを回転させて細胞を一度洗浄し、溶液を廃棄します。次に、PBS中の0.1%Triton-X 100を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートして細胞を透過化します。次に、PBSを使用して細胞を4回洗浄し、各洗浄後に溶液を廃棄します。一次抗体を添加し、室温で4時間揺さぶりながら細胞をインキュベートします。インキュベーション後、PBSを使用してプレートを回転させて細胞を4回洗浄します。次に、1ミリリットルの蛍光色素標識二次抗体を添加し、室温で暗所で2時間揺さぶってインキュベートします。PBSで細胞を4回洗浄した後、DAPI1ミリリットルを加え、室温で10分間暗所でインキュベートします。サンプルにカバーガラスを使用する場合は、顕微鏡スライドの中央に10マイクロリットルの埋込液を塗布し、その上にカバーガラスを埋込液に取り付けます。その後、暗闇の中で室温で一晩インキュベートします。翌日、マニキュアを使用して端をシールし、暗闇の中でヒュームフードで一晩インキュベートします。蛍光顕微鏡法を実施するには、40倍対物レンズとDAPI、CFP、FITC、およびCy3用のフィルターセット(該当する場合)を使用します。ここで示したように、外因的に発現した野生型KIFBは細胞質に均一に発現し、c-MYCは主に核に発現しました。しかし、モーターのないKIF5B変異体は細胞質に凝集体を形成し、これがc-MYCの凝集につながった。さらに、モーターレスKIF5Bは、内因性c-MYCと転写因子p53の凝集も誘導し、c-MYCとp53の両方がキネシン-1のカーゴであり、KIF5Bが両方の内因性タンパク質の細胞内局在を制御していることを示しました。この図は、モーターレスKIF5B変異体の発現がc-Fosの細胞内局在に影響を与えたり、凝集を引き起こしたりしなかったため、KIF5Bによる転写因子の移動が特異的であるように見えることを示しています。これらのデータから、このビデオで紹介した方法により、キネシン-1カーゴの高い特異性同定が可能になることがわかります。この手順を試みる際には、キネシンが細胞質内の凝集を容易に観察できるように、大量の細胞質を持つ細胞に最も適していることを覚えておくことが重要です。この開発後、この技術は、分子モーターの分野の研究者が、他のキネシンやミオシンの同様の優性ネガティブ変異体を構築して、それらの特定のカーゴを特定するための道を開きました。このビデオを見た後、蛍光顕微鏡を使用して、分子モーターの支配的な負の変異体を使用してこの貨物を特定する方法をよく理解しているはずです。フェノ、臭化エチジウム、パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、それらと直接皮膚に接触しないように常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験がうまくいくことを願っています。

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