蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

この方法論の全体的な目標は、蛍光顕微鏡を使用してキネシン-1カーゴを同定することです。この方法は、キネシンとミオシンによって運ばれている貨物など、分子モーターの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、優性ネガティブなKIF5B変異体が、蛍光顕微鏡を用いてこのカーゴを視覚的に同定するのに役立つことです。

まず、40倍以下での生細胞または間接蛍光イメージングの場合、6ウェルプレートの各ウェルで1ミリリットルの完全培地に0.2〜30万個のHeLa細胞を供給します。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で成長させます。40倍以上の倍率で間接免疫蛍光染色を行う場合は、汚染を避けるためにバイオセーフティキャビネットで無水アルコールを使用してカバーグラスを洗浄し、6ウェルプレートのウェルに立てて風乾します。

カバースリップが乾いたら、ウェルに寝かせ、プレートの各ウェルに1ミリリットルの完全DMEMに0.2〜30万個の細胞を播種します。細胞を一晩培養します。翌日、バイオセーフティキャビネット内で、0.1ミリリットルのトランスフェクション培地を使用して、候補カーゴタンパク質を発現するプラスミドの有無にかかわらず、tdTomatoタグ付き野生型またはモーターレスKIF5B発現プラスミドの0.6マイクログラムを希釈します。

別の1.6ミリリットルの微量遠心チューブに、0.1ミリリットルのトランスフェクション培地に1.8マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。その後、室温で5分間インキュベートします。次に、希釈したDNAサンプルに0.1ミリリットルの希釈トランスフェクション試薬を加えます。

チューブを反転させて内容物を混ぜ合わせ、5秒間スピンダウンします。次に、サンプルを室温で45分間インキュベートします。トランスフェクション複合体の形成のためのインキュベーション期間中に、PBSを使用して細胞を3回洗浄します。

次に、0.8ミリリットルの予熱済みトランスフェクション培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。希釈したトランスフェクション試薬を45分間インキュベートした後、プレートの各ウェルに0.2ミリリットルの溶液を滴下します。6ウェルプレートを5秒間静かに揺さぶり、摂氏37度のインキュベーターに6〜8時間戻します。

次に、完全なDMEMを使用してメディアを交換します。さらに16時間のインキュベーション後にライブセルイメージングを行うには、DNAインターカレート染色剤Hoechst 33342を培地に最終濃度1マイクロモルまで加え、細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、40倍対物レンズを使用して、細胞の蛍光タンパク質の発現を調べます。

トランスフェクション試薬でインキュベートした細胞に対して間接免疫蛍光染色を行うには:テキストプロトコルに従ってパラホルムアルデヒドを調製した後、室温PBSを使用して、6ウェルプレートを5秒間渦巻いて細胞を洗浄します。ウェルごとに新たに調製した4%パラホルムアルデヒドとPBSを1ミリリットル加え、室温で30分間インキュベートします。次に、PBSを使用してプレートを回転させて細胞を一度洗浄し、溶液を廃棄します。

次に、PBS中の0.1%Triton-X 100を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートして細胞を透過化します。次に、PBSを使用して細胞を4回洗浄し、各洗浄後に溶液を廃棄します。一次抗体を添加し、室温で4時間揺さぶりながら細胞をインキュベートします。

インキュベーション後、PBSを使用してプレートを回転させて細胞を4回洗浄します。次に、1ミリリットルの蛍光色素標識二次抗体を添加し、室温で暗所で2時間揺さぶってインキュベートします。PBSで細胞を4回洗浄した後、DAPI1ミリリットルを加え、室温で10分間暗所でインキュベートします。

サンプルにカバーガラスを使用する場合は、顕微鏡スライドの中央に10マイクロリットルの埋込液を塗布し、その上にカバーガラスを埋込液に取り付けます。その後、暗闇の中で室温で一晩インキュベートします。翌日、マニキュアを使用して端をシールし、暗闇の中でヒュームフードで一晩インキュベートします。

蛍光顕微鏡法を実施するには、40倍対物レンズとDAPI、CFP、FITC、およびCy3用のフィルターセット(該当する場合)を使用します。ここで示したように、外因的に発現した野生型KIFBは細胞質に均一に発現し、c-MYCは主に核に発現しました。しかし、モーターのないKIF5B変異体は細胞質に凝集体を形成し、これがc-MYCの凝集につながった。

さらに、モーターレスKIF5Bは、内因性c-MYCと転写因子p53の凝集も誘導し、c-MYCとp53の両方がキネシン-1のカーゴであり、KIF5Bが両方の内因性タンパク質の細胞内局在を制御していることを示しました。この図は、モーターレスKIF5B変異体の発現がc-Fosの細胞内局在に影響を与えたり、凝集を引き起こしたりしなかったため、KIF5Bによる転写因子の移動が特異的であるように見えることを示しています。これらのデータから、このビデオで紹介した方法により、キネシン-1カーゴの高い特異性同定が可能になることがわかります。

この手順を試みる際には、キネシンが細胞質内の凝集を容易に観察できるように、大量の細胞質を持つ細胞に最も適していることを覚えておくことが重要です。この開発後、この技術は、分子モーターの分野の研究者が、他のキネシンやミオシンの同様の優性ネガティブ変異体を構築して、それらの特定のカーゴを特定するための道を開きました。このビデオを見た後、蛍光顕微鏡を使用して、分子モーターの支配的な負の変異体を使用してこの貨物を特定する方法をよく理解しているはずです。

フェノ、臭化エチジウム、パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、それらと直接皮膚に接触しないように常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験がうまくいくことを願っています。