Name: 近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 学ぶ近赤外Photoimmunotherapy法による混合3D培養からの標的細胞選択的除去法。組織工学における周辺細胞への損傷を最小限に抑え、再生医療への応用可能性を示す革新的技術です。

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この研究は、米国立衛生研究所、国立癌研究所、癌研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました。

注：以下のプロトコルは、NIR-PITを使用して、特定の細胞を排除するために必要な手順を説明します。コントロールとNIR-PITと細胞生存率に関するその他の詳細は、別の場所で18見つけることができます。 モノクローナル抗体にIR700の1コンジュゲートモノクローナル抗体（mAb） <ol><li> 0.1 MのNa 2 HPO 4（pHは8.6）溶液中の2-5 mg / mlとに関心のmAbを準備します。 </li><li>マイクロ遠心チューブ中の0.1MのNa 2 HPO 4溶液（pHは8.6）中の10mM IR700の30.8ナノモルとmAbの6.8ナノモルを混合し、アルミ箔で覆われて1時間、室温でインキュベートします。 </li><li>二回、15ミリリットルのPBSでPD-10カラム（材料/機器の表を参照）を洗浄します。ステップ1.2からサンプルをロードします。 </li><li>製造業者の指示に従ってPBS溶出により、PD-10カラムを介して混合物を精製します。 注：ここでは、溶出はIR700のバンド色に沿っていました。 300μlのサンプルについて、PBS溶出画分4.4 mlを典型的には2.5〜mlです。 </li><li>決定します分光光度計9で595nmの吸収を測定することによりクマシー染色でタンパク質濃度。各mAb分子9にコンジュゲート蛍光体分子の数を確認するために、689 nmでの吸収がIR700の濃度を決定します。 注：分光光度計で1モノクローナル抗体でIR700分子の最適なコンジュゲーション数を決定することが重要です。一般的に、1抗体分子中の3 IR700分子の周りには、両方のin vitroおよびin vivoの仕事に最適です。 HPLCおよびSDS-PAGE法は、mAbおよびIR700が結合しているか否かを確認するために使用することができます。 </li><li>タンパク質濃度を決定した後、4℃で保管してください。 </li></ol>混合3D細胞培養（混合スフェロイド）の調製<ol><li>ドロッププレートをぶら下げのプレート貯留部に無菌水（約1 ml）を適用します。 </li><li> A431-LUC-GFP細胞および3T3-RFP細胞 - 様々な目的の細胞タイプの比率を準備 -各サンプルは合計5,000個の細胞を含有する培養培地50μlに懸濁しました。 注：培地中の目的の細胞タイプの割合は、細胞型に応じてその他 100、100、10：100、25：100、50 1を準備します。 </li><li> 37℃、5％二酸化炭素の加湿インキュベーター内で96ウェル懸滴プレートにおいて5~7日間ミックスをインキュベートします。 2日ごとに培地を変更します。注：正確な3Dスフェロイドを作る静かにプレートを処理するために、細胞を含有する液滴は、3D形状を形成する前に、簡単に落ちるように。 </li><li> 40X倍率 - 10Xで反転明視野顕微鏡を用いてスフェロイドの形態と大きさを観察します。注：それは細胞の種類やハンギングドロップの大きさに依存するが、回転楕円体の直径は96ウェル懸滴プレート中でのインキュベーションの7日後の周りの400から600ミクロンであることを確認してください。 </li></ol>混合3D細胞培養のためのインビトロ NIR-PIT 3. <ol><li>ヘクタールのメディアを変更10μg/ mlの抗体光吸収複合体（APC）を含む培地にドロッププレートnging、37℃、5％二酸化炭素の加湿インキュベーター内で6時間インキュベートします。 </li><li> 6時間のインキュベーション後、新鮮な培地（フェノールレッドを含まない）で2回回転楕円体を洗浄します。先端がカットオフで優しく滅菌200μlのピペットチップを使用して、100μlの新鮮なフェノールレッドを含まない培地でガラス底の50ミリメートル皿にスフェロイドを転送します。各皿に1回転楕円体を配置します。 </li><li>形態の変化を検出するために倒立明視野顕微鏡でスフェロイドを守ってください。光学レポーター（ 例えば、GFPおよびRFP）を観察するには、以下のフィルタ設定で蛍光顕微鏡を使用する：GFP - 469 nmの励起フィルター、および525 nmの発光フィルター; RFP - 559 nmの励起フィルター、および630nmの発光フィルター。 </li><li>照射用ガラスボトムディッシュの上に発光ダイオード（LED）を配置します。 注：スフェロイドは、NIRに露出させることができます顕微鏡上または層流フード内のいずれかの光。 <ol><li>光パワーメータ9でNIR光のパワー密度を測定します。この測定によれば、2 J / cm 2で670〜710ナノメートルの波長で光を放射する発光ダイオード（LED）を介して近赤外光を照射します。 注：LEDの光は、約5インチの最大の深さに浸透することができます。 NIR-PITの細胞傷害性効果は関係なく、電力密度と暴露23の期間だけ与えられたエネルギーに依存しています。 </li></ol></li><li>照射後、新鮮な培地の50μlの新た懸滴プレートに回転楕円体を移し、37℃、5％二酸化炭素の加湿インキュベーター中で1日間インキュベートします。 </li><li>優しくカットオフチップで滅菌200μlのピペットチップを使用して、新鮮な培地（フェノールレッドを含まない）の100μlでガラス底の皿にスフェロイドを転送します。 NIR-PIT fiを使って後の蛍光顕微鏡1日でスフェロイドを守ってLTERの設定は、ステップ3.3に記載します。 <ol><li> 、または蛍光顕微鏡（ 図2B）14,18,22 を用いて、細胞質GFP蛍光の消失によって2μg/ mlの最終濃度で培地にヨウ化プロピジウムを添加することによって、死細胞を検出します。 </li></ol></li><li>標的細胞が完全に除去されていない場合、繰り返し3.1~3.6手順。 </li></ol>

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<li>Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+photoimmunotherapy+assessed+by+18F-FDG+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET.</a> J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).</li>
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<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
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<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、NIR-PITを用いて、非標的細胞に損傷を与えることなく、混合三次元細胞培養物から特定の細胞除去の方法を示します。これまでのところ、実用的な細胞除去の方法組織が確立されるか、移植後はありません。したがって、NIR-PITは、これを達成するための有望な方法です。 APCはモノクローナル抗体自体と同様の薬物動態を示すので、この技術は、 インビボ 18,22 に利用することができます。標的細胞型は、種々のAPCで適合させることができます。 21 -抗EGFR、抗PSMA抗メソテリン、および抗CEAを含む様々な抗体または抗体フラグメントは、既にAPCを15としました。また、NIR照射領域を変更すると、処理された領域を最小限に抑えることができます。ここでは、標的細胞のルシフェラーゼ活性の定量化と蛍光と、特定の細胞の完全な消失を確認しました。 NIR-PITは、このように臨界点がtである、光ベースの治療法であります光エネルギーと逆二乗法則に従っ...

他の細胞に損傷を与えることなく、特定の細胞を除去することは、特に確立された組織に、非常に困難であり、組織工学の分野における細胞除去方法に対する緊急の必要性があります。 3 -最近再生医療の分野では、胚性幹細胞（ES）、多能性幹細胞（のPSC）、または誘導多能性幹細胞（IPS）を使用して、組織培養、材料1が期待されています。 この組織再生が有望であるが、望ましくない細胞による汚染が主要な関心事です。また、移植4,5後の腫瘍形成能の安全性の懸念があります。多くの研究は、これらの問題に焦点を当ててきたが、特に再生医療6で、特定の細胞を排除するために- 8、実用的な方法が開発されていません。 近赤外photoimmunotherapy（NIR-PIT）は、抗体の光吸収conjugatに基づく治療法ですE（APC）。 APCは、細胞特異的なモノクローナル抗体（mAb）と光吸収、IR700で構成されています。 IR700は、親水性シリカ、フタロシアニン誘導体であり、それ自体9によって光毒性を誘発しません。 IR700は、共有リジン分子の側鎖のアミド残基を介して抗体に結合されます。 APCは、細胞膜上の標的分子に結合し、その後、690 nmの近赤外光への曝露後にほぼ即時の細胞壊死を誘導します。 14 - NIR光への曝露の間に、細胞膜の破裂は、細胞死に9をリード。 21 - NIR-PITは、抗EGFR、抗HER2、抗PSMA、抗CD25、抗メソテリン、抗GPC3、および抗CEA 15を含む複数の抗体または抗体断片と効果的であることが証明されています。したがって、NIR-PITは、標的分子の広範囲に対して使用することができます。また、NIR-PITは、NIR-ガーゼを制限することによって、特定の領域の選択的処理を可能にする十分に制御された治療でありますトン照射18,22。 ここでは、混合3D培養物からNIR-PITを使用して、特定の細胞除去の方法を提示します。

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrared Dye</td><td>LI-COR Bioscience (米国ネブラスカ州リンカーン)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</</td><td>>SIGMA-ALDRICH (米国ミズーリ州セントルイス</td>)<td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 カラム (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (bradford) Plus protein assay</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (米国マサチューセッツ州ウォルサム)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well Hanging Drop Plates</td><td>3D Biomatrix Inc (米国ミシガン州アナーバー)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>光パワーメーター</td><td>Thorlabs (米国ニュートン州ニュートン)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (パニツムマブ)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp;mmガラス底皿、皿サイズ35&nbsp;mm、井戸サイズ10&nbsp;mm</td><td>Cellvis (米国カリフォルニア州マウンテンビュー)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

近赤外photoimmunotherapy法を用いた混合3d文化からの選択的な細胞除去

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

最近の組織工学の発展は、多くの疾患に対する革新的な解決策を提供します。例えば、再生医療における新たな手法として、人工多能性幹細胞(iPS)を用いた組織工学が浮上しました。この組織再生は有望ですが、組織培養中の不要な細胞による汚染が大きな懸念事項です。また、移植後の腫瘍原性については安全性に懸念があります。したがって、特に確立された組織において、保護が必要な他の細胞を損傷することなく、特定の細胞を排除することが急務です。ここでは、近赤外光免疫療法(NIR-PIT)を用いたin vitro混合3D細胞培養から、非標的細胞にダメージを与えることなく特異的な細胞を除去する方法を紹介します。この技術により、混合細胞培養または組織から特定の細胞を除去できます。

光学NIR-PITの効果を監視するには、EGFRを過剰発現するA431細胞株は、遺伝的にもGFPおよびルシフェラーゼ（A431-LUC-GFP）を発現するように変更されました。 NIR-PITの非標的として、のBalb / 3T3細胞株を光学的にRFP（3T3-RFP）を発現するように改変しました。 APC、パニツムマブ-IR700（パン-IR700）を合成しました。細胞（A431-LUC-GFPおよび3T3-RFP）の種々の比率で構成された混合スフェロイドは、このプロトコル（ 図1）に従って作製しました。繰り返しNIR-PITがpan-IR700（ 図2A中のレジメンを参照）のインキュベーションを行いました。この混合3D培養からの標的細胞の除去を達成し、蛍光およびルシフェラーゼ活性（ 図2B、C）でモニターしました。一方、非標的細胞は、成長し続けました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

特定の細胞を他の細胞を傷つけずに除去することは、特に確立された組織において非常に困難ですが、組織工学の分野では細胞除去法が緊急に必要とされています。ここでは、近赤外光免疫療法(NIR-PIT)を用いて、混合3D細胞培養から特定の細胞を除去する方法を紹介します。

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

本実験手順の全体的な目的は、近赤外光免疫療法を用いて、混合3D細胞培養から目的の特定の細胞を除去できることを実証することです。この手法は、再生医療に関する組織工学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、多様な標的分子に対して使用でき、治療を目的の特定の病変部位に限定できることです。これにより、副作用を最小限に抑えることができます。モノクローナル抗体にIR700を結合させるには、目的の抗体とIR700をリン酸二ナトリウム緩衝液中で混合し、マイクロ遠心チューブに入れて、アルミホイルで遮光し室温で1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、PD10カラムを15 mLのPBSで2回洗浄します。次に、抗体溶液をカラムにロードし、製造元の指示に従ってPBS溶出により混合物を精製します。各モノクローナル抗体分子に結合したfluoro-4分子の数を確認するため、分光光度計を用いてモノクローナル抗体のタンパク質濃度を測定します。その後、コンジュゲートを4°Cで保存します。混合3D細胞培養を調製するには、96ウェル・ハンギングドロッププレートのプレートリザーバーセクションに滅菌水を1 milliliter加えます。次に、目的の細胞種をさまざまな比率で、適切な細胞培養培地を用いて、1ウェルあたり50 microlitersの培地につき少なくとも5,000 cellsの密度で播種し、37-degree Celsius、5%carbon dioxideの加湿インキュベーター内で5～7日間培養します。培養培地は2日ごとに交換し、倒立明視野顕微鏡を用いて10～40倍の倍率で、スフェロイドの形態とサイズを毎日観察します。スフェロイドの直径が400から600ミクロンに達したら、ハンギングドロッププレートの培地を抗体光吸収剤複合体含有培地へと交換し、プレートをインキュベーターに戻して6時間培養します。培養終了後、新鮮なフェノールレッドフリー培地でスフェロイドを2回洗浄します。次に、先端をカットした200マイクロリットルピペットチップを用いて、スフェロイドを1つずつ、新鮮なフェノールレッドフリー培地を100マイクロリットルずつ分注した個別のガラスボトム50ミリメートルディッシュに移します。倒立顕微鏡を用いて、スフェロイドの形態変化を観察します。スフェロイドに照射させるため、発光ダイオードをガラスボトムディッシュから5インチ以上の高さにならないように配置します。そして、光学パワーメーターを使用して、波長670～710 nmの光が2 J/cm²で照射されていることを確認します。NIR赤外光免疫療法後、スフェロイドを新しい吊り滴プレートに移し、1ウェルあたり50 µLの新鮮な培地を加え、細胞培養インキュベーター内で1日間培養します。次に、先端をカットした別の20

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオは、腫瘍組織に浸潤するT細胞のさまざまな亜集団を分析するためのin-situ蛍光マルチスペクトルイメージング技術を示しています。腎細胞がん組織凍結切片は、特異的な阻害性受容体を発現し、免疫療法抵抗性の表現型を示すCD8+ T細胞を標識する抗体で処理されます。標識された切片をマルチスペクトル顕微鏡を用いて可視化し、異なるCD8+...

免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

このビデオは、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を示す改変マウスモデルで肺がんを治療するための近赤外線光免疫療法技術を示しています。腫瘍細胞上の特定の抗原に結合する抗体-光増感剤コンジュゲート(APC)をマウスに注入すると、マウスは近赤外線に曝露され、APCに光化学変化が誘導され、結合した腫瘍細胞の壊死につながります。治療の有効性は、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを注入し、腫瘍の成長と相関する生物発光を経時的に測定することによって監視されます。...

マウスモデルにおける肺癌治療のための近赤外光免疫療法技術

このビデオでは、近赤外光免疫療法により混合3D細胞培養から特定の細胞を選択的に除去する技術を紹介しています。この方法では、NIR光吸収剤と結合した抗体を用いて、標的細胞を正確に同定します。その後の赤外光の照射により細胞死が誘導され、標的細胞が3D培養から効果的に排除されます。...

混合3D培養における標的細胞排除のための近赤外光免疫療法

このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。...

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

光線力学療法 (PDT) は、ジベレリン光増感剤 (PS) 目に見える光した後アポトーシス誘導へのインキュベーションを含む医療処置です。PS 培養と光治療パラメーターの差異を検討するために使用可能性があります PDT をシミュレートするように設計の in vitro PDT...

体外光線力学的治療へのアプローチ

近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、抗体光吸収体(IR700Dye)とNIR光を利用してがん細胞を破壊する新たながん治療戦略です。ここでは、生物発光イメージングを用いた胸膜播種肺癌および悪性胸膜中皮腫のマウスモデルにおけるNIR-PITの抗腫瘍効果を評価する方法を提示する。...

胸膜普及のマウスモデルに対する近赤外光免疫療法

鳥胚の絨毛尿膜(CAM)は、さまざまな研究分野に非常に有用で適用可能なツールです。ニホンウズラCAMの特別なexovoモデルは、光線力学処理の研究に適しています。...

ウズラ絨毛尿膜 - 光線力学診断と治療のためのツール

ここでは、2次元HeLa細胞培養と光増感剤としての椎体を使用する in vitro...

2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置

このプロトコルは、そのような化合物の前臨床スクリーニングに使用できる光切り替え性抗癌ペプチドの評価に採用された一連の実験を提示します。これには、2Dおよび3D細胞培養における細胞毒性評価、 ex vivo(モデル組織)の光異性化効率の評価、および in vivo...

光制御された生物学的に活性な化合物のin vitroおよびin vivo評価-癌光薬理学の潜在的な薬剤候補

手動IBEX法による低コストで汎用性の高い光照射技術の実装により、有意な天然自家蛍光でヒト組織の最適なイメージングが可能になります。このプロトコルでは、倒立顕微鏡、広く利用可能な試薬、および画像のアライメントと処理のためのオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからマルチプレックス化されたホールスライド画像を取得する方法を詳しく説明しています。...

反復漂白に最適化されたワークフローにより、高自家蛍光の臨床サンプルのマルチプレキシティイメージングが拡張されます

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶ近赤外Photoimmunotherapy法による混合3D培養からの標的細胞選択的除去法。組織工学における周辺細胞への損傷を最小限に抑え、再生医療への応用可能性を示す革新的技術です。

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

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