酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

この手順の全体的な目標は、酵素消化と密度勾配分離を使用して、皮膚浸潤性白血球を分離することです。この方法は、アトピー性皮膚炎を含む皮膚病理の多くのマウスモデルにおける細胞および分子メカニズムの調査に適用できます。この方法は、皮膚浸潤性白血球の生物学に関する洞察を得ることができますが、他の常在細胞集団の研究にも適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、余分な脂肪組織や結合組織を完全に除去することを含む、皮膚の採取に苦労します。この方法は、スキンハーベスティングや密度勾配の取り扱いを学ぶのが難しく、精度と練習が必要なため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。治療後の適切な時点で、10センチメートルの手術用ハサミを使用して、成人の8〜12週齢の女性ND4スイスウェブスターマウスから25 x 25ミリメートルの剃毛された脇腹の皮膚を慎重に切除します。.

清潔で鋭利な外科用ブレードを使用して、皮膚から余分な脂肪と結合組織をこすり落とし、次に皮膚を10ミリリットルの室温HBSSを含む50ミリリットルの円錐管に移し、EDTA、HEPES、およびFBSを補充し、回転プレート上の組織を乾燥した非ガスで30分間前消化します。 摂氏37度のインキュベーター。インキュベーションの終了時に、チューブを10秒間激しくボルテックスし、70ミクロンのストレーナーで組織スラリーをろ過します。次に、一対の鉗子を使用して、ストレーナーから脇腹の皮膚片を、EDTA、HEPES、およびFBSを補充した10ミリリットルの新鮮な室温HBSS培地を含む新しい50ミリリットルのチューブに移し、次に12.5センチメートルの外科用解剖ハサミを使用して、脇腹の皮膚の各部分をミンチにして、平均的な組織片のサイズが約2.2 x 2.2ミリメートル

すべてのピースをミンチにしたら、チューブを回転プレートに戻し、さらに30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりにチューブを10秒間激しくボルテックスし、70ミクロンのストレーナーで内容物をろ過します。残りの脇腹の皮膚片を、10ミリリットルのHBSSと0.7ミリグラム/ミリリットルのコラゲナーゼDを添加した新しい50ミリリットルのチューブに集め、チューブを回転プレートに戻してさらに30分間インキュベートします。

さらに10秒間のボルテックスの後、チューブの内容物を再度ろ過し、今度はストレーナ上の破片を捨ててから、チューブに最大50ミリリットルのHBSS、EDTA、HEPES、FBSを充填し、細胞をスピンダウンして上清をデカントします。新しい15ミリリットルの円錐管に3ミリリットルの室温、PBS中の67パーセント密度勾配遠心分離培地を加え、5ミリリットルの室温44パーセント密度勾配遠心分離培地に細胞ペレットを再懸濁しますHBSSとフェノールレッド。ピペッターを最低速度に設定し、ピペットをチューブの側面に置き、密度67%のグラジエント遠心分離培地の上に細胞を穏やかに重ねます。

密度勾配を使用するときは、気泡が発生しないように注意し、勾配インターフェースの中断を最小限に抑えてください。次に、5ミリリットルのトランスファーピペットを使用して細胞を分離し、遠心分離の終了時に界面で細胞を回収します。グラジエントを穏やかに層状にし、グラジエントの界面を慎重に抽出することが重要なステップであるため、目的の実験細胞で手順を試みる前に、密度グラジエント遠心分離、培地の層化、およびマウス脾細胞の懸濁液による界面除去を練習することが賢明です。

最後に、採取した細胞を15ミリリットルの円錐管にFBSを添加した氷冷PBSで洗浄し、トリパンブルー排除により生存細胞の数をカウントします。酵素消化の有無にかかわらず、同数のCD4陽性細胞とCD8-α陽性細胞が検出されるため、CD4およびCD8-α表面発現はコラゲナーゼD消化の影響を受けません。さらに、コラゲナーゼD消化は、CD4陽性T細胞上のT細胞活性化マーカーCD44およびCD62Lの表面密度に影響を与えません。

グラジエント分離後、オキサゾロンまたはOxチャレンジマウスからは、脇腹組織1平方ミリメートルあたり約250の生存免疫細胞が単離されるのに対し、ビヒクルチャレンジマウスでは組織1平方ミリメートルあたりわずか4個の生存免疫細胞が、以前にOx.95%で感作され、Oxチャレンジマウスの低前方散乱および側方散乱単一細胞の95%、およびビヒクルチャレンジコントロールのこれらの細胞の71%が生きたCD45陽性細胞である。 これは、1日3回の牛のチャレンジ後に脇腹の皮膚に浸潤するCD45陽性免疫細胞集団の約67倍の増加に相当します。実際、Oxチャレンジは、T細胞と好中球の側面皮膚への顕著な浸潤をもたらし、Ox処理動物の単一の生きたCD45陽性細胞の42%、見かけのGr-1陽性好中球、および対照のエタノール処理動物と比較してCD8-αまたはCD4を発現するCD3陽性T細胞の約84%がいます。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば約3時間で完了することができます。

この手順を試行する際は、密度勾配を慎重に扱うことを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に室温密度勾配遠心分離媒体を使用することを忘れないでください。この手順に続いて、フローサイトメトリー分析、細胞ソーティング、細胞移植、in vitro細胞培養などの他の方法を実行して、皮膚浸潤する白血球の表現型と機能を評価することができます。

このビデオを見れば、酵素消化と密度勾配遠心分離を使用して皮膚浸潤性白血球を単離する方法を十分に理解できるはずです。