2Dと3Dの肌の改善インビトロモデル

この手順の全体的な目標は、細胞外マトリックスの沈着を強化し、高分子クラウディングを使用して現在の 2D および 3D 皮膚モデルを改善することです。クラウディングは、細胞由来マトリックスの生成を改善し、凝縮された時間枠で成熟した器官型培養を改善します。この方法は、皮膚やその他の組織のバイオエンジニアリングのために細胞由来の細胞外マトリックスを生成する改善された方法を提供するため、組織工学の分野における重要な質問に答えることができます。

この技術の主な利点は、これらの培養物に高分子クラウディングを適用すると、細胞由来のマトリックスと器官型の皮膚構築物を有意に凝縮された時間枠で生成できることです。干渉反射顕微鏡法の技術により、抗体染色を必要とせずに細胞外マトリックスの全沈着を視覚化することができます。これらの技術の応用は、皮膚細胞による細胞外マトリックス沈着の研究から、特により優れた皮膚同等物の生成と移植のための組織培養の改善された創傷治療にまで及びます。

まず、50, 000の初代線維芽細胞、初代ケラチノサイト、またはその両方の共培養物を、1ミリリットルのミディアムプロウェルで24ウェルプレートのウェルに播種します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに一晩接着させます。次に、古い培地を廃棄し、高分子クラウダーと100マイクロモルのアスコルビン酸を含む1ミリリットルの新鮮な培地と交換します。

培養物を6日間インキュベートし、2日ごとに培地を交換します。テキストプロトコルに従って免疫蛍光法およびウェスタンブロッティングを実施します。細胞由来マトリックスを作製して使用するには、先ほど示したように分子クラウダーとアスコルビン酸で細胞を6日間培養した後、まず1X PBSを使用して細胞層を2回洗浄することにより、細胞層を脱細胞化して細胞由来マトリックスを得ます。

PBSを吸引し、次に250マイクロリットルの0.5%デオキシコール酸ナトリウムを加え、氷上で10分間インキュベートします。細胞溶解物を吸引し、次にさらに250マイクロリットルの0.5%デオキシコール酸ナトリウムを加え、10分間のインキュベーションと吸引をさらに2回繰り返します。蒸留水を使用して、細胞由来マトリックスを2回洗浄します。

水を吸引し、PBSを1倍加えます。マトリックスを摂氏4度で最大1週間保管します。二次細胞懸濁液を調製するには、マトリックスからPBSを吸引し、例えばFマットの上に50,000個のケラチノサイトを播種します。

細胞が一晩接着するのを待ちます。細胞由来マトリックス上で干渉反射顕微鏡(RIM)を実行するには、テキストプロトコルに従って共焦点顕微鏡を使用して画像取得を行います。細胞培養インサートにカプセル化された線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをキャストするには、ラットテールコラーゲンタイプ1の10ミリリットルを冷たいビーカーに分注します。

1ミリリットルの冷たいDMEMと0.5ミリリットルの1モルの水酸化ナトリウムを加えて、酸性コラーゲンを中和します。次に、0.5ミリリットルの線維芽細胞懸濁液を追加します。コールドピペットを使用して、12 mLの溶液を6ウェル培養プレート内の細胞培養インサートに均等に分けます。

ゲルを摂氏37度と二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。ゲルが固まったら、線維芽細胞培地またはFMに浸します。次に、24時間インキュベートした後、FMを吸引します。高分子クラウダーを含む4ミリリットルの新鮮な培地を使用して、細胞培養インサートの内部に2ミリリットルを、細胞培養インサートの外側に2ミリリットルを追加することで、古いFMを置き換えます。24時間のインキュベーション後、0.125%トリプシンのごまかし剤を使用してケラチノサイトをトライソニゼーションします。

フラスコの側面を軽くたたいて細胞を取り除き、トリプシンを中和するために血清含有培地を追加します。細胞をカウントした後、ケラチノサイト懸濁液を調製します。次に、細胞培養インサートから培地を吸引し、ゲルの上部にケラチノサイトを加えます。

ゲルを1時間インキュベートします。ケラチノサイトがゲル表面に付着した後、2ミリリットルのKSFMまたはCTN-57無血清培地を使用して細胞をゲル培養インサート内に沈め、細胞培養インサートの外側に2ミリリットルのFMを添加します。24時間のインキュベーション後、古い培地を廃棄し、高分子クラウダーを含む新しい培地と交換します。

水中培養で7日間放置した後、培養物を気液界面に浮上させるために、培養インサートをディープウェルプレートに移します。細胞培養インサートの外側に10ミリリットルの層別培地を加え、インサートの内部を乾燥させます。最後に、培養物をインキュベートし、3日ごとに14日間培地を交換します。

それらを収集して、テキストプロトコルに従って処理します。ここに示すように、高分子のクラウディングにより、線維芽細胞は対照培養物と比較してより多くの細胞外マトリックスまたはECMを沈着させることができました。世俗化すると、線維芽細胞がコラーゲン1、コラーゲン4、およびフィブロネクチンの主要な沈着因子であることが明らかになりました。

この図は、コラーゲンセブンの主な沈着因子がケラチノサイトではなく線維芽細胞であったことを示しており、これはin vitroでのコラーゲンセブン沈着が成功した最初の報告です。RIMを使用して、細胞由来のマトリックスの全範囲がキャプチャされました。抗体染色によるRIM画像の重ね合わせは、ECMの総量に対するそのECM成分の相対量を示しています。

3D in vitro皮膚モデルでは、高分子クラウディング(MMC)により培養時間が5週間から3週間に短縮され、成熟した器官型の皮膚共培養が得られました。ここで見られるように、H染色とE染色により、3週間後のMMCの培養は、胸膜層化した表皮とストローモール隆起した真皮で構成されていました。さらに、対照培養では弱くてむらのあるコラーゲン7免疫染色と比較して、混雑した細胞培養の真皮表皮接合部で強烈で連続的なコラーゲン7免疫染色が検出されました。

透過型電子顕微鏡法では、MMCで作製した器官型培養物にアンカーフィブリルが存在することも示され、機能的なコラーゲン7が示されています。細胞由来マトリックスは、細胞外マトリックスの複雑さが維持され、細胞自体によって産生されるため、代替の足場として二次細胞播種目的に使用することができます。高分子クラウディング下で作製される器官型皮膚培養物は、真皮間質隆起部、主要な真皮表皮接合部、および胸膜層形成表皮を含むため、改良された3D皮膚モデルとして使用できます。

有機型、または高分子クラウダーで生成された皮膚同等培養物は、皮膚表皮接合部がより発達しており、移植の成功を改善する可能性が高いため、皮膚移植にも使用できます。細胞外マトリックスの沈着が促進されるだけでなく、高分子クラウディングは、試薬の量を増やすことなく、速度が制限された反応を促進するために、他のin vitroシステムに適用することができます。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応。