Name: 2Dと3Dの肌の改善インビトロモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶ 高分子クラウディングを用いた細胞由来マトリックス生成法と、2D・3D皮膚モデルの改善技術。この革新的な組織工学手法により、創傷治療や皮膚移植用の成熟したオルガノタイプ培養物を短時間で作成できます。

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この作業は、シンガポールの生物医学研究評議会によって、医学生物学研究所へのコアサポートと助成金SPF2013/005を通じて支援されました。M.R.は、NUS教員研究委員会の助成金(医学工学)(M.R.)によって支援されました。R-397-000-081-112、および NUS 組織工学プログラム (NUSTEP)。著者らは、コラーゲンVII抗体を提供してくださったIrene Leigh教授に感謝します。電子顕微鏡の研究は、シンガポール国立大学の電子顕微鏡ユニットで行われました。

<ol><li>Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes+in+skin%3A+unique+structures+with+diverse+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions.</a> Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).</li>
<li>Lane, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mutation+in+the+conserved+helix+termination+peptide+of+keratin+5+in+hereditary+skin+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering.</a> Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Niessen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions%2Fadherens+junctions%3A+basic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function.</a> J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).</li>
<li>Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+molecules%3A+potential+targets+in+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).</li>
<li>Schaefer, L., Schaefer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteoglycans%3A+from+structural+compounds+to+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules.</a> Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+reconstruction+in+human+skin+equivalents+is+regulated+by+fibroblasts+and%2For+exogenously+activated+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).</li>
<li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Enhancement+of+Collagen+Matrix+Formation+and+Crosslinking+for+Applications+in+Tissue+Engineering--a+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng%22%5BJournal%5D)">In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study.</a> Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).</li>
<li>Lareu, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+deposition+is+dramatically+enhanced+in+vitro+when+crowded+with+charged+macromolecules%3A+the+biological+relevance+of+the+excluded+volume+effect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect.</a> FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).</li>
<li>Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulating+a+crowded+intracellular+environment+in+vitro.+dramatically+improves+RT-PCR+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Biochem+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance.</a> Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).</li>
<li>Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+in+vitro+as+means+of+emulating+cellular+interiors%3A+when+less+might+be+more%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+USA+Sci%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more.</a> Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119(2008).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scar-in-a-Jar%3A+Studying+antifibrotic+lead+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li>
<li>Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+how+the+crowded+interior+of+cells+stabilizes+DNA%2FDNA+and+DNA%2FRNA+hybrids-in+silico+predictions+and+in+vitro+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence.</a> Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).</li>
<li>Satyam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+meets+tissue+engineering+by+self-assembly%3A+A+paradigm+shift+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine.</a> Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).</li>
<li>Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li>
<li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+for+Polyvinylpyrrolidone+as+a+Macromolecular+Crowder+for+Enhanced+Extracellular+Matrix+Deposition+and+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+C%22%5BJournal%5D)">Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation.</a> Tiss Eng C. , (2014).</li>
<li>Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Architecture+of+3D+Collagen+Hydrogels+by+Physiological+Macromolecular+Crowding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).</li>
<li>Dewavrin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Rate+Boosting+of+Collagen+Fibrillogenesis+in+Heterogeneous+Mixtures+of+Crowding+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents.</a> J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).</li>
<li>Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+skin+substitutes%3A+from+in+vitro+constructs+to+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications.</a> Biotechnol Appl Biochem. 39, 263(2004).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+effect+on+cartilaginous+matrix+production%3A+a+comparison+of+two-dimensional+and+three-dimensional+models%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models.</a> Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).</li>
<li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+directs+extracellular+matrix+organization+and+mesenchymal+stem+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior.</a> PLOS One. 7 (5), e37904(2012).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecularly+crowded+in+vitro+microenvironments+accelerate+the+production+of+extracellular+matrix-rich+supramolecular+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies.</a> Scientific Reports. 5, 8729(2015).</li>
<li>Ang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+amplifies+adipogenesis+of+human+bone+marrow-derived+MSCs+by+enhancing+the+pro-adipogenic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment.</a> Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).</li>
<li>Peng, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fibroblast+Matrices+Bioassembled+Under+Macromolecular+Crowding+Support+Stable+Propagation+Of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tiss+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells.</a> J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).</li>
<li>Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+More+Matrix%3A+Enhancing+the+deposition+of+dermal-epidermal+junction+components+in+vitro+and+accelerating+organotypic+skin+culture+development%2C+using+macromolecular+crowding%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+A%22%5BJournal%5D)">Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding.</a> Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).</li>
</ol>

著者には、開示すべき相反する利益はありません。

増強された細胞外マトリックスは、プロテイナーゼによるプロペプチド切断を増加させる排除体積効果により、細胞培養に高分子クラウダーを導入すると得られます。これにより、細胞外マトリックス、特にコラーゲンがより速く処理され、培養表面に沈着します。他のグループは厚い線維芽細胞層を取得していますが、培養時間は数週間でした20。対照的に、このプロトコルに記載されているMMCは、ECMの量を増やしながら培養時間を劇的に短縮します。混雑した細胞培養における反応速度の増加は、軟骨細胞マトリックス沈着21、細胞外マトリックス組織22,23 、および脂肪形成24でも報告されています。 
混雑した細胞層の脱細胞化後、細胞由来マトリックスが回収され、さまざまな組織工学的用途に使用され、そのうちの1つは、細胞由来マトリックス25,26の上に二次細胞培養物を播種することです。マトリックスは細胞由来の天然物であるため、理想的でない条件に長期間保管すると劣化が発生する可能性があります。MMCで得られた細胞由来...

皮膚は、水の損失及び病原体侵入を防止することにより、保護バリアを形成します。これは、3つの主要コンポーネントで構成されています。間質豊富な真皮1、その上に層状表皮2,3,4、および5,6間における真皮表皮接合部。真皮は主にコラーゲンと弾性繊維で構成されており、まばら線維芽細胞7が入力されます。対照的に、細胞が豊富な表皮ケラチノサイトの複数の層で構成されています。最も内側の層のケラチノサイトは、増殖され、更新し、常に皮膚の最も外側の層に移動して受ける角質層で、その結果、それらの核と細胞質材料を失った末端分化するケラチノサイトを置き換える新たな基底細胞を提供します落屑。 真皮 - 表皮接合部、基底膜の特定のタイプは、tethe相互接続マトリックス分子からなる複合構造体であります真皮に表皮をRS。真皮のコラーゲンI繊維は、コラーゲンIV豊富な緻密層に固定されているコラーゲンVIIアンカリングフィブリルと交錯します。順番にアンカリングフィラメント（ラミニン5、コラーゲンXVIIおよびインテグリン）は、基底ケラチノサイトのヘミデスモゾームに緻密層を接続します。基底ケラチノサイト（基底層）が分化し、基底上層を形成するために階層化だけでなく、増殖して更新する能力を持っています。有棘層、顆粒層、および環境と肌の接触面を示し、最終的に角質層、。角質層の基底層からエンルート 、ケラチノサイトは、サイトケラチンの発現パターンを切り替えて、最終的にアポトーシスを受けるし、角質化で自分自身を包みます封筒、共有結合トランスグルタミナーゼ活性によって架橋されている特定のタンパク質の殻。 の複雑な構造を含む、in vitroで皮膚とその層の再作成<html>真皮 - 表皮接合部および真皮細胞外マトリックス、および角化プロセスをエミュレートするには、やりがいのある仕事であれば、興味をそそら科学者や生体工学を持っています。例えば、患者の生検から皮膚細胞の正常な抽出および患者由来の皮膚細胞8を用いて皮膚の器官培養物の生成皮膚組織工学における重要な進歩がありました。しかし、未解決の問題は、皮膚細胞自体による細胞外マトリックスタンパク質の悪い分泌に関係し、次善の皮膚モデルで得られたままです。さらに、現在のプロトコルを使用して3次元器官型皮膚共培養物を生成するのに必要な時間は、4〜8週間、潜在的に巨大分子crowdersの取り込みと短縮することができる時間枠の間で変化します。培養時間を減少させること、試薬コストを節約し、細胞老化の発生率を低減し、製品が臨床で使用されるべき患者の待ち時間を減少させます。 トン&quot;&gt;高分子は、（MMC）混雑は排除体積効果。これらは、標準的な水性の培養条件9-13の下で遅刻であるプロコラーゲンのタンパク質分解切断を含む酵素反応速度に影響を与える。MMCの下では、酵素反応を生成するために、培養培地に特定の高分子を導入することを含みます空い対照10と比較して、混雑した培養物中のIは分子コラーゲンの量の増加、プロコラーゲン切断の場合には、その結果、試薬14,15の量を増加させることなく早めている。コラーゲンとプロコラーゲンの変換は、コラーゲンの形成を可能にするようにアセンブリ、48時間MMCを用いて培養した線維芽細胞は、最大4週間11,16,17のために監視混雑していない線維芽細胞培養物と比較して有意に多くのコラーゲンIを得た。ECMの形成、安定化およびリモデリングに影響を与える酵素活性への影響のほか、MMCも直接コラーゲンを増強し、調節することが示されています繊維形成18,19。 我々はここでは特に、真皮線維芽細胞と表皮角化細胞における細胞外マトリックスの皮膚細胞による（ECM）の生産を増強する方法を提示します。また、我々は、単層培養でMMCで製造富化ECMは、脱細胞化し、純粋な細胞由来のマトリックス（CDM）として使用することができることを示しています。 私たちは、視覚化するために非従来型のアプローチを使用し、完全にMMCで培養皮膚細胞によって堆積ECMを感謝しています。干渉反射顕微鏡は、典型的には、細胞 - マトリックス相互作用または細胞 - ガラス接触点を研究するために使用されます。この技術は、ガラス表面上に堆積されたマトリックスの合計量を表示するために、我々のシステムで利用されました。干渉反射顕微鏡は、MMCの存在下および非存在下で、細胞外マトリックス組成物及びパターンの点でほとんどの情報量を得るために、蛍光免疫染色を用いてカップリングさせました。 OrganotypiC皮膚共培養は、三次元の文脈において、インビトロで皮膚をモデル化するための古典的な方法です。二次元の共培養は、重要な情報を提供することができるが、このデータを変換し、バック本質的に三次元構造であり、インビボ環境にそれを適用する場合、それは限られています。皮膚ケラチノサイトは、特に、偏光であり、恒常性と細胞接着のために必須である頂端および基底セグメントを含みます。また、このようなケラチン1、ケラチン10およびフィラグリンのように基底層以上のケラチノサイト、中の典型的な基底上のタンパク質の発現は、層化およびケラチノサイトの分化の過程で唯一の存在です。分化は、典型的な単層培養物中にほとんど存在するように、基底層直上タンパク質の発現は、通常、この培養系では達成されません。したがって、器官培養物は、培養培地中に浸漬開始、その後keratinocytを駆動するための気液界面に持ち上げられます電子分化。これは、層別マーカーの発現、さえ角化および表皮生理学の一般より良い反射が生じます。他のグループが以前に成功した器官皮膚共培養を生成しているが、機能的真皮 - 表皮接合ゾーンの確立が課題となっています。ここでは、凝縮された時間枠内で、これらの構築物の成熟度を損なうことなく、強化された基底膜と器官皮膚共培養を培養するための新しい方法を提示します。これは、in vitroでのモデリングのための皮膚模倣薬、皮膚生物学の研究およびスクリーニングアッセイの品揃えを提供するであろう。

<table><tbody><tr><td>アスコルビン酸</td><td>和光</td><td>013-12061</td><td>細胞培養培地添加</td></tr><tr><td>物 細胞培養インサート&nbsp;(6ウェルフォーマット)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td>器官型培養</td></tr><tr><td>クエン酸溶液</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td>DakoCytomation ターゲット検索溶液 クエン酸、pH 6 (x10)</td></tr><tr><td>コラーゲン (ラットテール)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Organotypic cultures</td></tr><tr><td>CnT-57</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-57</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>DAB Substrate + chromogen kit</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>組織学</td></tr><tr><td>ディープウェルプレート(6ウェルフォーマット)</td><td>Corning</td><td>355467</td><td>Organotypic cultures</td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2106</td><td>Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent</td></tr><tr><td>Electron microscope (TEM)</td><td>&nbsp;日本電子&nbsp;</td><td>&nbsp;JEM-1010 (100kV)</td><td>透過型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>線維芽細胞培地 (FM)</td><td></td><td></td> <td>高グルコースDMEM + 10% ウシ胎児血清 + 1% ペニシリン ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>Ficoll PM70</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0310-05</td><td>Macromolecular crowder</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0300-05</td><td>高分子クラウダー</td></tr><tr><td>ケラチノサイト無血清培地 (KSFM</td><td>)Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td>タンパク質抽出用溶解バッファー。プロテアーゼ阻害剤(Roche、#11836170001)をこの溶解バッファーに添加しました。&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>AF594、AF488、DAPI蛍光免疫染色(40倍等)を視覚化するための赤、緑、青のチャンネル。</td></tr><tr><td>封入剤(ハイドロマウント)</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>蛍光染色</td></tr><tr><td>封入剤(Cytoseal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Histology (HRP)</td></tr><tr><td>OCT化合物(Tissue Tek)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>凍結切開用包埋</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン系抗生物質</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td>細胞培養培地添加</td></tr><tr><td colspan="4">Primary 抗体</td></tr><tr><td>抗コラーゲンI抗体</td><td>アブカム</td> <td>#ab6308</td><td></td></tr> 抗<tr><td>コラーゲンIV型</td><td>Novocastra</td> <td>#NCL-COLL-IV</td><td></td></tr><tr><td>抗コラーゲンVII</td><td></td><td></td><td>LH7.2(自社製)&nbsp;</td></tr><tr><td>抗フィブロネクチン抗体</td><td>アブカム</td> <td>#ab2413</td><td></td></tr><tr><td>還元剤&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>サンプルバッファー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0008</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td colspan="4">Secondary antibodies (Immunostaining)</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td> <td>#D9542</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 ヤギ抗ウサギ</td><td>ThermoFisherサイエンティフィ</td><td>ック #A-11037&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 ヤギ抗マウス</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp;#A-11005</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 ニワトリ抗ウサギ</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>#A-21441</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 ヤギ抗マウス</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>#A-11001</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体 (HRP)</td><td>Dako</td><td>Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse</td><td>原液</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Prodotti Chimicie Alimentari</td><td></td><td>Decellularization</td></tr><tr><td colspan="4">Stratification media</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面で使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>ハムs F12&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面で使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>10%ウシ胎児血清&nbsp;</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面で使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>100 U/mlのペニシリンおよび100 U/mlのストレプトマイシン</td><td></td><td></td><td>器官型培養の空気液体界面で使用される。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>0.4 mg/mL ヒドロコルチゾン</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面で使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>5 mg/mlインスリン</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面に使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>1.8&ミッドドット;10-4 M アデニン&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面で使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>5 mg/mLトランスフェリン</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面に使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>2&ミッドドット;10- 11 M トリヨードチロニン&nbsp;</td><td></td><td></td><td>器官型培養の気液界面で使用されます。この培地は、細胞培養インサートの外側に添加されます。</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>バイオポリス共有施設</td><td>0.125%トリプシン/バーセン&nbsp;&nbsp;pH 7.0 + 0.3&nbsp;</td><td>細胞のトリプシン化に使用</td></tr></tbody></table>

2dと3dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

コラーゲンの糖タンパク質ファミリーは、ヒトの体内での主な構造タンパク質を示しており、近代的な組織工学で使用される生体材料の主要コンポーネントです。それは、特に皮膚モデルにおいて、結合組織およびその後の組織の凝集の次善の形成をもたらす、悪名高い遅いような技術ボトルネックは、in vitroでのコラーゲンの沈着です。ここでは、コラーゲン沈着の劇的な向上をもたらす分子クラウディング（MMC）を生成するために、皮膚培養物に差次サイズスクロース共重合体を添加することを含む方法を記載します。特に、皮膚線維芽細胞は、対照と比較して、MMCの下のI / IV / VIIおよびフィブロネクチン、コラーゲンを大量に堆積しました。 プロトコルはまたimmunocyによって証明されるように培養表面上に保持された細胞外マトリックス（ECM）の著しい量を露光、混雑した細胞層を脱細胞化する方法を記載します組織化学。トータルマトリックス質量および分布パターンは、干渉反射顕微鏡を用いて調べました。興味深いことに、線維芽細胞、ケラチノサイトおよび共培養は、様々な組成や形態の細胞由来のマトリックス（CDM）を生産しました。 CDMは、より臨床的に関連するアプリケーションに向けて移動させる、コーティングまたは足場の現在の使用は、典型的には、異種動物源から、回避することができる二次電池の播種用「バイオ足場」として使用することができます。 また、このプロトコルは、特に、真皮 - 表皮接合部（DEJ）にECMの沈着を増強するのに十分であった3次元器官型皮膚共培養モデル、コラーゲンVII、主成分の浸漬段階中にMMCの適用を記載しますフィブリルを固定します。電子顕微鏡は、対照と比較して、MMCを使用して開発の文化にフィブリルを固定するの存在を確認しました。アンカーフィブリル従って、表皮と真皮をつなぐので、これは重要です予め形成された成熟DEJは、移植片の安定性と全体的な創傷治癒の点で皮膚移植片レシピエントの利益を得ることができる持ちます。また、培養時間は、コストを削減、MMCを使用する場合に、成熟した構築物を得るために、3週間、5週間から濃縮しました。

分子クラウディングは、特に、ECMの沈着を向上させることができた、線維芽細胞培養物対照と比較してより多くのコラーゲンI、IVおよびフィブロネクチン堆積（ 図1、細胞層を、 図1A、コラーゲンI、1B、コラーゲンIV、1C、フィブロネクチン）。脱細胞化の際には、線維芽細胞はケラチノサイト（ 図1、マトリックス）と比較して、コラーゲンI、IVおよびフィブロネクチンの主要な預金であったことが明らかでした。 図2においては、線維芽細胞ではなく、ケラチノサイトは、コラーゲンVIIの主な生産者であったことが観察されました。これは、in vitro（ベニーら 、2015） で正常に堆積したコラ...

我々は、高分子crowders（MMC）を使用して、細胞外マトリックスタンパク質に富む細胞由来のマトリックスを得るためのプロトコルを提示します。また、我々は、コンストラクトの成熟度を維持しながら、培養時間を減少させる3D器官型皮膚共培養世代でMMCを組み込むプロトコルを提示します。

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

本手法の全体的な目的は、高分子混雑（macromolecular crowding）を用いることで、細胞外マトリックスの沈着を促進し、現在の2Dおよび3D皮膚モデルを改善することです。混雑効果により、細胞由来マトリックスの生成および成熟した器官型培養を、より短期間で実現することが可能になります。本手法は、皮膚やその他の組織のバイオエンジニアリングに向けた、細胞由来細胞外マトリックスのより優れた作製方法を提供するため、組織工学分野における重要な課題への解決策となり得ます。この手法の主な利点は、これらの培養に高分子混雑（macromolecular crowding）を適用することで、細胞由来のマトリックスおよび器官様皮膚構築物を大幅に短縮された期間で生成できることです。干渉反射顕微鏡法を用いることで、抗体染色を行うことなく、細胞外マトリックスの総沈着量を可視化することが可能になります。これらの技術の応用範囲は、皮膚細胞による細胞外マトリックス沈着の研究から、より優れた皮膚等価物や移植用組織培養の作製を通じた創傷治療の改善まで多岐にわたります。まず、初代線維芽細胞、初代角化細胞、またはそれらの共培養細胞を、1ウェルあたり1 mLの培地を用いて24ウェルプレートに50,000個ずつ播種します。37 °C、5% CO2インキュベーター内で一晩静置し、細胞を接着させます。その後、古い培地を除去し、高分子クラウダーと100 µMのアスコルビン酸を含む新鮮な培地1 mLに交換します。培地を2日ごとに交換しながら、培養物を6日間インキュベートします。免疫蛍光染色およびウェスタンブロッティングを、テキストのプロトコルに従って実施してください。細胞由来マトリックスを作製して利用するには、先に示したように分子クラウド剤とアスコルビン酸を用いて細胞を6日間培養した後、まず1X PBSを使用して細胞層を2回洗浄し、細胞層を脱細胞化して細胞由来マトリックスを得ます。PBSを吸引し、0.5% sodium deoxycholateを250 µL添加して、氷上で10分間インキュベートします。細胞溶解物を吸引し、さらに0.5% sodium deoxycholateを250 µL添加して、10分間のインキュベーションと吸引をあと2回繰り返します。蒸留水を用いて、細胞由来マトリックスを2回洗浄します。水を吸引し、1X PBSを加えます。マトリックスを4°Cで最大1週間保存します。二次細胞懸濁液を調製するには、マトリックスからPBSを吸引し、例えば50,000個の角化細胞をF matの上に播種します。細胞を一晩静置して接着させます。細胞由来マトリックスに対して干渉反射顕微鏡法（RIM）を行うには、テキストプロトコルに従い、共焦点顕微鏡を用いて画像取得を行います。細胞培養インサート内に線維芽細胞を封入したコラーゲンゲルを鋳造するには、ラット尾由来I型コラーゲン10 millilitersを冷やしたビーカーに分注します。冷やしたDMEM 1 mLと1 M水酸化ナトリウム 0.5 mLを加え、酸性のコラーゲンを中和させる。次に、線維芽細胞懸濁液 0.5 mLを加える。冷やしたピペットを用いて、12 mLの溶液を6ウェル培養プレートのセルカルチャーインサートに均等に分注する。ゲルを37°C、5% CO₂条件下で1時間インキュベートします。ゲルが凝固後、線維芽細胞培地（FM）に浸します。24時間インキュベートした後、FMを吸引して除去します。高分子クラウダーを含む新鮮な培地4 mLを用い、セルカルチャーインサートの内側に2 mL、外側に2 mL加えることで、古いFMを置換します。さらに24時間インキュベートした後、0.125%トリプシン処理剤を用いてケラチノサイトをトリプシン処理します。フラスコの側面を軽く叩いて細胞を剥離させ、血清含有培地を加えてトリプシンを不活化します。細胞数をカウントした後、ケラチノサイト懸濁液を調製します。次に、細胞培養インサートから培地を吸引し、ゲルの上部にケラチノサイトを添加します。ゲルを1時間インキュベートします。ケラチノサイトがゲル表面に接着した後、2 mLのKSFMまたはCTN-57無血清培地を用いて、ゲル培養インサート内部の細胞を浸し、セルカルチャーインサートの外側に2 mLのFMを加えます。24時間のインキュベーション後、古い培地を取り除き、高分子混雑剤を含む新鮮な培地に交換します。浸漬培養で7日間経過した後、培養物を気液界面に移行させるため、培養インサートをディープウェルプレートに移します。インサート内部を乾燥したままにして、セルカルチャーインサートの外側に層形成培地を10 milliliters加えます。最後に、培養物をインキュベートし、14日間にわたって3日ごとに培地を交換します。テキストのプロトコルに従って回収し、処理します。ここで示されているように、高分子混雑（macromolecular crowding）により、対照群の培養と比較して線維芽細胞がより多くの細胞外マトリックス（ECM）を沈着させることが可能になりました。分画後、線維芽細胞がcollagen one、collagen four、およびfibronectinの主な沈着細胞であることが明らかになりました。この図は、コラーゲンVIIの主な沈着源がケラチノサイトではなく線維芽細胞であることを示しており、in vitroでコラーゲンVIIの沈着に成功した初めての報告となります。RIMを用いることで、細胞由来マトリックスの全範囲を捉えることができました。RIM画像と抗体染色のオーバーレイにより、ECMの総量に対する当該ECM構成成分の相対的な量を示しています。3D in vitro 皮膚モデルにおいて、高分子混雑（MMC）を導入することで、成熟した器官形成的皮膚共培養を得るための培養期間を5週間から3週間に短縮しました。ここに示すように、H&amp;E染色により、3週時点でのMMCを用いた培養では、多層化した表皮とストロマリッジ（stromol ridge）を伴う真皮が形成されていることがわかります。さらに、対照群の培養ではコラーゲンVIIの免疫染色は弱く斑状であったのに対し、混雑細胞培養では真皮表皮接合部において、強固で連続的なコラーゲンVIIの免疫染色が検出されました。透過電子顕微鏡においても、MMCを用いて作製した器官型培養においてアンカリングフィブリルの存在が確認され、機能的なcollagen sevenが示されました。細胞由来のマトリックスは、細胞外マトリックスの複雑性が維持されており、かつ細胞自身によって産生されるため、代替スキャフォールドとして二次的な細胞播種目的に利用できる可能性があります。高分子混雑条件下で作製された器官型皮膚培養は、ストローマリッジ真皮、主要な表皮真皮接合部、および多層化した表皮を含むため、改良された3D皮膚モデルとして利用できると考えられます。高分子混雑剤を用いて作製されたオルガノタイプまたは皮膚等価培養物は、真皮表皮接合部がより高度に形成されるため、移植成功率を向上させる可能性があり、皮膚移植にも利用できます。高分子混雑の導入は、細胞外マトリックスの沈着を促進させるだけでなく、他のin vitroシステムに適用することで、試薬量を増やすことなく、反応速度が制限されている反応を促進させることができます。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応などが挙げられます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

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3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

このプロトコルの目的は、長期的な培養のためのアクセス可能で簡単な技術を使用して、血管化されたヒトの皮膚同等物の生成および体積分析を記述することです。可能な限り、ステップの根拠は、研究者が研究ニーズに基づいてカスタマイズする能力を可能にするために記述されています。...

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ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。...

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ここでは、細胞培養ラボでの日常的な研究のためのさまざまな3Dスキンモデルを導入するための安価で簡単な手順を紹介します。研究者は、市販のモデルに頼ることなく、自分のニーズに合わせたモデルを作成することができます。...

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

負染色電子顕微鏡（EM）で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳細なプロトコールを提示する。初心者ユーザーは、簡単にこれらのプロトコルに従うことができますし、それらのタンパク質サンプルを評価するため、他の生化学的アッセイに加えて、ルーチン分析としてEMを染色陰性活用する。...

ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています...

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。...

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

粒子追跡マイクロレオロジーは、3D腫瘍モデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の変化を非破壊的に定量化し、空間的にマッピングするために使用できます。...

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

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再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

学ぶ 高分子クラウディングを用いた細胞由来マトリックス生成法と、2D・3D皮膚モデルの改善技術。この革新的な組織工学手法により、創傷治療や皮膚移植用の成熟したオルガノタイプ培養物を短時間で作成できます。

2Dと3Dの肌の改善

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