Name: 高密度バーコード抗体マイクロアレイのフローパターンガイド作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぼう、フローパターンガイドを用いた高密度バーコード抗体マイクロアレイの作製法。SU-8マスターとPDMSモールドを活用し、単一細胞から分泌タンパク質と細胞内タンパク質を同時検出するカスタマイズ可能な手法を解説する。

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著者は、SUNYアルバニーからのスタートアップ資金とアルバニー大学がん研究センターの施設へのアクセスに感謝したいと思います。

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</ol>

著者には開示すべき競合する利益はありません。

フローパターン設計は、2-Dのマイクロアレイの製造における最初の重要なステップです。ガラス基板上に2つの重複DNAパターンを生成するために、最初の設計のチャネルの特徴は、第二の（ 図1A-B）のものに対して垂直であるべきです。デザインはまた、マイクロアレイの下流の適用を検討してください。単一細胞分析の場合には、マイクロアレイは、したがって、チャネルの寸法が2次元配列と整列マイクロチャンバとの互換性が作られている、マイクロチャンバー内に封入単一細胞からタンパク質を検出するために使用されます。各設計は、フォトマスク上にレンダリングされ、標準的なフォトリソグラフィ技術は、シリコンウェハ（ 図1C-D）でSU-8のチャネルの機能を製造するために使用されます。これは、成形PDMSのマスターとして機能します。金型が製造されたら、それはPLLでコーティングしたスライドに接着した後、窒素ガス流のセットアップ（ 図1E）と結合されます。セットアップたち使用が簡単であり、容易に圧力調整窒素ガス源と、任意の実験室に組み込ま...

抗体マイクロアレイは、広くタンパク質バイオマーカー1-3を含む標的タンパク質の存在を調べるために何十年もプロテオミクス研究に使用されています。このフィールドは現在、質量分析（MS）のような他のハイスループット技術から大きな課題に直面しているが、これらのデバイスは、他のアッセイと、単純なデータ解釈と簡単なインターフェイスを提供する主な理由は、まだ抗体マイクロアレイの有用性の余地があります。近年では、マイクロチップの足場へのマイクロアレイの統合は、抗体マイクロアレイを4-7を繁栄するための新しい機会を提供してきました。例えば、単一の細胞マイクロチップに組み込まれたバーコードのマイクロアレイは、細胞コミュニケーション研究8,9で使用されています。この技術は、他の利用可能なマイクロアレイ技術上の独特の利点を有します。従来のマイクロアレイelemenで使用される典型的な150μmのサイズよりもはるかに小さい10-100ミクロンで配列要素を備えていTS。より小さな配列要素の構造は、系統的なフローパターン化手法を用いて達成され、これは、単一細胞の分泌タンパク質及び細胞内タンパク質を検出することができるコンパクトなマイクロアレイを生じます。もう一つの利点は、単純な楽器フリーのセットアップを使用することです。ほとんどの研究所や中小企業は、マイクロアレイコア施設にアクセスすることができないかもしれないので、これは特に重要です。このようなバーコードの抗体マイクロアレイは、強化されたアッセイのスループットを備え、従来のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA 8）のそれに匹敵する高い感度と特異性を達成しながら、単一の細胞上に高度に多重化されたアッセイを実行するために使用することができます。この技術は、腫瘍細胞の13膠芽細胞腫9-11からのタンパク質、T細胞12を検出し 、そして循環中の多数のアプリケーションを発見しました。あるいは、単独でバーコードDNAマイクロアレイは、模倣のために、ニューロンおよび星状細胞の正確な位置決めに利用されています脳組織14 の in vivoでのアセンブリをる。 このプロトコルは、実験工程と、流体試料中の単一細胞中のバイオマーカーの検出において潜在的な用途を有する二次元（2-D）バーコード、抗体マイクロアレイの構築ブロックに焦点を当てます。技術は、アドレス可能な一本鎖、一次元（1-D）DNAマイクロアレイに基づいてガラス基板上に、空間的にパターニングされた直交するオリゴヌクレオチドを​​用いて構築しました。並列流路を流れパターニング工程において使用される場合、1次元パターンが形成され、このようなパターンは、1-D統一商品コード（UPC）バーコードと視覚的に類似した離散的なバンドとして現れます。 2-Dの建設（N×M個）抗体アレイ- 2-Dクイックレスポンス（QR）マトリックスコードを連想させるには-より複雑なパターン化戦略を必要とするが、より高い密度8,15での抗体の固定化を可能にします。製作第二に垂直な第一のパターンで、二つのDNAパターニング工程を必要とします。これらの二つのパターンの交点は、アレイのn個のx m個の要素を構成しています。戦略フローパターニングに利用一本鎖DNA（ssDNA）の配列を選択することにより、所与の配列内の各要素は、特定のアドレスが割り当てられます。この空間参照は、マイクロアレイスライド上の蛍光シグナルを区別する必要です。一本鎖DNA配列をDNAにコードされた抗体ライブラリー（DEAL 16）と呼ばれるプラットフォームを形成し、相補的DNA抗体コンジュゲートの取り込みを介して抗体の配列に変換されます。 このビデオプロトコルは、2つの方向で準備を含むn×m個抗体アレイポリジメチルシロキサン（PDMS）、バーコードの型、フロー・パターニングのssDNAを作成し、抗体-オリゴヌクレオチドディール複合体を調製し、3に3×3のDNA配列を変換する際に重要なステップを説明×3抗体アレイ。

<table><tbody><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーベース</td><td>ダウコーニング</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマー硬化剤</td><td>ダウコーニング</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025フォトレジ</td>スト<td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ&nbsp;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysineコーティングガラススライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Integrated DNA Technologiesからのカスタムオーダー、表2を参照してください。</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン接着剤原液</td><td>ニューカマーサプライ</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (スルホスクシンイミジル) suberate&nbsp;(BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;kta Explorer 100 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システム</td><td>GE(アマシャムファルマシア)&nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GLカラム</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>キャプチャ抗体</td><td>さまざまな</td><td>様々</td><td>*抗体の選択はアプリケーションによって異なります</td></tr><tr><td>スクシンイミジル-6-ヒドラジノ-ニコチンアミド(S-HyNic)</td><td>ソルリンク</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>スクシンイミジル-4-ホルミルベンズアミド(S-4FB)</td><td>ソルリンク</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸、無水</td><td>アクロス</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>アミコン ウルトラ スピンフィルター 10 kDa MWCO</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>ローレル・テクノロジー</td><td>ズ WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>プランジャー付きバイオプシーパンチ(直径1.0mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドスクライブ(スタイル60)</td><td>SPI供給</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>トリメチルクロロシラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

高密度バーコード抗体マイクロアレイのフローパターンガイド作製

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

抗体マイクロアレイは、十分に開発された技術として、現在、他のいくつかの確立された、または新興のハイスループット技術によって挑戦されています。本稿では、抗体マイクロアレイ技術を新たな製造手法を用いて革新し、新たな特徴を導入する。高密度抗体マイクロアレイの作製は、一本鎖DNAの垂直配向フローパターニングと、その後のDNA-抗体コンジュゲートによる変換によって行われます。このプロトコールでは、DNAのフローパターニング、DNA-抗体複合体の作製と精製、および作製されたマイクロアレイの品質評価における重要なステップを概説しています。均一性と感度は従来のマイクロアレイと同等ですが、当社のマイクロアレイ製造はアレイプリンターの支援を必要とせず、ほとんどの研究室で実行できます。もう一つの大きな利点は、当社のマイクロアレイユニットのサイズが印刷アレイのサイズの10分の1であり、一般的なマイクロチップ設計とインターフェースする際に、単一細胞から機能タンパク質を分析する独自の機能を提供することです。このバーコード技術は、バイオマーカー検出、細胞シグナル伝達研究、組織工学、およびさまざまな臨床アプリケーションに広く採用できます。

PDMSモールド（ 図1A-1B）のデザインは、CADプログラム（AutoCADの）を使用して描かれました。フローパターニングのための機能チャネルを示す2つのデザイン、水平および垂直方向の1 1。各デザインの左右の部分が対称的です。それらのいずれかは、入口または出口である可能性があります。 20チャネルの各々は、一端から他端にはすべての方法を巻いています。各デザインは、クロムフォトマスク（ 図1C）に印刷されています。ウェハ上に作製SU-8マスターは、 図1Dに示されています。 PLLまたはDNAのフローパターン形成を容易にするために、PDMSモールドは、窒素ガス流のセットアップ（ 図1E）に結合させました。 このプロトコルで使用される3流パターニング工程があります。後続のステップは、オリゴヌクレオチド溶液を導入しな...

このプロトコルは、細胞シグナル伝達研究やバイオマーカー検出の潜在的なアプリケーションと大​​規模の製造、多重化された二次元のDNAまたは抗体配列​​を、概要を説明します。

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

この方法論の全体的な目標は、シングルセル解析に応用できる抗体アレイを作製することです。この方法は、同じシングルセルから秘密タンパク質と細胞内タンパク質を同時に検出する方法など、シングルセル解析の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。そして、その目標を達成するために、マイクロアレイプラットフォームをどのように作製できるのでしょうか。この手法の主な利点は、カスタマイズ可能であることです。フローパターニング戦略を変えることで、さまざまな次元の配列を作成できます。事前に、バーコードフローパターンのSU-8マスターを生成します。手順はテキストプロトコルで提供されます。これには、クロームフォトマスクの設計と作成が含まれます。フォトレジストコートにマスクをセットし、UVを塗布することでパターンが得られます。PDMSバーコード金型の準備を開始するには、40グラムのシリコンエラストマーベースと4グラムの硬化剤を組み合わせ、10分間激しく攪拌します。次に、プレポリマー溶液を真空下で20分間脱気します。次に、バーコードパターンのSU-8マスターでシリコンウェーハを入れたシャーレに溶液をロードします。溶液を7.45ミリメートルの深さまで注ぎます。次に、皿内の混合物を脱気して、残っている気泡を取り除きます。脱気に続いて、混合物を摂氏75度で1時間焼き、PDMSを硬化させます。次にメスで切り取り、バーコード型を丁寧に取り出します。次に、ウェーハからスラブを慎重に剥がします。次に、スラブの端をトリミングして、金型の目的の形状にします。プランジャー付きの生検パンチを使用して、入口と出口を表すパターン上の円形の特徴に半ミリメートルの穴を開けて、型を仕上げます。ポリ-L-リジンを塗布したスライドガラスに付着したホコリを窒素ブローガンで吹き飛ばした後、PDMSモールドをスライドに取り付けます。金型の端をスライドに慎重に合わせます。次に、アセンブリを摂氏75度で90分間焼き、PDMSとスライドの間の結合を強化します。その間、入口と出口に20個の柔軟なポリエチレンチューブを準備します。チューブの各部分に、直径1mmのステンレス鋼の中空ピンを取り付けます。次に、ピンを介して、センチメートルメートル以上のポリ-L-リジンを長さに充填します。ガラスに接着したら、ピンを金型の入口に慎重に固定します。これは準備の最も難しいステップです。プロセスを急がないでください。チューブのもう一方の端を、20個の三方バルブのネットワークで構成され、一度に2つの金型を処理できる圧力調整窒素タンクのセットアップに取り付けます。セットアップを使用して、0.5〜1PSIで少なくとも6時間、金型に溶液を吹き込みます。まず、BS-3で調製したばかりの一本鎖DNA溶液をステンレス鋼ピンを通してポリエチレンチューブに吸引します。次に、PDMSモールドを窒素源に結合し、バーコードモールドに約40分間、またはすべてのチャネルが充填されるまで溶液を流します。次に、流れを止め、金型を室温で2時間インキュベートします。数時間後、バーコード型を摂氏75度で1時間焼きます。焼き上がったら、型をスライドから取り外し、01%SDSでスライドをやさしく洗います。その後、スライドを超純水で3回洗います。洗濯後、スライドスピナーを使用してバーコードスライドを乾燥させます。乾いたら、バーコードスライドを清潔な50ミリリットルのチューブに保管します。続行するには、テキスト プロトコルに従って 1 次元パターンを検証します。バリデーション手順を実行するには、スライドをブロックし、シアニン3つの相補的DNAをハイブリダイズし、結果を測定します。3 x 3アレイ用のSU-8マスターは、最初の設計のフローパターンに垂直なフローパターンを持っています。前述の方法を使用して、このパターンの新しいPDMSモールドを作成します。まず、9種類のオリゴヌクレオチドを新たに濃縮します。次に、3%のBSAブロッキング溶液をアレイスライドの20チャンネルすべてに0.5〜1PSIで1時間流します。次に、DNA溶液をそれぞれのチャネルにロードします。それらを約40分間流した後、スライドを室温で2時間インキュベートし、DNAがハイブリダイズするのを待ちます。次に、3%のBSAブロッキング溶液を20のチャネルすべてに1時間流します。これにより、ハイブリダイズされていないDNAが除去されます。次に、PDMSからアレイスライドをはがし、スライドを3%BSAに一度浸します。次に、スライドをPBSに2回浸し、続いて2%PBSに1回浸します。次に、前と同様に、顕微鏡スライドスピナーを使用してスライドを乾燥させます。続行するには、1 次元スライドの検証と同様の検証手順を実行します。オリゴヌクレオチドを1プライムから9プライムまで、すべてシアニン3に結合させて使用します。3×3アレイスライドは、後で使用するために50ミリリットルの遠心分離管に保存します。テキストプロトコールでは、DNAアレイを抗体アレイに変換する方法がさらに説明されています。抗体-オリゴコンジュゲートを調製および精製した後、マイクロチャンバーを備えた別のPDMSモールドを調製します。詳細については、テキストを参照してください。この金型をアレイスライドと合致します。次に、スライドを1%BSAでブロックし、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション中に、200マイクロリットルの抗体 - オリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製します。ブロック後、抗体-オリゴカクテルをセットアップに加えます。抗体をアレイ上で摂氏37度で1時間インキュベートし、スライドを洗浄して乾燥させてから、テキストプロトコルに記載されているスライドディップに進みます。記載されたプロトコルに従った後、3×3アレイを用いて、得られた抗体パネルを、主にサンドイッチELISAプラットフォームによるマルチプレックス検出に使用した。タンパク質は、スライドガラスの一方の端からもう一方の端まで10%未満の変動を示しました。3 x 3アレイでは、最大7つのタンパク質を、シアニン3で標識されたリファレンスとネガティブコントロールとともに検出できます。腫瘍研究のために行われたシングルセル実験では、6つのタンパク質がすべて同時に検出されました。キャリブレーションのために、組換えタンパク質をさまざまな濃度のアレイに適用しました。検出感度は、従来のサンドイッチELISAと非常によく似ていました。この手順を試行する際は、PDMSの金型に粒子状物質が付着しないように注意することが重要です。チャネルにほこりが付着すると、アレイの均一性が低下し、感度が低下する可能性があります。その開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が腫瘍微小環境のモデルを使用して細胞間シグナル伝達を探索する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、その後、表面抗原（DotScan...

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。...

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本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。...

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

細胞機能上の微小環境の分子組成の影響についての洞察を得るためのコンビナトリアル機能的スクリーニング方法が記載されている。この方法は、細胞接着および機能解析をサポートしていることを定義したコンビナトリアル微小環境の配列を生成するために、既存のマイクロアレイベースの技術を活用しています。...

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プリンテッド糖鎖アレイによる循環型抗糖鎖抗体の検出

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抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

この動画では、抗体マイクロアレイチップを用いて環境試料中のシアノバクテリア株を検出する方法を実演しています。さまざまな細菌を運ぶサンプルは、印刷された抗体と相互作用し、蛍光色素標識抗シアノバクテリア株抗体による免疫染色は、異なるスポットでの蛍光を通じて特定のシアノバクテリア株の存在を明らかにします。...

抗体マイクロアレイチップを用いたシアノバクテリア株検出技術

人間が消費する淡水貯留層にシアノバクテリア毒素が存在することは、水管理当局にとって大きな懸念事項です。水質汚染のリスクを評価するために、この記事では、抗体マイクロアレイチップを使用して、液体および固体サンプル中のシアノバクテリア株を野外で検出するためのプロトコルについて説明します。...

検出するための実験プロトコールシアノバクテリア抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm)、単一セルの絶対蛋白質量を決定できる液滴アレイ ・ ベース メソッドをご紹介します。ひと癌細胞における癌抑制タンパク質 p53 の発現の多様性を特徴付けるための Adm...

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我々は、異なるウイルス株から250以上の抗原に対して複数の抗体アイソタイプの血清を同時にプローブするために、ニトロセルロースコーティングされたスライドにインフルエンザ抗原を印刷することによって構築されたタンパク質マイクロアレイを使用するためのプロトコルを提示し、したがって、ウイルスサブタイプ間の血清抗体の幅の測定を可能にする。...

インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

学ぼう、フローパターンガイドを用いた高密度バーコード抗体マイクロアレイの作製法。SU-8マスターとPDMSモールドを活用し、単一細胞から分泌タンパク質と細胞内タンパク質を同時検出するカスタマイズ可能な手法を解説する。

高密度バーコード抗体マイクロアレイのフローパターンガイド作製

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