January 6th, 2016
このプロトコルは、細胞シグナル伝達研究やバイオマーカー検出の潜在的なアプリケーションと大規模の製造、多重化された二次元のDNAまたは抗体配列を、概要を説明します。
この方法論の全体的な目標は、シングルセル解析に応用できる抗体アレイを作製することです。この方法は、同じシングルセルから秘密タンパク質と細胞内タンパク質を同時に検出する方法など、シングルセル解析の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。そして、その目標を達成するために、マイクロアレイプラットフォームをどのように作製できるのでしょうか。
この手法の主な利点は、カスタマイズ可能であることです。フローパターニング戦略を変えることで、さまざまな次元の配列を作成できます。事前に、バーコードフローパターンのSU-8マスターを生成します。
手順はテキストプロトコルで提供されます。これには、クロームフォトマスクの設計と作成が含まれます。フォトレジストコートにマスクをセットし、UVを塗布することでパターンが得られます。
PDMSバーコード金型の準備を開始するには、40グラムのシリコンエラストマーベースと4グラムの硬化剤を組み合わせ、10分間激しく攪拌します。次に、プレポリマー溶液を真空下で20分間脱気します。次に、バーコードパターンのSU-8マスターでシリコンウェーハを入れたシャーレに溶液をロードします。
溶液を7.45ミリメートルの深さまで注ぎます。次に、皿内の混合物を脱気して、残っている気泡を取り除きます。脱気に続いて、混合物を摂氏75度で1時間焼き、PDMSを硬化させます。
次にメスで切り取り、バーコード型を丁寧に取り出します。次に、ウェーハからスラブを慎重に剥がします。次に、スラブの端をトリミングして、金型の目的の形状にします。
プランジャー付きの生検パンチを使用して、入口と出口を表すパターン上の円形の特徴に半ミリメートルの穴を開けて、型を仕上げます。ポリ-L-リジンを塗布したスライドガラスに付着したホコリを窒素ブローガンで吹き飛ばした後、PDMSモールドをスライドに取り付けます。金型の端をスライドに慎重に合わせます。
次に、アセンブリを摂氏75度で90分間焼き、PDMSとスライドの間の結合を強化します。その間、入口と出口に20個の柔軟なポリエチレンチューブを準備します。チューブの各部分に、直径1mmのステンレス鋼の中空ピンを取り付けます。
次に、ピンを介して、センチメートルメートル以上のポリ-L-リジンを長さに充填します。ガラスに接着したら、ピンを金型の入口に慎重に固定します。これは準備の最も難しいステップです。
プロセスを急がないでください。チューブのもう一方の端を、20個の三方バルブのネットワークで構成され、一度に2つの金型を処理できる圧力調整窒素タンクのセットアップに取り付けます。セットアップを使用して、0.5〜1PSIで少なくとも6時間、金型に溶液を吹き込みます。
まず、BS-3で調製したばかりの一本鎖DNA溶液をステンレス鋼ピンを通してポリエチレンチューブに吸引します。次に、PDMSモールドを窒素源に結合し、バーコードモールドに約40分間、またはすべてのチャネルが充填されるまで溶液を流します。次に、流れを止め、金型を室温で2時間インキュベートします。
数時間後、バーコード型を摂氏75度で1時間焼きます。焼き上がったら、型をスライドから取り外し、01%SDSでスライドをやさしく洗います。その後、スライドを超純水で3回洗います。
洗濯後、スライドスピナーを使用してバーコードスライドを乾燥させます。乾いたら、バーコードスライドを清潔な50ミリリットルのチューブに保管します。続行するには、テキスト プロトコルに従って 1 次元パターンを検証します。
バリデーション手順を実行するには、スライドをブロックし、シアニン3つの相補的DNAをハイブリダイズし、結果を測定します。3 x 3アレイ用のSU-8マスターは、最初の設計のフローパターンに垂直なフローパターンを持っています。前述の方法を使用して、このパターンの新しいPDMSモールドを作成します。
まず、9種類のオリゴヌクレオチドを新たに濃縮します。次に、3%のBSAブロッキング溶液をアレイスライドの20チャンネルすべてに0.5〜1PSIで1時間流します。次に、DNA溶液をそれぞれのチャネルにロードします。
それらを約40分間流した後、スライドを室温で2時間インキュベートし、DNAがハイブリダイズするのを待ちます。次に、3%のBSAブロッキング溶液を20のチャネルすべてに1時間流します。これにより、ハイブリダイズされていないDNAが除去されます。
次に、PDMSからアレイスライドをはがし、スライドを3%BSAに一度浸します。次に、スライドをPBSに2回浸し、続いて2%PBSに1回浸します。次に、前と同様に、顕微鏡スライドスピナーを使用してスライドを乾燥させます。
続行するには、1 次元スライドの検証と同様の検証手順を実行します。オリゴヌクレオチドを1プライムから9プライムまで、すべてシアニン3に結合させて使用します。3×3アレイスライドは、後で使用するために50ミリリットルの遠心分離管に保存します。
テキストプロトコールでは、DNAアレイを抗体アレイに変換する方法がさらに説明されています。抗体-オリゴコンジュゲートを調製および精製した後、マイクロチャンバーを備えた別のPDMSモールドを調製します。詳細については、テキストを参照してください。
この金型をアレイスライドと合致します。次に、スライドを1%BSAでブロックし、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション中に、200マイクロリットルの抗体 - オリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製します。
ブロック後、抗体-オリゴカクテルをセットアップに加えます。抗体をアレイ上で摂氏37度で1時間インキュベートし、スライドを洗浄して乾燥させてから、テキストプロトコルに記載されているスライドディップに進みます。記載されたプロトコルに従った後、3×3アレイを用いて、得られた抗体パネルを、主にサンドイッチELISAプラットフォームによるマルチプレックス検出に使用した。
タンパク質は、スライドガラスの一方の端からもう一方の端まで10%未満の変動を示しました。3 x 3アレイでは、最大7つのタンパク質を、シアニン3で標識されたリファレンスとネガティブコントロールとともに検出できます。腫瘍研究のために行われたシングルセル実験では、6つのタンパク質がすべて同時に検出されました。
キャリブレーションのために、組換えタンパク質をさまざまな濃度のアレイに適用しました。検出感度は、従来のサンドイッチELISAと非常によく似ていました。この手順を試行する際は、PDMSの金型に粒子状物質が付着しないように注意することが重要です。
チャネルにほこりが付着すると、アレイの均一性が低下し、感度が低下する可能性があります。その開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が腫瘍微小環境のモデルを使用して細胞間シグナル伝達を探索する道を開きました。
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このプロトコルは、単一細胞分析への応用を持つカスタマイズ可能な抗体アレイの製作を概説します。同一の単一細胞から分泌および細胞内タンパク質を同時に検出することを目的としています。
High-density barcode antibody microarrays fabricated via flow-patterning enable multiplexed protein detection at single-cell resolution, addressing critical needs in early discovery and translational research. This platform supports simultaneous analysis of secreted and intracellular proteins, enhancing mechanistic de-risking and predictive confidence for target validation. The customizable, miniaturized format facilitates integration into diverse R&D workflows, supporting portfolio-wide biomarker and signaling studies.
This barcode microarray technology integrates from early discovery through lead identification and translational research, supporting multiplexed protein analysis in single-cell and tissue models.