モデル化学療法抵抗性白血病インビトロ

この手順の全体的な目標は、in vitro で抵抗性急性リンパ芽球性白血病 (ALL) をより適切にモデル化することです。この方法は、難治性ALLの治療において、骨髄微小環境がALL細胞化学療法抵抗性にどのように影響するかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の動物モデルを使用して難治性ALL細胞の薬物アドボカシーを調べるよりも、かなり安価で時間もかからないことです。

腫瘍特異的培養液10ミリリットル中の10〜6回目の白血病細胞を、80〜90%コンフルエントな骨髄間質細胞または骨芽細胞の100ミリメートルプレートに播種することから始めます。4日ごとに、プレートを横に傾け、接着細胞層を乱さないように注意しながら、培地の1ミリリットルを除くすべてを吸引します。次に、9ミリリットルの新鮮な白血病細胞培養培地をプレートの側面に沿ってプレートの角に慎重に滴下して、接着細胞の破壊を最小限に抑えます。

共培養の12日目以降、培地をプレート上で約5〜10回静かに上下にピペットで動かし、浮遊白血病細胞を収集します。そして、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、先ほど示したように、80〜90%のコンフルエントな骨髄間質細胞、または骨芽細胞の新しいプレートに細胞を再播種します。

4日目までに、白血病細胞の3つの亜集団が形成され、懸濁した白血病細胞が培地中に自由に浮遊します。Phase Bright白血病細胞は接着細胞単層の表面に付着し、Phase Dim白血病細胞は単分子膜の下を移動しました。G10ビーズカラムを調製するには、まず、1カラムあたり30ミリリットルの細胞培養培地を水浴中で摂氏37度に再加温します。

次に、ピンセットを使用してグラスウールを細くて緩いストランドに引っ張ります。また、必要なカラムごとに1つの10ミリリットルシリンジに、軽く充填したストランドの複数の層を追加します。シリンジが2/3いっぱいになったら、閉じた位置で一方向活栓を先端に取り付け、clamp シリンジをリングスタンドに十分に高く取り付けます 50ミリリットルの円錐形のコレクションチューブを活栓の下に配置できます。

次に、シリンジカラムの下に収集チューブを置きます。また、10ミリリットルのピペットを使用して、グラスウールの上にPBSに懸濁したG10粒子の滴を追加します。2ミリリットルのペレットが形成されるまで、G10粒子を追加し続けます。

次に、予め温めた培地の2ミリリットルのアリコートをカラムに加えます。そして、ストップコックバルブをゆっくりと開き、媒体がカラムから滴下するようにします。10ミリリットルの媒体がカラムから完全に排出されたら、活栓を閉じます。

フロースルーを廃棄し、新しい収集チューブをカラムの下に置きます。懸濁した腫瘍亜集団を採取するには、白血病細胞共培養プレートから培地を吸引し、同じ培地を使用してプレートを1回穏やかにすすぎます。次に、浮遊懸濁白血病細胞亜集団を15ミリリットルの円錐管に移します。

Phase Bright腫瘍亜集団を採取するには、10ミリリットルの新鮮な培地を共培養プレートに戻します。そして、接着性白血病細胞を剥離させることなく、付着性白血病細胞を除去するのに十分なほど約5倍強力にすすぎます。次に、Phase Bright亜集団を独自の15ミリリットルの円錐管に移します。

Phase Dim腫瘍亜集団を採取するには、1ミリリットルのPBSリンスで残りの培地を取り除きます。そして、摂氏37度で3ミリリットルのトリプシンで細胞を切り離します。5分後、プレートの側面を軽くたたいて付着細胞を取り除き、続いて1ミリリットルのFBSを添加して酵素反応を停止します。

次に、血清を3〜5回すすぎ、大きな細胞凝集体を分解します。そして、未精製のPhase Dim亜集団を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。すべての亜集団が収集されたら、細胞をスピンダウンします。

そして、各ペレットを1ミリリットルの予熱した培地に再懸濁します。ストップコックを完全に閉じた状態で、各亜集団について、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、準備されたG10カラムの1つの上部に1ミリリットルの細胞容量全体を滴下し、細胞がG10ペレットの上または中に留まることを確認します。細胞をG10ペレット上で室温で20分間インキュベートします。

次に、1〜3ミリリットルの新鮮な温めた培地をカラムに加えます。そして、活栓を開いて、媒体がゆっくりと柱から滴下するようにします。予熱した培地を1〜2ミリリットル刻みでカラムに続けて追加します。

合計15〜20ミリリットルの白血病細胞が採取されたら、活栓を閉じ、採取チューブにキャップをします。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを適切なダウンストリーム分析バッファーに再懸濁します。接着細胞層のトリプシン処理に続いて、前方散乱光と側方散乱光解析により、2つの異なる細胞集団が観察されます。

G10分離後、すべての細胞の純粋な集団が回収されます。特に興味深いことに、骨髄間質細胞または骨芽細胞共培養から回収されたすべてのPhase Dim細胞は、細胞傷害性化学療法への曝露後にほとんどまたはまったく死滅を示さない。これらの手順を試みる際には、白血病細胞に発生する可能性のある表現型の変化を減らすために、これらの手順をできるだけ適切に実行することを覚えておくことが重要です。

この手法は、白血病研究の分野の研究者が、骨髄微小環境により近いin vitroモデルで化学療法抵抗性白血病をモデル化する方法を提供します。