携帯マイトファジーのマーカーとしてEYFP-パーキン集計の評価のためのタイムラプスビデオ顕微鏡

このタイムラプスビデオ顕微鏡法の全体的な目的は、ミトコンドリア自食作用（マイトファジー）のプロセスにおいて、Parkinが介在する損傷ミトコンドリアの選択的な除去を追跡することです。この手法は、マイトファジーが持続的な病理学的状態にどのように影響するかなど、分子代謝分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、分子プロセスにおける標識タンパク質のダイナミクスを追跡するための非常に強力なツールを提供できることです。

この手法は、ミトコンドリアのライフサイクルに関する知見を提供することができます。また、初代細胞培養や胚発生研究、優先順位の予測など、他の系にも適用可能です。本研究で使用した不死化マウス胚性線維芽細胞は、5% 二酸化炭素を含む加湿雰囲気下、37 °Cの条件下で、10 cm組織培養プレート上の完全DMEM培地にて培養されています。

細胞のコンフルエンシーが80%に達したとき、滅菌吸引で培地を除去し、10 mLの滅菌PBSを添加します。PBSを除去し、0.25% Trypsin EDTAを1 mL添加します。細胞が剥離するまで、プレートを37 °Cで2〜3分間インキュベートします。

完全DMEM培地を4 mL加え、細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターで計数するために、細胞懸濁液を10 µL分取します。10 cm組織培養ディッシュに1×10⁶個の細胞を播種し、24時間インキュベートします。

翌日、細胞をPBSで1回洗浄し、前述の方法に従ってトリプシン処理により細胞を剥離させます。4 mLの完全DMEM培地を加え、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。250 g、4 °Cで5分間、遠心分離します。

上清を捨て、ペレットを1 mLの滅菌PBSで再懸濁します。細胞を再度遠心分離します。2回目の遠心分離後、上清を捨てます。

100 µLのエレクトロポレーション用溶液ミックスを細胞ペレットに加え、ピペッティングによってペレットを穏やかに再懸濁させます。次に、細胞懸濁液に2 µgのEYFP Parkin発現プラスミドと1 µgのDsRed2 Mito発現プラスミドを添加します。使い捨てパストールピペットを用いて、溶液を滅菌キュベットに移します。

プリセットプログラムを用いて細胞にエレクトロポレーションを行います。エレクトロポレーションの直後、あらかじめ加温した新鮮な完全DMEM培地 500 µLを細胞に添加し、6 cmのライブイメージング用組織培養プレートに細胞を播種します。

5% 二酸化炭素を含む加湿条件下、37°Cで24時間、細胞をインキュベートします。本手順を開始する前に、顕微鏡チャンバーの温度を37°Cに設定しておきます。次に、10% FBS、2 mmol/L L-Glutamine、100 U/mL ペニシリン、および 100 mg/mL ストレプトマイシンを添加したフェノールフリーDMEMを混合し、専用のライブイメージング培地を調製します。

培地をウォーターバスで37 °Cに予熱します。エレクトロポレーション後の細胞の培地を滅菌吸引で除去し、予熱したライブイメージング用培地を1 mL加えます。プレートを37 °Cで30分間インキュベートします。

顕微鏡のチャンバーが37 °Cの安定した温度であることを確認した後、5%の二酸化炭素をチャンバー内に導入します。大きな動きや振動を与えないよう注意しながら、エレクトロポレーション済みの細胞を含むプレートを顕微鏡のチャンバー内に設置します。

ソフトウェアインターフェースを使用して、EYFP ParkinおよびDsRed2 Mito発現ベクターによってコードされる融合タンパク質からの蛍光信号を検出するように顕微鏡を設定します。タイムラプスビデオ顕微鏡ソフトウェアを開きます。上部メニューで、EYFP ParkinにはFITCを、DsRed2 MitoにはRhodamineを選択します。

倍率を20Xに設定します。ソフトウェアのインターフェースを使用して、共導入した両方のベクターを発現している単一の細胞を探し、その位置を記録します。この操作を、すべての実験条件において最低10個の細胞に対して行います。

メニューの「Apps」を選択し、「Multi Dimensional Acquisition」をクリックします。「Multi Dimensional Acquisition」ウィンドウで、撮影回数、撮影間隔、記録する細胞の位置など、必要なパラメータを選択します。「Acquire」をクリックして、両方の蛍光信号のベースライン撮影を開始します。

5分ごとに画像を収集し、合計15分間の間隔で撮影します。画像取得が行われている間に、最終作業濃度の2倍の濃度のCarbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone（FCCP）を含む、あらかじめ温めておいたライブイメージング用培地を準備します。画像取得プロセスを中断し、FCCPを含む温めたライブイメージング用培地1 mLを、顕微鏡チャンバー内のプレートに緩やかに加えます。

FCCPを添加した後、画像取得を再開する前に顕微鏡のピントを再調整することが重要です。前述の手順に従って取得プロセスを再開し、記録した位置を用いて計3時間画像を収集します。画像取得が完了したら、後の解析のために取得したすべての画像を保存してください。

ここでは、FCCP投与前の線維芽細胞におけるEYFP-ParkinおよびDsRED2-Mitoの蛍光信号のタイムラプス画像を示しています。白い枠は、右側の各パネルで拡大して表示している領域を表しています。基底状態の時点では、緑色で可視化されているEYFP-Parkinが細胞全体に均一に拡散しています。

赤色で可視化されたミトコンドリアネットワークは、白矢印で示されるように、良好に相互接続しているように見えます。FCCP投与後、膜脱分極によるミトコンドリアの断片化が5分後に観察されます。しかしながら、EYFP-Parkinは依然として細胞質全体に均一に拡散しています。

FCCP投与から55分後、EYFP-Parkinが損傷したミトコンドリア膜にリクルートされ、ミトファジープロセスが誘発されます。FCCP投与後にEYFP-Parkinがミトコンドリア膜へ移動する様子を、この代表的なタイムラプス動画で示しています。この手法に習熟し、適切に実施できれば、2時間で完了させることが可能です。

この手法の開発により、オートファジー分野の研究者がミトコンドリアのリサイクルを実験的に検証することが可能となりました。これにより、細胞内におけるミトコンドリアの品質管理としてのマイトファジーのプロセスを研究することが可能になります。