虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

この手順の全体的な目標は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによる定量化と表現型特性評価のために、虚血性マウス脳から免疫細胞を単離することです。マルチカラーフローサイトメトリーによる脳内の虚血後炎症の解析により、脳卒中の病変の進行、修復、および全体的な結果に関与する免疫学的プロセスを深く理解することができます。この手順の主な利点は、迅速な1ステップの密度勾配遠心分離であり、これにより虚血性マウスの脳から多数の生存免疫細胞を単離できます。

この技術の適用は、脳卒中のより広い時間枠で適用できる新しい免疫調節治療戦略の同定と検証を目標としています。まず、蠕動灌流ポンプチューブの一端を、氷のように冷たいカルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSに浸します。鈍い23ゲージの針をチューブのもう一方の端に固定します。

そして、ポンプのスイッチを入れて、チューブにHBSSを完全に充填します。次に、安楽死させたマウスをプラスチックトレイに埋め込まれた解剖ボードに背側に置き、前足と後足をできるだけ広く伸ばして20ゲージの針で固定します。一対のまっすぐな、1つずつの歯の鉗子を使用して腹部の皮膚をつかみ、鋭い虹彩はさみで外皮と腹壁を横方向に切開して肝臓を露出させます。

次に、胸骨を持ち上げ、鋭利で鈍いアイリスハサミの鈍い刃を使用して横隔膜を切開します。肺動脈、心臓動脈、胸動脈を傷つけないように注意しながら、尾頭蓋方向の両側の外側胸郭を引き続き切断し、鈍い鉗子を使用して皮膚のフラップにフィットさせます。フラップを解剖ボードに固定し、心臓を結合組織から慎重に分離します。

鈍い鉗子で心臓を保持し、灌流チューブの端にある23ゲージの針の先端を左心室の頂点に挿入し、脳室中隔を傷つけないように注意します。鋭利な虹彩ハサミを使用して、右心房を切開し、ポンピング内に気泡が形成されないように注意しながら、すぐにポンプを始動します。肝臓が淡いコーヒー色になったら、まっすぐな手術用ハサミを使用して、頭蓋骨のすぐ後ろにあるマウスの首を切り落とします。

次に、虹彩はさみを使用して、頭皮に正中線を切開します。頭蓋骨が見えたら、鋭利な虹彩ハサミの先端を大孔に挿入し、骨に横切開を行います。反対側で切開を繰り返します。

次に、鋭利なアイリスハサミを使用して、同じ空洞から正中線を上って鼻に向かって慎重に切り取ります。細い鉗子を使用して、各脳半球から頭蓋骨をそっと剥がします。次に、へらで脳を持ち上げ、鋭い虹彩はさみを使用して、頭蓋骨に固定している脳神経線維を慎重に解剖します。

氷の上にカルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSが入った15ミリリットルのチューブに脳を入れます。脳組織を単一の細胞懸濁液に解離するには、まず、きれいなカミソリの刃を使用して、脳幹と脳小骨を慎重に除去します。次に、別のきれいなカミソリの刃を使用して脳を半宗し、冠状面に沿って各半球をほぼ同じサイズの3つの部分に切断します。

5ミリリットルの注射器のプランジャーエンドを使用して、100ミクロンの細胞ストレーナーで脳組織の断片をつぶし、カルシウムとマグネシウムを含む氷冷HBSSでストレーナーを連続的にすすぎます。次に、均質化された組織を氷の上に置きます。すべてのサンプルが処理されたら、細胞懸濁液をスピンダウンし、上清を慎重に廃棄します。

ペレットを1ミリリットルの消化緩衝液に再懸濁します。次に、細胞懸濁液を2ミリリットルのチューブに移し、摂氏37度のゆっくりとした連続回転下で細胞をインキュベートします。1時間後、70ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をふるいにかけ、DNaseを含む3ミリリットルの洗浄緩衝液でフィルターを十分にすすいでください。

次に、15ミリリットルのDNaseフリー洗浄バッファーでストレーナーを洗浄し、細胞をスピンダウンして、上清を廃棄します。細胞の破片とミエリンを除去するには、細胞を5ミリリットルの室温、25%密度のグラジエント培地に再懸濁し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を勾配で十分に混合し、穏やかなピペッティングを繰り返します。

次に、細胞溶液をスピンダウンします。分離の最後に、ペレットを乱さずにミエリンコートと上清を慎重に吸引し、細胞を10ミリリットルのDNaseフリー洗浄バッファーに再懸濁します。細胞を15ミリリットルのチューブに移し、再びスピンダウンし、ペレットを100マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。

次に、トリパンブルー排除によって生細胞の数を数え、摂氏4度で保存します。免疫染色を開始する前に、抗マウスCD26/CD32 Fc受容体ブロッキング試薬を使用して細胞を摂氏4度で10分間インキュベートし、非特異的結合を防ぎます。次に、目的の蛍光色素標識一次抗体を摂氏4度で暗所で20分間添加します。

インキュベーションの終了時に、2ミリリットルのフローサイトメトリーバッファーで細胞を洗浄します。スピンダウン。ペレットを200マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析までサンプルを摂氏4度で保存します。

ビーズカウントによって浸潤する免疫細胞の絶対数を定量するには、正確に40マイクロリットルのフローサイトメトリーと10マイクロリットルの細胞懸濁液を、既知の数の蛍光ビーズを含むカウントチューブにリバースピペットします。次に、細胞およびビーズ懸濁液をFITC標識CD45抗体と摂氏4度で暗所で20分間インキュベートした後、計数チューブに200マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーを逆充填します。その後、すぐにサンプルをフローサイトメーターで分析し、ビーズとCD45陽性細胞イベントを記録します。

中大脳動脈閉塞の24時間後、脳浸潤性白血球はCD45-high発現によって同定できます。CD45高分子集団内では、多形核好中球はLY-6G発現によって同定され、Tリンパ球はCD45高、CD3陽性の細胞表面表現型を示します。残りのCD45高細胞は、それらのCD19およびCD11bの発現によってさらに区別することができる。

一方、CD11b陽性画分は、Ly-6C-高炎症性単球と、単球、マクロファージ、および樹状細胞集団を包含するLy-6C-低集団にサブカテゴリ化できます。脳卒中の急性期では、Ly-6G陽性好中球は血管閉塞後に急速に脳に入ります。対照的に、虚血性半球のCD3陽性T細胞の頻度は、偽手術の脳や反対側の半球と比較して減少します。

CD11b陽性集団内では、脳虚血はバランスをLy-6C高炎症性単球の強い優勢にシフトします。さらに、梗塞性半球の総白血球数は、中大脳動脈閉塞の 24 時間後に、対側半球および偽手術の脳と比較して有意に増加します。このビデオを見れば、機械的断片化、酵素消化、密度勾配遠心分離によって虚血性脳から免疫細胞を単離する方法、およびフローサイトメトリーによってこれらの細胞を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。

このテクニックは、一度マスターすれば4時間で完了することができます。この手順を試みる際には、細胞全体の収量が脳組織の完全な解離に大きく依存することを覚えておくことが重要です。さらに、脳浸潤白血球が非炎症性循環免疫細胞で汚染されるのを防ぐためには、十分な経心灌流が必要です。

この手順に続いて、遺伝子発現アッセイやサイトカインプロファイル分析などの他の方法を実行して、虚血性脳卒中の状況における異なる免疫膿瘍の機能的関連性について追加の洞察を得ることができます。