Name: 虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学ぶ虚血性マウス脳から免疫細胞を単離しフローサイトメトリーで解析する手法。密度勾配遠心分離で高収率に生細胞を得られ、脳虚血後の炎症反応と免疫細胞動態を詳細に解析できる。

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著者らは、優れた技術サポートのためのイザベル・シュルツに感謝します。

全ての動物実験は、動物のケアのために応じて標準に準拠する必要があります（ 例えば 、米国国立衛生研究所、NIH公開番号85-23によって公開実験動物の管理と使用に関する指針は、1996年改訂）し、承認されなければなりません適切な状態当局による。 試薬の調製<ol><li>消化緩衝液（半球あたり1ミリリットル）：カルシウム（Ca）とマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液中でミリリットル2U /（HBSS）の濃度に低サーモリシン濃度（TL）と、例えば 、リベラーゼを精製した消化酵素の標準化された混合物を溶解マグネシウム（Mg） </li><li> DNアーゼでの洗浄バッファーは：HBSSで666U / mlの濃度にDNアーゼIを溶解（カルシウム/マグネシウムを含まない）ウシ胎児血清を10％含む（FCS） </li><li> DNアーゼのない洗浄緩衝液：HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）10％のFCSを含みます</li><li>密度勾配媒体（半球あたり5 ml）を：準備ストック等張密度勾配0;一部1.5 M塩化ナトリウムで密度勾配媒体九部を混合し、培地（100％SIP）。 FCSの3％を含有するHBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）の適切な量を添加することによって25％の密度にSIPを希釈</li><li>フローサイトメトリー（FC）バッファ：FCSの3％を含有する準備リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </li></ol> 2.一過中大脳動脈閉塞注：18の12週齢の雄のC57BL / 6マウスに、前述のように管腔内縫合技術を介して過渡中大脳動脈閉塞（MCAO）を行いました。 <ol><li>簡潔には、100％酸素中の2.0％イソフルランでマウスを麻酔。 36.5℃の体温を維持するフィードバック制御加熱装置により0.5℃、±。 </li><li>総頸動脈と外頸動脈の結紮した後、中央のCの原点に総頸動脈、事前にそれを標準化されたシリコンゴムコーティングされたモノフィラメントを紹介erebral動脈。 </li><li> 45分後の再灌流を可能にするために、フィラメントを削除します。偽手術動物では、すぐに虚血を回避するために、中大脳動脈を閉塞した後、フィラメントを撤回。 </li></ol> 3. Transcardial灌流および脳解剖<ol><li>氷冷HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）にチューブの一端を浸漬することにより、蠕動灌流ポンプを準備します。灌流チューブの他端に鈍23 G針を修正し、完全にHBSS（カルシウム/マグネシウムを含まない）でチューブを埋めるためにポンプのスイッチを入れます。 </li><li>深く4％イソフルランでマウスを麻酔し、CO 2吸入によって安楽死させます。 </li><li>プラスチックトレイに埋め込まれた解剖ボード上でマウスの背側を置きます。スプレッドフォアとできるだけ広いと20 G針で解剖ボード上でそれらを修正後足。 </li><li>ストレート1×2歯鉗子でつかみ、腹部の皮膚および外皮と腹壁を通して横切開を作り、公開するためにシャープアイリスはさみを使用肝。 </li><li>胸骨を持ち上げて、シャープ/鈍いアイリスはさみの鈍い刃で振動板を切開。 caudocranial方向の両側に横方向胸郭をカットし続けます。肺、心臓および胸部動脈を傷つけないように注意してください。 </li><li>鈍鉗子で皮膚弁を持ち上げて、解剖ボードにピン。慎重に結合組織から心臓を分離するために平滑末端鉗子とハサミを使用してください。 </li><li>平滑末端鉗子で心を持ち、左心室の頂部に取り付けられた灌流チューブと鈍い23Gの針の先端を挿入します。注：心室中隔の損傷を避けるために、左心室にすぎ針を挿入しないでください。必要に応じて、ストレート鋭いピンセットで所定の位置にカニューレを固定します。 </li><li>シャープアイリスはさみで右心房を切開し、直ちにポンプ（流量：8〜10ミリリットル/分）をオンにします。 </li><li>肝臓は、光のコーヒー色（HBSSの〜30ミリリットル）を示すまで灌流を続けます。ずっと灌流は、慎重にチューブ内の任意の気泡の形成を避けます。 </li><li>ちょうど頭蓋骨の後ろにまっすぐ手術用ハサミでマウスを刎ねます。頭蓋骨を露出するように頭皮の正中切開を作るために、虹彩のはさみを使用してください。 </li><li>大後頭孔にシャープアイリスはさみ1先端を置き、頭蓋骨の中に横方向に切断しました。もう一方の側について、この手順を繰り返します。 </li><li>慎重に鼻に向かって正中線まで同キャビティからカットするシャープアイリスはさみを使用してください。脳の損傷を避けるために、可能な限り表面的なはさみの終わりを保つようにしてください。 </li><li>静かに各脳半球から頭蓋骨を剥離する微細な鉗子を使用してください。注：梗塞組織は髄膜や頭蓋骨に付着することがあります。無謀な解剖に脳組織を失わないように注意してください</li><li>へらで脳を持ち上げ、慎重に頭蓋骨にそれを修正脳神経線維を分析するためにシャープアイリスはさみを使用しています。 HBSS（+のCa / Mg）を10mlで満たされた15ミリリットルチューブに脳を置き、それがね保ちますhortly氷の上。 </li></ol>単一細胞懸濁液への脳組織の4解離<ol><li>慎重にきれいなかみそりの刃で脳幹や小脳を削除します。脳を二等分するとほぼ同じ大きさの3枚に前頭面に沿って各半球を切断するためにきれいなカミソリの刃を使用してください。 </li><li>ミンスは5ミリリットルの注射器のプランジャ端部を使用して、100μmのセルストレーナーを介して各半球の組織を解剖しました。連続して氷冷HBSS（+のCa / Mg）を持つセルストレーナーをすすぎます。氷上で均質化したサンプルを保管してください。 </li><li> 5分間286×gで4℃で遠心し、慎重に上清を捨てます。消化緩衝液1ml中にペレットを再懸濁し、2mlチューブに懸濁液を移します。 37℃で1時間ゆっくりと連続回転の下でサスペンションをインキュベートします。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを介してふるい細胞懸濁液およびDNアーゼを含まない洗浄緩衝液15mlを、続いてのDNAseを含む洗浄緩衝液3mlでよくすすぎます。 286×gで遠心分離し、5分間18℃、上清を捨てます。注：注：DNアーゼの使用は、細胞の生存を危うくする細胞凝集につながる可能性がある細胞溶解に起因するDNAの粘液を排除します。 </li></ol>ミエリンおよび細胞破片の除去のための5密度勾配遠心<ol><li> 25％の密度勾配培地5ml中に再懸濁し、細胞ペレットを、15 mlチューブに懸濁液をピペット。バブルの形成を回避繰り返し、穏やかにピペッティングすることによって十分に混合します。注：密度勾配培地は、細胞凝集を防止するために室温で使用されるべきです。 </li><li> 521×gで遠心分離し、20分間、18°C。ロータの最低加速プロファイルを使用して、ローターがブレーキなしで停止することができます。静かに振盪せずに遠心分離機からチューブを外します。チューブの底に細胞ペレットを保存しながら注意深くミエリンコートし、上清を吸引します。注：残ったとして全体ミエリンコートを削除することを確認してくださいimpaiますRフローサイトメトリー分析。 </li><li> DNアーゼフリーの洗浄緩衝液10mlにペレットを再懸濁し、新しい15mlチューブにサスペンションをピペット。注：密度勾配媒体の十分な除去が著しく最終細胞試料の量と質に寄与するので、この洗浄工程は、重要です。 </li><li>遠心分離し、再び5分間、286×gで、10℃で、上清を捨てます。冷たい洗浄用緩衝液100μl中で細胞を再懸濁し、血球計数器で、トリパンブルー排除によって細胞数及び生存率を決定します。 4°C、さらにプロセスすぐにそれらで保存するサンプル。 </li></ol>フローサイトメトリー分析のための6抗体染色<ol><li>非特異的結合を防ぐために：抗体標識の前に、抗マウスCD16 / CD32 Fc受容体ブロッキング試薬10分（200を2.5μg/ mlの最終濃度は、希釈係数1）4℃で細胞懸濁液をインキュベートします。 </li><li> Aの蛍光団共役一次抗体を追加します。ppropriate細胞懸濁液の濃度（ 表1に示されるように）、暗所で20分間、4℃でインキュベートします。注：対照試料は、一次抗体で染色し、それ以外は同じように扱われていません。 </li><li> 350×gでFCバッファと遠心機の2mlで細胞を洗浄し、7 min.Carefullyための10°Cは、FC緩衝液200μlで上清と再懸濁細胞ペレットを吸引。フローサイトメトリー分析まで暗所で一時的に4°Cで保存するサンプル。 </li></ol>カウントビーズ7.絶対定量<ol><li>逆に蛍光ビーズの既知数を含む計数管にFC緩衝液40μl及び10μlの細胞懸濁液をピペット。注：ピペットは、白血球数のその後の計算は、このボリュームを参照するように、試料の正確に10μLを提供するように較正されていることを注意してください。 </li><li> FITC標識CD45抗体（最終濃度で細胞懸濁液をインキュベート暗所で20分間、4℃、100）：5μgの/ mlの、希釈係数1の。 </li><li>逆に任意の洗浄工程なしでFC緩衝液200μlと計数管を記入し、直接、フローサイトメーターでCD45 +細胞を記録。 </li></ol> 8.フローサイトメトリー取得注：提案された抗体のパネルを分析するために、適切なサイトメーターは、青（488 nm）を装備する必要があり、赤（635 nm）をFITC、PE、PerCPをCy5.5標識、PECy7のための紫外線（405 nm）のレーザーおよびフィルター、 APC-Cy7をとAmCyan。 <ol><li>虚血性半球から非染色細胞を用いて、前方（FSC）および側方（SSC）散乱を調整します。 FSCの面積と高さを示すドットプロットで単一細胞からのダブレットを区別する。 </li><li>使用される各蛍光チャネルのための単一パラメータヒストグラム内のすべての単一のセルを表示し、光電子増倍管（PMT）単一の細胞がはるかにヒストグラムの左側に表示されるように電圧を調整します。 </li><li> CD45-FITCシングルを使用してください各ヒストグラムや散布図でCD45 高免疫細胞をバックゲートすることにより目的の細胞のための散乱およびPMT設定を確認するためにサンプルを染色しました。注：CD45陰性、中間体（INT）ようにFITCのPMT電圧を適応し、高発現細胞を互いに区別することができます。 </li><li>マルチカラー補正を実行するために、抗体捕捉され、補償ビーズを使用してください。ミクログリアのためのゲート（CD45 int型）および白血球（ 高 CD45）を設定し、続いて、図1に表示されたゲーティング戦略に従って白血球亜集団を定義します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ここでは、実験的脳卒中後のマウス脳から白血球を分離するためのシンプルで効果的な方法を記述する。アプローチは、確実に一つの生物学的複製で異なるフローパネルを測定することを可能にする脳半球当たりの再現性の高い細胞数が得られます。 どうやら、免疫細胞を含む血液の不完全な除去は、虚血性脳に入った炎症性細胞の実際の量に歪んだビューになります。したがって、このプロトコルを使用する場合は、非炎症性循環白血球で浸潤免疫細胞の汚染を防止するために、徹底したtranscardial灌流に特に注意を払います。経験から、左心室穿刺のための鈍い針の使用は、全身循環の灌流をバイパスすることになる心室中隔の損傷のリスクを低減します。鼻孔からの灌流液の出現 灌流は、このように、高すぎるpressureis記号は、ありますボイド流量&gt; 10ml /分。ピンクがかった色が悪い灌流の兆候である間脳組織の白い色に淡いが良い灌流を示しています。 このプロトコルのもう一つの重要なステップは、機械的な断片化だけでなく、酵素消化を含む、脳組織の効率的な解離です。セルストレーナーを介して組織をミンチするプロテアーゼの有効性の改善を提供することが重要です。組織をホモジナイズする際、単核食細胞が自己分解22を非常に受けやすいしかし、過度の圧力を避けます。酵素消化リベラーゼTLについて中性プロテアーゼのサーモリシンの低濃度が含まれている高度に精製されたコラゲナーゼIおよびIIの混合物であることをお勧めします。リベラーゼTL処理（KM未発表データ）によって生細胞の有意に高い回復を明らかにし、以前に記載の単離プロトコル14,22,23との直接比較。頻繁に使用されるコラゲナーゼと比較すると脳からの免疫細胞の単離のためのdは、リベラーゼTLは、エンドトキシンの無視できるレベルが含まれています。エンドトキシンの高レベルは、免疫細胞24の活性化状態を変更すると深刻な細胞培養は、25を成果損なう可能性があるため、細胞を、下流解析のためにソートされている場合、これは特に重要です。従来のコラゲナーゼの別の欠点 結果の再現性を危うくし、各ロット26の作業濃度の決意を必要とする酵素活性の有意なロット間の差異です。 成体の脳では、密度勾配遠心分離によってミエリン除去は、遺伝子またはタンパク質の発現のフローサイトメトリー又はさらなる研究などの下流のアプリケーションのために不可欠なステップです。プロトコルの1つの主な利点は、勾配の時間のかかる準備を必要としない単層の密度の手順です。また、分離プロトコルは、信頼性の高い結果を生成しますむしろ不慣れな実験者によって行われる場合であってもです。それは間のインターフェイスを乱すことなく、ピペットするのが困難である互いに近接密度を有する層状のグラデーションを欠いています。 表面マーカーCD45の発現に基づいて、プロトコルは、虚血性脳内の3主要な細胞の種類をもたらします。細胞の大部分は、神経細胞、アストログリア、上衣および内皮細胞で構成されているCD45陰性集団に属しています。その豊富な存在は、主に、効率的なミエリン及び破片の除去を目的と単層の密度勾配に起因します。また、居住者ミクログリア27を表す CD45 int型の人口は、主に血行浸潤白血球含まCD45 高集団から区別することができます。しかし、活性化ミクログリアが血液生まれの骨髄細胞の表現型および機能を採用してもよいことに留意すべきです。したがって、唯一の高度化を適用しますこのような骨髄キメラは、28の並体結合29または運命マッピング分析30をd技術は炎症の間、これらの2つの集団間の明確な区別を可能にします。 フローサイトメトリーのデータの分析は、多くの場合、特定の細胞集団のパーセンテージ分布に限定されます。非梗塞脳組織への梗塞半球を比較するとき、それは、虚血性損傷によって変更され、総脳白血球数を考慮していないため、この情報は、誤解を招くことができます。このように、免疫細胞サブセットのストローク相対分布後の炎症性浸潤の大きさと表現型の完全な絵を描くためには、絶対細胞数によって補完されるべきです。このプロトコールに記載されているように、マイクロビーズを使用する場合、正確な試料容積のピペットは、信頼できる結果を得るために絶対的に必須です。また、リバースピペッ​​ティングを強く計数管中の泡の形成を避けることをお勧めします。気泡を発生しますマイクロビーズの予想量を減らし、したがって、試料中の絶対的なCD45 高白血球数の過大評価につながります。 要約すると、このプロトコルは、脳から免疫細胞を単離するための簡単​​で信頼性の高いアプローチを提供します。これは、虚血性脳卒中に対する炎症反応の複雑性を分析するための貴重なツールとして役立ち得ます。将来のアプリケーションは、伝播し、虚血性脳の炎症の解像度での単球サブセットの時間依存的役割に関する調査を含みます。同様に、脳卒中後の適応免疫系の役割はあまり理解されていません。 インサイチュでサブセット特異的転写因子またはサイトカインの発現によって同定されたT細胞亜集団のフローサイトメトリー分析は、脳卒中後の長期の回復に及ぼす影響を明らかにし、従って、新しい治療法の開発のための有望な道を開くのに役立つかもしれません。

脳卒中は、地元の血流の停止後速やかに開始し、免疫システムの事実上すべての部分を伴う持続的な炎症反応を誘発します。この炎症反応の一つの重要な特徴は、脳内皮細胞、実質的なケモカイン分泌の活性化によって駆動され、交感神経流出1-3増加する脳への免疫細胞の時限流入あります。炎症性細胞浸潤が以前の虚血性脳卒中における有害と考えられていた、しかし、無差別に脳への白血球の流出をブロックするように設計されたいくつかの治療試験は、測定可能な臨床的利益4を誘導することができませんでした 。より最近では、それは、最初の虚血性損傷5の進行に関与する単球由来の細胞は、炎症およびその後の組織修復6の解決のために極めて重要な役割を果たしている可能性があることが明らかになりました。 表現型およびfun​​ctiの識別に感謝単球およびマクロファージの間でonal不均一性は、開発および炎症の解像度での単核食細胞の役割に関する知識は大幅​​に拡大してきました。マウスでは、循環する単球、リンパ球抗原6複合体（LY-6C）7のそれらの表面発現に応じて、少なくとも2つの機能的に異なるサブセットに分類することができます。 Ly-6C 高 &#39;inflammatory monocytes&#39;が明確に細菌感染8の制御に必須であることが示されたが、無菌損傷におけるそれらの役割は、より多くの議論があります。虚血性脳卒中では、CCR2 +のLy-6C の高い単球の選択的切除は出血性梗塞変換6が得られました。しかし、同じ実験的なアプローチは、脳内出血9の後に急性障害を改善しました。同様に、T細胞の異なるサブセットは、虚血性脳損傷に有害10または保護措置11のいずれかを発揮すると考えられているが、データはcontroversiありますアル12,13及びワラントさらなる調査。この増加の複雑さを考えると、それは虚血性損傷および修復における多様な免疫細胞の役割についての深い知識が脳卒中後の炎症を標的にする治療に実験結果を翻訳するために重要であることが明らかになりました。 今日では、細胞性免疫応答を分析するための最も強力なツールは、多色フローサイトメトリーです。これは、インビボでの標識または遺伝子操作14によってシステムバイアスを必要とすることなく、炎症部位 ​​での種々の免疫細胞サブセットの同定および定量を可能にします。 15または転写が個々の、表現型が同定された細胞の機能状態に関する情報を提供し、さらに16因子の細胞内サイトカインに対する抗体と細胞表面マーカーの同時染色。一つの主要な欠点​​として、単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリーアッセイに必要とされ、LOCのこのような情報細胞浸潤のalizationは失われます。組織学は、空間情報を得るために理想的であるがしかし、それは、特定の組織中の免疫細胞サブタイプを特徴づけるために一度に使用することができる抗体の数によって制限されます。今日では、種々の表面マーカーの有無の組合せが明白炎症17中に稀な免疫細胞サブセット、特に異なる単球由来細胞集団を同定するために必要とされます。 ここでは、単純な単層の密度勾配を用いた虚血後のマウス脳からの白血球の高い数値を単離するために効率的なプロトコルを説明します。得られた細胞懸濁液は、多次元フローサイトメトリーによって分析することができるいずれか、またはさらに高度に特異的な下流の分析を実行するためにフローサイトメトリーソーティングまたは免疫選択によって濃縮することができます。灌流、脳半球の除去、単一細胞SUSPへの脳組織の解離transcardial方法の詳細ensions、フローサイトメトリー分析のためにミエリンを除去するための密度勾配遠心分離、ならびに抗体染色。

<table><tbody><tr><td>Peri-Star Pro 蠕動ポンプ、4チャンネル</td><td>ワールド精密機器</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 インキュベーター&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSmix チューブローテーター</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>4831850</td><td></td></tr><tr><td>Hank's buffered salt solution (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with Calcium/Magnesium</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Plus</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-5445-01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>3302-P101003</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco/Life Technologies GmbH</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trucount</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Biochrom AG</td><td>L 182-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Horizon V500</td><td>BD Biosciences</td><td>562128</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0454</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE</td><td>Biolegend</td><td>100307</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>115519</td><td></td></tr><tr><td>Ly6C APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560596</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンチューブ、1メートル</td><td>世界の精密機器</td><td>503022</td><td></td></tr><tr><td>ファインアイリスはさみ シャープ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>ファインアイリスハサミ シャープ/ブラント</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>ストレート 1 x 2 歯鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>鈍い端の鉗子</td><td>のファイン サイエンス ツール</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>5ml シリンジ プランジャー</td><td>Carl Roth GmbH (Braun)</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>セル ストレーナー、100 & マイクロ;m</td><td>Dr. I. Schubert, BD</td><td>2360-00</td><td></td></tr><tr><td>Omnican Fine dosage syringe 1 ml</td><td>Braun</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 & micro;m</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>542 070</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubes</td><td>BD Bioscience GmbH</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、10 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、10 ml</td><td>Sarstedt AG&Co</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、25 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット、25 ml</td><td>Sarstedt AG&Co</td><td>861,685,020</td><td></td></tr>血清<tr><td>ピペット、5 ml</td><td>Sarstedt AG&Co</td><td>861,253,025</td><td></td></tr><tr><td>ヒント、0.1 - 10 &micro;l</td><td>Corning B.V.Life Sciences</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>ヒント、100 - 1,000 &micro;l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>チップ、10 - 200 & マイクロ;l</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>739296</td><td></td></tr><tr><td>反応チューブ 1.5 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>反応チューブ 2 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>623201</td><td></td></tr><tr><td>細菌学ペトリ皿、94 x 16 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>VWRInternational GmbH (BD)</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer血球計算盤</td><td>Biochrom AG</td><td>PDHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>CK07.1</td><td></td></tr></tbody></table>

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

虚血性脳卒中は、血管内の区画に始まり、脳の常在細胞の急速な活性化を伴う強固な炎症反応を開始します。この炎症反応の主要なメカニズムは、ケモカイン放出および上昇した内皮接着分子の発現によって促進虚血脳への免疫細胞の循環移動です。脳侵入白血球は、初期段階の二次虚血性損傷に寄与するよく知られているが、炎症およびそれ以降の脳修復の終了のその重要性は、ごく最近になって注目されています。 ここでは、虚血性マウス脳から免疫細胞を効率的に単離するための単純なプロトコルが提供されます。 transcardial灌流後、脳半球を切開し、機械的に分離されています。リベラーゼによる酵素消化は、ミエリン及び細胞破片を除去するために（例えば、パーコールのような）密度勾配遠心分離が続きます。このプロトコルiの1つの主な利点勾配の時間のかかる準備を必要とせず、確実に行うことができ、単層の密度勾配手順は、S。アプローチは、脳半球当たりの再現性の高い細胞数が得られ、一つの生物学的複製で複数のフローサイトメトリーパネルを測定することができます。実験的脳卒中後の脳侵入白血球の表現型の特徴および定量化は、虚血性損傷および修復におけるそれらの多面的役割のより良い理解に寄与することができます。

脳虚血は、左中大脳動脈（MCAO）の過渡フィラメント閉塞を経由して12週齢の雄のC57BL / 6マウスに開始されました。偽手術のためにフィラメントが左中大脳動脈を閉塞するために挿入され、瞬時に再灌流を可能にするために、すぐに撤回されました。重要なのは、携帯神経炎症は、一般的に適用される脳卒中モデル19の間で実質的に異なります。これは、人間の脳卒中の異種の病態生理に動物研究からの調査結果を外挿する場合は特に念頭に置いておく必要があります。 マウスは、虚血性脳への早期の免疫細胞の浸潤を分析するためにMCAOの24時間後に屠殺しました。虚血性半球から得られた細胞数（MCAO IPSI; 0.95±0.25のx 10E6）;および同側の密度勾配遠心分離は、半球（1.09±0.30のx 10E6 MCAOコントラ）からのものに匹敵した後に偽手術マウスの半球（偽IPSI; 1.12±0.18のx 10E6、一方向ANOVA、P = 0.524）。トリパンブルー排除によって測定し、単離された細胞の生存率が高く、有意に（96.85±0.60パーセント、MCAOコントラ97.12±1.18パーセントを偽群間で差は認められなかった、MCAOは0.253 = 95.68±2.04パーセント、一方向ANOVA、pはIPSI ）。 MCAOは、フローサイトメトリー分析によって決定した後の脳の組成物は、24時間の浸潤。 図1に概略的に（A）および代表ストローク動物（B）にゲーティング戦略を示しています。脳浸潤白血球は、CD45のint型ミクログリアと区別することができるCD45 high細胞と定義しました。 Tリンパ球はCD45 高 CD3 +細胞として描写しながらCD45 高集団内で、多形核好中球（PMN）は、LY-6Gの発現により同定しました。残りのCD45 high細胞は、その後、区別しました。CD19（Bリンパ球）およびCD11bの発現により編。 CD11b +画分は、さらにLY-6C 高 `炎症monocytes`や単球、樹状細胞（DC）およびマクロファージを含むのLy-6C 低い集団へサブカテゴリました。 脳卒中の急性期では、骨髄性免疫細胞は3,20を潜入脳を支配。好中球は血管閉塞の後、急速に脳に入ると炎症性単球21の血管外漏出を促進する。 図2Aは、半球および偽手術と比較して、MCAO後の虚血性半球24時間でLY6-G +好中球の増加率を表示します。対照的に、虚血性半球におけるCD3 + T細胞の割合は、健康な脳よりも（比較的）低いです。 CD11b +集団内では、脳虚血がLY-6C 高炎症性単球の強力な優位性に向けてバランスをシフトする（ 図図2（b））。 相対的分布に加えて、計数管は、CD45陽性事象（ 図3）に基づいてサンプル中の免疫細胞サブセットの絶対数を決定しました。計数管は、蛍光ビーズの既知数を解放凍結乾燥ペレットを含んでいます。サンプル中の陽性細胞の絶対数は、イベントをビーズに細胞事象を関連付けることによって決定することができます。半球あたりのCD45 高白血球数を計算するには、以下の式を用いた：半球=あたりのCD45 high細胞のx（総サスペンション容量（100μL）/サンプル容量（10μL（CD45 高のイベントは、総カウントビーズ/サンプルビーズイベントをX） ））。 24時間MCAO後、梗塞半球の総白血球数が大幅に半球と偽手術と比較して増加した（ 図3D、一方向ANOVA、P = 0.0004）。ディのカウント<html> stinct免疫細胞サブセット（PMN、T細胞、B細胞、LY-6C 高及びLY-6C 低い単球）を容易に各試料の全CD45 高白血球数との相対頻度を掛けることによって計算することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig1.jpg" /> フローサイトメトリーのための図1のゲーティング戦略。（A）ゲート戦略の模式図。 （B）は、中大脳動脈閉塞後の代表的なマウス脳24時間から単離された白血球のフローサイトメトリー分析を示します。 FSC前方散乱、PMNの多形核好中球、cDCを古典的な樹状細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg &quot;/&gt; 免疫細胞サブセットの図2.分化。のLy-6Gの相対的分布+ -neutrophils（A）、CD3 + T細胞（A）及び単球サブセットは、同側でのLy-6C（B）（IPSI）の発現差により同定し、対側（コントラ）半球中大脳動脈閉塞（MCAO）またはそれぞれ偽手術後24時間。各集団の割合がゲートに示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53658/53658fig3.jpg" /> ビーズを数えることにより、脳白血球の図3.定量化 。（A）は 、高度の二重陽性ビーズゲートを示しています。単一細胞集団内（B）CD45 int型ミクログリアは、CD45 高白血球（C）と区別することができます。定量のために、ゲートされたCD45 高いイベントの数をカウントビード事象に対して正規化しました。総白血球（CD45 高 ）カウントが大幅に中大脳動脈閉塞（MCAO）後の対側（コントラ）半球と偽手術24時間と比較して、同側（IPSI）半球で増加していることに注意してください。 ** P &lt;0.01、*** p &lt;0.001、一方向ANOVAおよびTukey`s事後多重比較試験による。 N = 4 - 群あたり6。 FSC前方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53658/53658fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table colgroup="" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 蛍光色素 </td><td rowspan="2"> FITC </td><td rowspan="2"> PE </td><td> PerCPを</td><td rowspan="2"> PC7 </td><td rowスパン= &quot;2&quot;&gt; APC-Cy7を</td><td rowspan="2"> V500 </td></tr><tr><td> （Cy5.5の） </td></tr><tr><td> 抗原 </td><td> CD45.2 </td><td> CD3 </td><td> Ly-6G </td><td> CD19 </td><td> LY-6C </td><td> CD11b </td></tr><tr><td> 最終濃度[/ mlの] </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 希釈係数 </td><td> 1/100 </td><td> 1/200 </td><td> 1 /千</td><td> 1 /千</td><td> 1/200 </td><td> 1/200 </td></tr><tr><td> クローン </td><td> 104 </td><td> 145-2C11 </td><td> 1A8 </td><td> 6D5 </td><td> AL-21 </td><td> M1 / 70 </td></tr></tbody></table> 虚血性脳における免疫細胞の同定のための 表1 の基本的な抗体カクテル。

炎症は虚血性脳卒中の病因において中心的な役割を果たします。証拠の増加は、それが初期の脳損傷を悪化させるだけでなく、後の修復にも寄与する両刃の剣として機能することを示唆しています。このプロトコルは、虚血性脳からの免疫細胞の単離と、その後のフローサイトメトリー表現型について記述しています。

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

本手順の全般的目的は、虚血状態のマウス脳から免疫細胞を分離し、多パラメータフローサイトメトリーを用いてそれらの定量および表現型解析を行うことです。多色フローサイトメトリーによる脳内の虚血後炎症の解析は、病変の進行、修復、および脳卒中の全体的な転機に関与する免疫学的プロセスについての深い理解をもたらします。本手順の主な利点は、迅速な一段階の密度勾配遠心分離により、虚血マウス脳から生存した免疫細胞を高収量で分離できる点にあります。本手法の適用は、脳卒中後より広い時間窓で適用可能な、新たな免疫調節治療戦略の同定および検証を目的としています。まず、ペリスタポンプの灌流チューブの一端を、氷冷したカルシウムおよびマグネシウム不含HBSSに浸します。チューブのもう一端に、鈍端の23ゲージ針を固定します。ポンプのスイッチを入れ、チューブ内をHBSSで完全に満たします。次に、安楽死させたマウスをプラスチックトレイに組み込まれた解剖板の上に背臥位で置き、前肢と後肢をできるだけ広く広げた状態で、20ゲージの針で固定します。1×2歯の直線ピンセットで腹部の皮膚を掴み、鋭利なアイリス剪刀を用いて皮膚および腹壁を側方に切開し、肝臓を露出させます。次に胸骨を持ち上げ、鋭鋒鈍端のアイリス剪刀の鈍い方の刃を用いて横隔膜を切開します。肺、心臓、および胸動脈を損傷しないように注意しながら、両側の側胸郭を尾側から頭側に向かって切断し続けます。鈍いピンセットを用いて皮膚弁を広げます。弁を解剖台にピンで固定し、心臓を結合組織から慎重に分離させます。鈍端鉗子で心臓を保持し、灌流チューブの先端にある23ゲージ針を左心室の心尖部に挿入します。この際、心室中隔を損傷しないよう注意してください。鋭いアイリス剪刀を用いて右心房を切開し、直ちにポンプを作動させます。その際、ポンプ内に気泡が形成されないように注意してください。肝臓が淡いコーヒー色になったら、直剪刀を用いてマウスの頭蓋骨の直後で斬首します。次に、アイリス剪刀を用いて頭皮に正中切開を加えます。頭蓋骨が見えたら、鋭いアイリス剪刀の片方の先端を大後頭孔に挿入し、骨に向かって側方切開を行います。反対側でも同様に切開を繰り返します。次に、鋭いアイリス剪刀を用いて、同じ空洞から正中線に沿って鼻の方へ向かって慎重に切開します。微細ピンセットを用いて、各脳半球から頭蓋骨をゆっくりと剥離させます。その後、スパチュラで脳を持ち上げ、鋭いアイリス剪刀を用いて、脳を頭蓋骨に固定している脳神経繊維を慎重に切断します。脳を、カルシウムおよびマグネシウムを含む10 mLのHBSSを入れ、氷上に置いた15 mLチューブに移します。脳組織を単一細胞懸濁液に解離させるために、まず、清潔なカミソリを用いて脳幹と小脳を慎重に取り除きます。次に、別の清潔なカミソリを使用して脳を半分に切り、各半球を冠状面に沿ってほぼ等しい大きさの3つの断片に切断します。5 mLシリンジのプランジャー端を使用して、脳組織の断片を100 µmのセルストレーナーで押し潰しながらすり潰し、その際、カルシウムおよびマグネシウムを含む氷冷HBSSでストレーナーを絶えず洗浄します。その後、ホモジナイズした組織を氷上に置きます。すべてのサンプルの処理が完了したら、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を注意深く除きます。ペレットを1 mLの消化バッファーで再懸濁します。その後、細胞懸濁液を2 mLチューブに移し、37 °Cで緩やかな連続回転条件下でインキュベートします。1時間後、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過し、DNaseを含む3 mLの洗浄バッファーでフィルターを十分に洗浄します。次に、ストレーナーを15 millilitersのDNase-free洗浄バッファーで洗浄し、細胞を遠心分離して上清を捨てます。細胞の破片および髄鞘を除去するため、細胞を室温の25%密度勾配培地5 millilitersに再懸濁し、細胞懸濁液を15-milliliterチューブに移します。緩やかなピペッティングを繰り返して、勾配中の細胞を十分に混合します。次に、細胞溶液を遠心分離します。分離後、ペレットを乱さないように注意しながら髄鞘層と上清を慎重に吸引し、細胞を10 millilitersのDNase-free洗浄バッファーで再懸濁します。細胞を15-milliliterチューブに移して再度遠心分離し、ペレットを100 microlitersの冷洗浄バッファーで再懸濁します。次に、トリパンブルー排除法により生存細胞数をカウントし、4 °Cで保存する。免疫染色の開始前に、非特異的な結合を防ぐため、抗マウスCD26/CD32 Fc受容体ブロッキング試薬を用いて細胞を4 °Cで10分間インキュベートする。その後、目的の蛍光標識一次抗体を加え、4 °C、暗所にて20分間反応させる。インキュベーション後、2 mLのフローサイトメトリー用バッファーで細胞を洗浄します。遠心分離して沈殿させます。ペレットを200 µLのフローサイトメトリー用バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析まで4 °Cで保存します。ビーズカウント法により浸潤免疫細胞の絶対数を定量するため、既知数の蛍光ビーズを含むカウントチューブに、フローサイトメトリー用バッファー40 µLと細胞懸濁液10 µLをリバースピペッティングで加えます。次に、細胞およびビーズ懸濁液にFITC標識CD45抗体を加え、4 °Cの暗所で20分間インキュベートした後、カウントチューブにフローサイトメトリー用バッファー200 µLをリバースピペッティングで満たします。その後、直ちにフローサイトメーターでサンプルを解析し、ビーズおよびCD45陽性細胞のイベント数を記録します。中大脳動脈閉塞から24時間後、脳浸潤白血球はCD45の高発現によって同定できます。CD45高発現集団のうち、多形核好中球はLY-6Gの発現によって同定され、Tリンパ球はCD45高発現かつCD3陽性の細胞表面表現型を示します。残りのCD45高発現細胞は、CD19およびCD11bの発現によってさらに区別することが可能です。CD11b陽性分画は、Ly-6C高発現の炎症性単球と、単球、マクロファージ、および樹状細胞集団を含むLy-6C低発現集団にさらに分類できます。脳卒中の急性期には、血管閉塞後、Ly-6G陽性好中球が速やかに脳内に浸潤します。対照的に、虚血側半球におけるCD3陽性T細胞の頻度は、偽手術群の脳および対側半球と比較して減少します。CD11b陽性細胞集団において、脳虚血はLy-6C高発現の炎症性単球が強く優位になる方向へバランスをシフトさせます。さらに、中大脳動脈閉塞から24時間後、梗塞側半球の総白血球数は、対側半球および擬似手術（sham）群の脳と比較して有意に増加します。このビデオを視聴することで、機械的破砕、酵素消化、および密度勾配遠心法を用いて虚血脳から免疫細胞を分離する方法と、フローサイトメトリーによってこれらの細胞を特性解析する方法について十分な理解を得ることができます。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、4時間で完了させることができます。この手順を行う際は、総細胞回収数が脳組織の徹底的な解離に決定的に依存することを忘れないでください。さらに、脳浸潤白血球が非炎症性の循環免疫細胞によって汚染されるのを防ぐため、十分な経心腔灌流を行う必要があります。この手順に続き、遺伝子発現アッセイやサイトカインプロファイル解析などの他の手法を実施することで、虚血性脳卒中における異なる免疫膿瘍の機能的関連性について、さらなる知見を得ることができます。

isolation-flow-cytometric-analysis-immune-cells-from-ischemic-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。...

パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

このビデオは、機械的解離と酵素消化を使用して、マウスの脳から腫瘍浸潤末梢血単核細胞を分離する方法を示しています。これに続いて、密度勾配遠心分離を行い、免疫細胞を採取してさらに分析します。...

マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

このビデオでは、脳卒中研究における炎症応答を研究するために、脳細胞と浸潤性マウスの脳組織から脳細胞と浸潤免疫細胞を酵素消化によって分離し、続いて密度勾配遠心分離によって細胞残骸とミエリンを除去する手順を示しています。...

虚血性マウス脳組織からの細胞懸濁液の取得

脳卒中後の脳骨髄細胞の特徴づけは、光分留法を用いて、立体解析によって行う、または脳白血球懸濁液のフローサイトメトリー分析により得ることができる。両方は、虚血性脳に見出さ主骨髄細胞サブセットの正確な表現型の区別を行うために有用な技術である。...

一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。...

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

このプロトコルは、虚血性脳卒中のマウスモデルである一過性中大脳動脈閉塞後の肺環境における免疫細胞組成、サイトカインプロファイル、およびケモカインプロファイルの変化を同定するためのフローサイトメトリーの使用を記載している。...

肺環境における免疫細胞および炎症誘発性メディエーターの特性評価

この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。...

微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。...

マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

ここでは、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞機能を評価するためのプロトコルを紹介します。この方法は、神経免疫相互作用の詳細な調査を可能にし、他の神経変性疾患の研究にも適応できるため、脳卒中病理における免疫応答の理解を深めることができます。...

ミニ脳卒中マウスモデルにおける神経免疫相互作用の単離とフローサイトメトリー評価

学ぶ虚血性マウス脳から免疫細胞を単離しフローサイトメトリーで解析する手法。密度勾配遠心分離で高収率に生細胞を得られ、脳虚血後の炎症反応と免疫細胞動態を詳細に解析できる。

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

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