組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

この手順の全体的な目標は、中枢神経系における定位注射によるパーキンソン病のウイルスベクターベースの動物モデルを開発することです。この方法は、前臨床薬物試験を可能にする正常な動物モデルの開発に使用でき、パーキンソン病や他の多くの神経変性疾患の分子メカニズムの研究に有益です。この手法の主な利点は、脳領域の特定のターゲティングに使用できることです。

高いトレンチング脳発現を達成し、特定の動物系統や種における動物モデルの作成に用いることができる。さまざまな最終ベクトルシステムが開発されました。ベクターシステムの選択は、発現したいトレンチングのサイズ、遺伝子発現の持続時間、ターゲットにしたい音、バイオセーフティの問題によって異なります。

手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるAnnelies Aertgeertsです。承認されたプロトコルに従って、生後8週齢の雌のWistarラットに適切に麻酔をかけることから始めます。各足を絞ることにより、麻酔の手術面が達成されたことを確認し、離脱反射がないことに注目します。

次に、マイクロトランスポンダーインプラントを使用して、ラットの背中にマイクロトランスポンダーを配置します。マイクロトランスポンダーが正しく配置されていること、および読み出しが得られることを確認してください。次に、ラットの頭皮の髪を切り、頭皮と耳に局所麻酔薬を塗布します。

ラットを層流フードに移し、無菌技術を使用して残りの手順を実行します。耳のバーを固定し、次に口と鼻のバーを固定して、ラットを定位固定装置フレームに置きます。体温の低下を避けるために、ラットの体を紙の毛布で覆います。

眼の乾燥を防ぐために眼用潤滑剤を塗布します。次に、承認された手順に従って頭皮を消毒します。ここでは、70%イソプロピル中の1パーセントのヨウ素が使用されます。

頭皮の正中線を小さく切開した後、頭蓋骨の膜をやさしくこすり落とし、生理食塩水ですすいでください。頭蓋骨を乾かした後、ブレグマとラムダがはっきりと見えることを確認します。次に、10マイクロリットル、30ゲージの20マイルメーターマイクロインジェクションシリンジに組換えAAVを充填し、脳定位固定装置に接続された電動マイクロインジェクションポンプに置きます。

黒質のドーパミン作動性ニューロンの特定の取引については、組換えAVベクターが、ドーパミン作動性ニューロンを形質導入するための高い力価と効率のために最初の選択肢です。AAV を一滴放出して、流れをテストします。放出されたAAVは、多価の洗浄洗剤に廃棄してください。

ヘッドがヘッドフレームにまっすぐ固定されていることを目視で確認します。次に、最初に針の先端をブレグマに移動し、この時点での高さを測定し、針の先端を背腹方向に下げて頭蓋骨に触れるまで、頭蓋骨が平らであることを確認します。ラムダで手順を繰り返します。

針をブレグマに戻した後、針を前後および内側の横方向に動かして、マイクロインジェクション用の定位固定装置座標に移動します。座標を書き留めます。注射部位では、前と同じように頭蓋骨の高さを測定し、ブレグマの高さから0.3mm以上異ならないことを確認します。

次に、頭蓋骨に2ミリメートルの穴を慎重に開けます。穴を開けたら、硬膜の高さを測定して、背腹座標を適用する基準を決定します。26ゲージの針を使用して硬膜を貫通します。

滅菌組織で血液を吸収し、すべての出血が止まった後にのみ進行します。次に、事前にロードされたマイクロインジェクション注射器の針を脳にゆっくりと下げ、背腹座標まで下げます。そして、1分間立ち止まります。

次に、毎分0.25マイクロリットルの速度で3マイクロリットルのAAVを注入します。注射後、針をゆっくりと取り外す前に、針の軌跡に沿って逆流を防ぐために、針をさらに5分間所定の位置に保持します。コード化された編組ポリエステル3.0を使用して頭皮を縫い、1%のヨウ素と70%のイソプロピルで皮膚を消毒します。

鼻とマウスバーを緩め、次に2つの耳バーを緩めて、動物を定位固定装置からそっと取り外します。この時点で鎮痛剤を投与し、必要に応じて麻酔逆転剤を投与します。次に、ラットを摂氏38度に設定された加熱プレートの上の清潔なケージに入れ、目を覚ますまで注意深く監視します。

手術後、神経変性の動態は、行動試験とPETイメージングを使用して動物全体で研究でき、犠牲後には免疫組織化学的手法を使用して研究できます。自発的な前肢の使用を評価するためのシリンダーテストは、A53T変異αシヌクレインを発現する組換えAAVを黒質にマイクロインジェクションした後、さまざまな時点で実施されました。注射の3週間後から、中央値の用量を受けたラットに重大な運動障害が見られました。.

注射の4週間後、自発的な対側の前足の使用が50%減少したことが観察されました。一方、対照のeGFP注射動物は、前足の使用に非対称性を示さなかった。高用量の組換えAAV 2/7A53Tαシヌクレインを投与されたラットは、注射後29日目に前足の使用により顕著な障害を示しました。

観察された運動障害がドーパミン依存性であることを証明するために、L-ドバの単回投与が投与されました。L-ドーパ治療の45分後にシリンダー試験を繰り返したところ、組換えAAV 2/7A53Tαシヌクレイン注射動物における前足使用の完全な回復が観察された。黒質線条体ドーパミン作動性神経変性の動態を非侵襲的に経時的に追跡するために、個々の動物において、F-18FECTを放射性リガンドとして使用した小動物陽電子放出断層撮影法を使用して、ドーパミン輸送結合を定量化しました。

組換えAAV 2/7A53Tαシヌクレインを注射したラットの同側尾状ブディマンにおけるDAT結合は、経時的に有意に減少しました。32日後、DAT結合の最大85%の減少が観察されました。ポジティブコントロールとして、SNに神経毒6OHDAを注射すると、7日以内にDAT結合が90%失われました。

組換えAAV 2/7A53Tαシヌクレインを経時的にマイクロインジェクションしたラットの脳切片を、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼについて免疫染色した。この図は、マイクロインジェクション後29日間でドーパミン作動性ニューロンが徐々に失われることを示しています。一度習得すれば、このテクニックは45分で完了します。

この手順を試行する際には、高品質のファイナル ベクトル一致を使用することが重要です。この手順に続いて、非侵襲的PETイメージング、行動分析、免疫組織化学分析などの他の手法を実行して、神経変性および神経病理学のレベルを決定することができます。このビデオを見た後、パーキンソン病のウイルスベクターベースの動物モデルを開発するために、黒質へのウイルスベクター注入を行う方法についてよく理解できるはずです。

ウイルスベクターの取り扱いは危険な場合があり、この手順に従って、層流下での作業や適切な廃棄物除染などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。