Name: CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶCLARITY/CUBIC技術を用いたマウス脊髄のセロトニン繊維3Dイメージング法。従来の組織学では観察困難な繊維分布を可視化し、神経解剖学と疼痛メカニズムの理解を深める。

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この研究は、Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), an NHMRC project grant (#1086643) の支援を受けました。George Paxinos 教授は、NHMRC の上級主任研究員の助成金 (#1043626) の支援を受けています。

倫理文：動物を対象とするすべての手順は、ニューサウスウェールズ大学の動物管理及び倫理委員会（ACEC）（承認ACEC番号は14 / 94Aである）のガイドラインに従ってください。 透明なマウス脊髄の調製<ol><li>アイスコールドヒドロゲル溶液の調製<ol><li> 16％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）の調製<ol><li> 70ミリリットル予め温めておいた蒸留水（50〜55℃）でに16グラムのパラホルムアルデヒド粉末を追加し、パラホルムアルデヒドが溶解するまで加熱された磁気撹拌機で撹拌します。注：ソリューションがオーバー55°Cを加熱し、パラホルムアルデヒドは有毒であることに注意することがないようにしてください。 </li><li>シリンダーにパラホルムアルデヒド溶液を移し、100mlに蒸留水を追加します。 4℃の冷蔵庫を使用して、パラホルムアルデヒド溶液を冷却します。 </li></ol></li><li>蒸留水26.25ミリリットル中に125mgのVA-044開始剤を溶解させ、4溶液を冷却Cの冷蔵庫を°。 </li><li>クール5ミリリットルアクリルアミド溶液（40％）、1.25ミリリットルビス溶液（2％）（注意：ビスアクリルアミド溶液は毒性があり、遺伝的欠陥や癌を引き起こす可能性がある）、5ミリリットル10×PBS、12.5ミリリットル16％PFA溶液、および氷上のVA-044の開始剤溶液。 </li><li>氷の上に上記の溶液を混合。 注：総容量は50ミリリットルです。 </li></ol></li><li>マウス脊髄の灌流およびコレクション<ol><li> 0.9％生理食塩水で希釈したケタミン（80mg / kg）およびxyzaline（5mg / kg）の腹腔内注射でマウスをAnaesthetize。マウスのための用量は、ラットのそれよりも低くすることができます。 </li><li>マウスは、足の皮にピンチに応答しません一度ヒュームフード内で適切なプラスチック表面に、（粘着テープが効果的である）身体から離し、マウスの四肢を固定します。 </li><li>胸の上にマウスの皮膚をカットした後、骨の胸は、はさみで心臓を露出します。 </li><li> 25 G針が番目に取り付けると、蠕動ポンプを使用してチューブの電子端部は、心臓の左心室に針を挿入し、約10ミリリットル/分の速度を血液のための出口点を作成し、40ミリリットルの0.9％生理食塩水での洗浄を開始するために右心房を切り取ります。 </li><li>完了したら、35ミリリットルの氷冷ヒドロゲル溶液でマウスを灌流。 注：神経組織の膨張を回避するために、10ml /分の速度で灌流。 </li><li>ブレードバックの上に皮膚を切開して、次の脊椎動物に筋肉を削除します。一方の側で椎弓を切断し、反対側にフリップした後、細かいハサミで脊柱から脊髄を取ります。 </li></ol></li><li>マウスの脊髄をクリア<ol><li> 4℃で一晩ヒドロゲル溶液の15ミリリットルで脊髄を置きます。 </li><li>ヒドロゲル溶液の10ミリリットルを削除し、5ミリリットルチューブに脊髄セグメントを有する液の残りを注ぎます。それは完全に一杯になるまでヒドロゲル溶液で5 mlのチューブを埋めます。 </li><li> 5ミリリットルチューブの上にパラフィルムの小片をストレッチした後、チューブの首にパラフィルム包みます。注：パラフィルムの接点ヒドロゲル溶液を確認し、ヒドロゲル溶液と、パラフィルムの間に気泡が存在しません。 </li><li> 37で5ミリリットルチューブを入れて&#160; °Cのオーブンで一晩。それがゲルになるまでヒドロゲル溶液を観察します。 </li><li>オーブンから5ミリリットルチューブを取り、（そのようなシャベル1ミリリットルピペットチップなど）スパナでチューブからゲルを削除します。ゲルに粗い組織を貼り付けることにより、脊髄組織からゲルを外し、（ゲルは組織に固執するため、組織によって削除されます）離れ粗い組織を取ります。 </li><li>脊髄組織からゲルを除去した後、シェーカー上で24時間、1×PBS（pH7.4）で脊髄を4回洗浄します。 </li><li> 3.85グラムの尿素3.85グラムのN、N、N &#39;、N&#39;-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）ethylenediamを溶解することによりキュービック透明溶液を調製します5.38ミリリットルの蒸留水にINE。 注：ホットスターラーが使用されています。それは明確であり、室温にまで冷却後に溶液に、2.31グラムのポリエチレングリコールモノ-P-イソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100を追加します。 注：これらの3化学物質の10グラムは1マウス用です。 </li><li>かみそりの刃で2〜3ミリメートル長いセグメントに冠状にマウスの脊髄を切り取り、上記CUBICクリア溶液5mlに入れて。 37のオーブンでシェーカー上に置き&#160; 3日間Cを°。 </li><li> 3日後、新鮮なものに決済ソリューションを変更します。注：上記溶液は使用前に調製されます。 </li><li> 2〜3日後にCUBIC決済ソリューションをリフレッシュした後、フォント8文字で紙に対する組織の透明性を確認してください。それが透明である場合、文字がクリア組織を通して見ることができます。 （0.1％のTriton-X100）は、組織を1日4回（6時間ごと）を洗浄するためにクリア溶液を除去し、PBSTで4ミリリットルを追加します。 </li></ol></li></ol><ol><li> 37℃のオーブンでシェーカー上で3日間：一次抗体溶液中の脊髄セグメントをインキュベート（PBSTで100抗セロトニンは、ウサギで育った、1に希釈しました）。 </li><li>抗体溶液を除去し、37℃のオーブンで脊髄セグメントを1日4回（各6時間）を洗浄するためにPBST（0.1％のTriton-X100）の4ミリリットルを追加します。 </li><li> PBST溶液を除去し、二次抗体溶液を加える（594結合ヤギ抗ウサギIgG、1希釈：PBSTで100）を37℃のオーブン中でシェーカー上で3日間組織をインキュベートします。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、37℃のオーブンでシェーカー上脊髄セグメントを1日4回（6時間ごと）を洗浄するためにPBSTの4ミリリットルを追加します。翌日、組織は、イメージングのための準備ができています。 </li></ol> 3.イメージング<ol><li> PBST溶液を除去し、さらには組織の屈折率を作るために85％グリセロールの4ミリリットルを追加します。 </li><li&gt;は組織の透明性を確認してください。それは約1時間で明らかになると、マルチフォト蛍光顕微鏡の保持枠に適合する大、薄いガラススライド上に組織を置きます。 </li><li>次の脊髄組織に85％グリセロールの数滴を入れて、22×50mmの2カバースリップガラスでそれをカバースリップ。 注意：脊髄の向きは、画像がどのように見えるかを決定します。 </li><li>多光子蛍光顕微鏡の保持枠の上にスライドガラスを入れて、光経路に組織を動かします。 </li><li>ヘリウムネオンレーザライン594 nmのを選択して、ライブ画像に正の信号の輝度をチェックして、最適なレベルにレーザーの強度を調整します。 </li><li> （水中、NA 0.7）20Xの対物レンズを用いて脊髄組織の走査領域を選択し、zスタックを作成するための準備、および3μmと各ステップの深さ。 </li><li> 20XのOBJEC下zスタックの上から下に組織をスキャン的と（油中、NA 1.4）を63Xの対物レンズをそれぞれ、（ステップサイズは1μmでした）。 3Dソフトウェア28を使用して3D映像を再構成します。 </li></ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコルを組み合わせCLARITYとCUBIC技術を用いてマウスの脊髄における画像セロトニン作動性繊維にどのようにショーを説明しました。これは、チャンら 14およびさまら 15によって開発された受動的な決済プロトコルに比べて速くクリア処理を紹介し、脊髄組織が ​​うまくクリア時にヒドロゲルによってサポートすることができます。 チャンら 14およびさまらによって報告されているように、マウスの脊髄の固定、中に重要なステップ。15は 、化学物質の重合を防止する、すべての溶液を氷上で冷静さを保つことです。他の重要なステップは、神経組織の膨潤を回避するために、ヒドロゲル溶液でゆっくりとマウスを灌流することです。ヒドロゲル溶液がゲルになるためには、脱気が必要とされます。これに代わるものとして、我々は、チューブの上部をカバーするためにパラフィルムを使用し、HYDとの間に気泡が残っていませんrogelソリューションとパラ...

脊椎上突起は、痛みの知覚などの多様な行動の調節に関与しています。侵害受容情報を運ぶ突起の1つには、後脳縫線と隣接する網状核1,2に由来するセロトニン作動性線維が含まれています。生理学的および薬理学的研究は、後脳の縫線核の電気刺激後に脊髄の背角におけるセロトニンの放出の増加を実証している3-5。ラットおよびオポッサムでは、セロトニン作動性ラフェ脊髄線維は、背角6〜8だけでなく、中間ゾーン7,9,10、腹角7,11、さらには椎弓板1012,13にも密集した末端を有する。マウスには同様の研究はありません。本研究は、マウス脊髄の後脳縫線核とそれらに隣接する網状核から生じるセロトニン作動性線維の終結パターンを、最近発表されたCLARITY14法とその修正であるCUBIC15を使用してマッピングすることを目的としています。
従来の脊髄の蛍光またはペルオキシダーゼ免疫組織化学は、脊髄の灰白質におけるセロトニン作動性線維の分布を30-40μmの厚さの断面で明確に示しています。しかし、このアプローチでは、白質のセロトニン作動性線維路と灰白質の側副血行路の連続性は示されていません。組織切片の3D再構成により、線維路に関する知識は進歩しましたが、切断によって組織に小さな歪みが生じるため、組織学者や解剖学者が単一の管をたどることは依然として課題です。この障害を回避するために、多くの研究者が、組織全体の構造を透明にし、未改変の組織の画像を1つのビデオファイル17-21に収集するためのさまざまなプロトコルを開発しました。これまでのところ、Deisserothのグループ14,15によって開発された透明、脂質交換、アクリルアミドハイブリダイズ硬質、イメージング/免疫染色適合、組織ハイドロゲル(CLARITY)技術、および須崎らによって開発されたCUBIC16が最も成功しています。プロトコルの発表以来、多くの研究者がこれらの技術を使用して、脳22〜25だけでなく、心臓、腎臓、腸、および肺26,27を含む生体組織のさまざまな側面を調査し始めている。
マウスの脊髄をハイドロゲル溶液(CLARITY)で固定し、CUBIC試薬で透明化することにより(これは元のCLARITYプロトコル14,15に記載されている方法よりもはるかに速い方法)、長さ2〜3mmの脊髄組織ブロックが2週間以内にクリアされ、セロトニンの免疫蛍光染色が8日で完了しました。従来の免疫組織化学は、薬剤を組み合わせるだけで、約1ヶ月で個々の線維路の画像を3Dビデオファイルに作成することができます。

<table><tbody><tr><td>光開始剤 VA044</td><td>和光</td><td>VA-044/225-02111</td><td></td></tr><tr><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm 40% アクリルアミド溶液</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879C-4D63-BA0B-82556A0CCF1D</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>尿素</td><td>メルクMillipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>セロトニン抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor&reg; 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>多光子顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

clarity / cubic技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

脊髄への長い下降繊維が移動、疼痛知覚、およびその他の動作のために不可欠です。これらのファイバシステムの大部分の脊髄における繊維の終端パターンを徹底的に任意の種に調べられていません。脊髄に突出セロトニン作動性線維は、組織切片のラットおよびオポッサムに研究されており、それらの機能的意義は、脊髄でのファイバ終端パターンに推定基づいています。 CLARITY立方技術の発展に伴い、このファイバシステムとセロトニン脊柱上の経路の未知の機能を明らかにする可能性がある脊髄におけるその分布を調べることが可能です。ここでは、合成CLARITY立方技術を使用して、マウスの脊髄におけるセロトニン線維を撮像するための詳細なプロトコルを提供します。この方法は、COMBINと組織のヒドロゲル溶液と明確化とマウスの灌流を伴います試薬をクリアするエーション。脊髄組織は、すぐ下に2週間でクリアされた、およびセロトニンに対するその後の免疫染色は、10日以内に完了しました。多光子蛍光顕微鏡を用いて、組織を走査し、3次元画像は、OsiriXのソフトウェアを使用して再構築しました。

このセクションでは、CLARITY立方プロトコルの組み合わせを使用して、透明なマウスの脊髄におけるセロトニン抗体染色の結果を示します。私たちは、セロトニン作動性繊維は（もビデオ1参照、 図1）前角の腹の部分で優勢で脊髄の全ての薄層に存在していることを示しています。対照組織は陽性線維（結果は表示されませんでした）を持っていませんでした。前角では、高密度に充填されたセロトニン作動性繊維は前角の腹内側部分に存在していると、彼らは前角の外側部に向かって延びている（ 図2、またビデオ2を参照）。いくつかの免疫陽性繊維はまた、背角または中心管に向かって前角から延びています。免疫陽性繊維は、後角の全ての薄層中に存在しているが、正の薄層2中の繊維と4の間に小さな隙間があり、特に横で脊髄後角の一部。後角におけるセロトニン線維の大部分は小さい直径のものであり、それらのほんの数が大径（ ビデオ1）です。水平断面において、前角に...

脊椎上突起は痛みの知覚やその他の行動にとって重要であり、セロトニン作動性線維はこれらの線維システムの一つです。本研究では、これらのセロトニン作動性線維の終結を調査するために、マウス脊髄へのCLARITY/CUBICプロトコルの組み合わせの適用に焦点を当てました。

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

このCLARITY/CUBIC実験の全体的な目的は、従来の組織学では観察不可能なマウス脊髄におけるセロトニン作動性線維の3D特徴を明らかにすることです。この手法は、セロトニン作動性線維が脊髄全体にどのように分布しているかなど、神経解剖学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、セロトニン作動性線維をin situで観察できること、および従来の組織学では観察できないベクターの同定が可能であることです。この手法は中枢神経系の構成に関する知見を提供できるだけでなく、心血管系などの他の系にも適用可能です。我々は、マウス脊髄におけるセロトニン作動性線維を解析する際、従来のトレーシング法では限界があったため、まずこの手法の導入を検討しました。まず、麻酔をかけたマウスの四肢を、ドラフトチャンバー内のプラスチック製解剖台に固定することから始めてください。足指へのピンチ刺激に反応がないことを確認し、はさみを用いて胸部の皮膚を切開します。次に、胸腔を開いて心臓を露出し、ペリスタルティックポンプのチューブに接続した25ゲージの針を左心室に挿入します。右心房を切断し、血液の流出口を作成します。次に、心臓を9%生理食塩水40 mLで、約10 mL/分の速度で洗浄します。血液がすべて洗い流されたら、同速度で、調製直後の氷冷したハイドロゲル35 mLを動物に灌流させます。その後、マウスの背部の皮膚を切開し、脊椎に隣接する筋肉を剥離します。片側の椎弓を切断し、反対側に跳ね上げた後、精密鋏を用いて脊髄を脊柱から切り出します。採取後すぐに、脊髄を新調した15 millilitersのハイドロゲル溶液に入れ、4 degrees Celsiusで一晩静置します。翌日、ハイドロゲルを10 milliliters取り除き、残りの溶液と脊髄を5 milliliterチューブに移します。チューブが満杯になるまで新鮮なハイドロゲル溶液を加え、次にパラフィルムを小さく切り、チューブの口に張り付けます。この際、パラフィルムがハイドロゲルに接し、溶液とフィルムの間に気泡が入らないように注意してください。チューブから空気を完全に除くことが最も困難な工程です。気泡が入らないようにするため、ハイドロゲル溶液をゆっくりとチューブに満たし、ゲルをこぼさないように注意しながら、慎重にチューブの上部にパラフィルムを配置してください。次に、チューブのネック部分に2枚目のパラフィルムを巻き、脊髄を37 °Cのオーブンで一晩インキュベートします。ハイドロゲル溶液がゲル化した後、スパナを使用してゲルと神経組織をチューブから取り出します。脊髄からハイドロゲルを除去するには、粗い組織をゲルに軽く押し当ててください。ゲルは組織から取り除かれる際に付着します。脊髄がきれいになったら、PBSに入れ、シェーカーを用いて4〜6

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル...

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

出典:Pekarek, B. T., et.al., CLARITY Tissue Clearingによる無傷のニューロン樹状突起のイメージングと定量化。J. Vis. Exp.

透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

大きな組織内で蛍光標識された細胞の高解像度画像を得るためには、理想的には、生物学的サンプルは切片化せずに画像化されるべきです。3DISCOは、有機溶媒との逐次インキュベーションに基づく簡単な組織透明化手順です。クリアすると、臓器が透明になり、標本のエンドツーエンドのレーザースキャンが可能になります。...

イメージングは​​3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア

このビデオでは、我々は生きたマウスの背側脊髄の上に慢性光学イメージング室を移植するための手順を説明します。室、外科的手順、および慢性のイメージングを見直し、実証されている。...

縦断のために脊髄商工を移植するための手順インビボイメージング

マウス脊髄を撮像するための新規のex vivo調製。このプロトコルは、脊髄全体生細胞の相互作用の二光子イメージングを可能にする。...

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

光学的透明化技術は、組織の可視化方法に革命をもたらしています。このレポートでは、より一貫性があり、より安価な結果をもたらす元のClear...

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。...

CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

神経樹状形態は、しばしば機能の根底にある。実際、ニューロンの発達に影響を与える多くの疾患プロセスは、形態表現型で現れる。このプロトコルは、無傷の樹状樹状の樹状樹状の樹状樹状の、および関連する脊椎を分析するための簡単で強力な方法を記述します。...

CLARITY組織クリアリングによるインタクトニューロンデンドライトのイメージングと定量化

プロトコールは、組織クリアリング法ScaleSFを用いた脳スライスにおけるニューロンイメージングの詳細な方法を提供する。このプロトコルには、脳組織調製、組織清澄化、クリアスライスの取り扱い、およびメゾスコピックレベルから顕微鏡レベルまでのニューロン構造の共焦点レーザー走査顕微鏡イメージングが含まれます。...

メゾスコピックから顕微鏡スケールまでのニューロンイメージングのための組織クリアリング法

低侵襲技術とシンプルな実験装置は、実験動物への手術損傷を減らし、解剖学的形態の維持を可能にすることにより、脊髄損傷モデルの再現性を向上させます。信頼性の高い結果と再現可能な手順により、病気の修復のメカニズムの調査が容易になるため、この方法は価値があります。...

低侵襲法に基づくマウス挫傷脊髄損傷モデルの確立

学ぶCLARITY/CUBIC技術を用いたマウス脊髄のセロトニン繊維3Dイメージング法。従来の組織学では観察困難な繊維分布を可視化し、神経解剖学と疼痛メカニズムの理解を深める。

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

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