神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

この手順の全体的な目標は、初期の脳腫瘍微小環境に浸潤した末梢血単核細胞の数を特徴付け、定量化することです。この方法は、末梢免疫細胞を脳腫瘍微小環境に輸送するために重要な因子を特定することにより、脳腫瘍免疫学の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、このCNSに侵入した白血球の数と活性化状態に関する時間依存の定量的データが得られることです。

麻酔をかけたマウスを定位フレームにセットした後、メスの刃を使用して前頭骨から後頭骨まで頭蓋骨に2cmの正中線切開を行います。次に、Collibraリトラクターを使用して切開部で皮膚を引っ込めます。その後、33ゲージの針を備えたマイクロリットルシリンジをBMAの真上に下げます。

腫瘍移植の標的部位に到達するように針の位置を調整します。次に、26ゲージの針を備えた1ミリリットルのツベルクリン注射器を使用して、その後、骨膜を穏やかに刺激することにより、この位置に印を付けます。0.8ミリメートルのドリルビットを使用して、穴を開けながら下にある硬膜に到達するまで、ターゲットサイトの頭蓋骨に穴を開けます。

断続的な圧力を加えた後、ドリルビットを頭蓋骨表面からすばやく取り外して、過度の熱と力を避けます。次に、1.7ミリリットルの円錐形ポリプロピレンマイクロチューブに0.9%塩化ナトリウムでマイクロリットルシリンジを洗い流し、針が詰まっていないことを確認します。腫瘍細胞が入った0.6ミリリットルの円錐形ポリプロピレンマイクロチューブを数回静かにフリックして、細胞を完全に蘇生します。

次に、2マイクロリットルの細胞をマイクロリットルのシリンジに引き込み、シリンジに気泡が入らないようにします。1マイクロリットルの細胞を70%イソプロピルアルコール調製パッドに分注し、シリンジに正確に1マイクロリットルの腫瘍細胞を残します。その後、針が硬膜に触れるまで針を下ろします。

次に、針を脳内に3.5ミリメートル下げ、続いて針を0.5ミリメートルゆっくりとスムーズに引っ込めます。シリンジプランジャーを1〜2分間押し下げて細胞を送達します。深く麻酔されたマウスで経心筋灌流を行うこと。

心臓の左心室に鈍い針を挿入します。解剖ハサミの小さなペアを使用して右心房を切り取り、放血灌流、肝臓と肺が完全に血液不足に白くなるまで数分間チロ溶液でマウスの循環器系を可能にします。総量の血液が右心房から出続けないようにします。

20ゲージのアルミニウムハブを左心室から鈍い針を取り外す前に。針を取り外した後、押し出した発泡スチロールブロックからマウスのピンを外し、マウスの腹側を下にしておきます。大きな解剖ハサミを使用して、頭を体の他の部分から分離します。

次に、頭蓋骨を露出させるために、後頭骨から鼻まで機能する小さな解剖ハサミを使用して、正中線上の頭皮を切断します。その後、頭蓋骨の両側の皮膚を引っ込め、頭蓋骨をしっかりと保持します。一対の骨URSを使用して、後頭骨から頭蓋骨を慎重に突破し、脳の背側と外側の表面を完全に露出させるために前進します。

頭蓋骨からマウスの脳を損傷を与えることなく採取することは、最初は難しいと判明するかもしれません。この技術に不慣れな方は、適切な実験を行う前に何度か試してみるとよいでしょう。頭蓋骨を切除したら、マウスの頭を上に向けます。

脳を頭蓋骨から解放するために、脳の基部にある脳神経を切断します。この手順では、きれいな片刃のカミソリの刃を使用して、脳の中心を矢状に切り込むことにより、腫瘍を含む脳の領域を分離します。2つの半球を解剖するには、同側の半球の内側を下にして、小脳に冠状動脈を1つ、嗅球にもう1つの冠状動脈を切開して、腫瘍インプラントを含む標的組織を分離します。

次に、1ミリリットルのDPBSが入ったラベル付きのガラス製ダウンティッシュグラインダーにターゲット組織を置きます。プランジャーを完全に押し下げ、7回ひねって組織を破壊します。その後、プランジャーを持ち上げて、液体がティッシュグラインダーの底に戻るようにします。

この手順を 3 回繰り返します。ただし、プランジャーをひねるのは、次の 2 回の繰り返しで 4 回、最後の繰り返しで 3 回だけです。脳組織を過度にテーティングしないようにするため。

その後、プランジャーの側面に1ミリリットルの氷冷DPBSを3つ塗布して、残留脳物質をティッシュグラインダーにすすぎます。次に、ピペッティングで上下させてTRID脳物質を懸濁し、氷上の標識された15ミリリットルの遠心分離管に入れます。ダウンティッシュグラインダーの側面をさらに1ミリリットルの氷冷DPBSですすぎ、同じ15ミリリットルの遠心分離チューブに追加します。

すべてのサンプルが処理されるまで、TRID脳物質を含むすべてのチューブを氷上に置いておきます。次に、15ミリリットルの遠心分離管内のTRID脳内物質をGの740倍で摂氏4度で20分間スピンダウンします。次に、上清を取り除き、ペレット化した脳物質を、コラゲナーゼとDNAの1つの消化酵素の予め調製した混合物の1ミリリットルに再懸濁します。

15ミリリットルの遠心分離管を試験管ラックに入れ、ラックを37度のセルCSウォーターバスに15分間置きます。次に、インキュベーション期間中、チューブをフリックしてサンプルを2回穏やかに攪拌し、組織の解凝集を促進します。その後、各チューブに6ミリリットルのバイスコールドDPBSを追加して、消化酵素を希釈します。

その上下にパイプをつないで再懸濁し、無菌の70ミクロンナイロンメッシュフィルターを介して、氷上の新しいラベル付き15ミリリットル遠心分離管に総量をろ過します。その後、脳細胞懸濁液をGの740倍で摂氏4度で20分間回転させ、単一細胞ペレットを作製します。15ミリリットルのチューブを遠心分離機から取り外し、氷の上に置きます。

次に、次のステップに備えて、遠心分離機の温度設定を摂氏約21度に上げます。次に、セルスナットを完全に取り外し、最初にP 1000マイクロピペットを使用して、セルペレットを1ミリリットルの70%密度遠心分離培地に再懸濁します。次に、密度70%の遠心分離培地を4ミリリットル追加して各チューブに加えます。

キャップをしっかりと装着し、チューブを数回穏やかに反転させて細胞懸濁液を均質化した後、脳細胞を70%密度で再懸濁した15ミリリットルの遠心チューブに移します。氷から試験管ラックに媒体を室温で一度に1つずつ遠心分離します。2ミリリットルの37%密度遠心分離培地溶液を5ミリリットルの70%遠心分離培地に慎重に重ねて、2つの密度遠心分離培地層間にきれいな界面を形成します。

次に、2つの層間の界面の位置を先端の細いマーカーでマークし、遠心分離後に区別がわからなくなったときに簡単に識別できるようにします。15ミリリットルの遠心分離管をGの740倍で室温で20分間休憩なく回転させます。その後、密度遠心分離培地層間の界面が破壊されないように、P 200マイクロピペットをチューブ内に導入して、2つの密度遠心培地層間の界面に蓄積したpbmcを回収します。

PBMCバンドのレベルに一度脂質層を慎重にバイパスし、密度70%の遠心分離媒体層の表面から200マイクロリットルをゆっくりと抽出し、氷上でそれぞれラベル付けされたポリプロピレンファックスチューブに移します。この手順を1回繰り返して、サンプルあたり合計容量400マイクロリットルを達成します。2つの密度遠心分離培地層間にクリーンな界面を形成する実験家の能力は、p BMCの再現性のある単離に不可欠です。

1つは、ベンチトップの上にチューブを20〜30度傾けながら、37%密度の遠心分離媒体をゆっくりと注ぐ必要があります。この図は、ステップ5で示したGR 1陽性CD11B陽性骨髄系細胞およびNK 1.1にゲートを配置した典型的な実験ゲートのゲーティング戦略を示しています。ステップ6で示されたポジティブナチュラルキラー細胞は、ステップ5プライムと6プライムのそれぞれでGZMB発現に基づいて層別化されます。

この図では、GR 1陽性CD 11 B陽性骨髄細胞とNK 1.1陽性ナチュラルキラー細胞をFSCA対SSCAにバックゲーティングすると、比較的大きなサイズの骨髄系集団と比較してナチュラルキラー細胞のリンパ系サイズが小さいことが示され、これら2つのpbmc亜集団の同一性がさらに確認されます。このデータは、GL 26 sital one I glioma細胞のシンゲンへの生着を示しています。XC 57ブラックシックスJマウスの脳は、GL 26 sit GALの1つのI曲線に沿った各データポイントに関連して示されるCD 45陽性PBMC数の動員を迅速に誘導し、腫瘍浸潤pbmcの倍率誘導を表しています。

GGL 26 は、腫瘍移植後または特定の時間に NT 腫瘍を座らせます デモンストレーションで使用された特異的抗体カクテルに基づく GR 1 陽性 CD 11 B 陽性骨髄細胞と NK 1.1 陽性ナチュラルキラー細胞は、腫瘍生着から 48 時間以内に GAL One 欠損腫瘍微小環境に特異的に入ることが示されました。しかし、浸潤する骨髄細胞を浸潤する神経膠腫の総数は、ナチュラルキラー細胞の数をはるかに上回っていました。マスターすると、脳の収穫からフローまでの方法論が概説されます。

サイトメトリー解析は、1人の実験家が約6時間で行うことができます。神経膠腫浸潤pbmc補完実験の総数を公正に比較するためには、各PBMCサンプルの全量をフローサイトメーターで分析することが不可欠です。このような免疫組織化学的分析は、免疫細胞浸潤に関する空間データを取得し、この手順を使用して評価されたものに対応する時点における全体的な腫瘍サイズおよび微小解剖学的構造の測定を可能にするために実施されてもよい。

この手法は、全体的な手順に大きな変更を加えることなく、血漿DNAをコードする癌遺伝子を使用してde novoで生成されたものを含む、多様な脳腫瘍モデルの研究に適用できる可能性があります。このビデオを見た後、マウスの脳への定位および移植片のための神経膠腫細胞懸濁液の調製方法、大量の腫瘍、脳を担持マウスのトランジット方法、および細胞を計量的に分離して流動させる方法、末梢血単核細胞に浸潤する神経膠腫を分析する方法について十分に理解しているはずです。