Name: 神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学ぶ神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離とフローサイトメトリー分析手法。マウス脳腫瘍微小環境における免疫細胞の定量的動態と活性化状態を時系列で評価し、脳腫瘍免疫学の重要な知見を提供します。

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この作品は、神経疾患および脳卒中（NIH / NINDS）MGCにR01-NS074387、R01-NS057711とR21-NS091555を付与する/国立研究所国立衛生研究所によってサポートされていました。 NIH / NINDSはPRLにR01-NS061107、R01-NS076991、R01-NS082311とR21-NS084275を付与。リアのハッピーハート、ミシガン大学総合がんセンターからの助成金は、MGCとPRLに授与。脳神経外科、医学のミシガン学校の大学の学部; NIH助成2UL1-TR000433でサポートされている臨床的および保健研究、ミシガン研究所。 NIH / NCI（国立癌研究所）助成金T32-CA009676に​​よってサポートされているミシガン大学のがん生物学のトレーニンググラント。臨床およびNIH / NINDSグラントT32-NS007222によってサポートされる基本的な神経科学におけるミシガントレーニングの大学。およびNIH / NIGMS（一般医科学研究所）でサポートされているミシガン医学者研修プログラムの大学は、T32-GM007863を付与します。作者博士はカリンMuraszkoと脳神経外科から受信した学術的リーダーシップと支援に感謝再び。 M.ダールグレン、D. Tomford、と優れた行政支援のためのS.ナポリへ。優れた技術支援のためのM. Dzamanへ。そして、ツァイス3D走査型電子顕微鏡の購入に向けての暖かい支援に感謝フィルF.ジェンキンスへ。また、脳単核細胞の単離のための密度遠心メディア媒介戦略の修正版が描かれたハーバード・メディカル・スクールのKuchrooの研究室を認めます。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、初期のマウスの脳の腫瘍微小環境を浸透させてきたPBMCの単離およびフローサイトメトリー分析のための堅牢で再現性のある方法について説明します。神経膠腫細胞懸濁液を定位マウス脳の線条体に移植された実験者によって指定された濃度で生成されます。次いで、マウスを実験的設計によって指定された所定の時点で安楽死させ、それらの脳を採取し、蛍光標識一次抗体の組み合わせで免疫標識された神経膠腫浸潤性のPBMCを単離するために処理されます。免疫標識細胞は、フローサイトメトリーによって定量化されます。ここで紹介するデモは、初期の時点に焦点を当てているが、神経膠腫浸潤PBMCをマウスの瀕死までの任意の時点後の腫瘍生着までで評価することができます。異なる抗体の組み合わせの任意の数の関心iの免疫細胞を検査するために使用することができるような方法は、高度にモジュール化されT細胞、B細胞、NK細胞、単球、およびマクロファージncluding。プロトコルはメスC57BL / 6Jマウス生後8〜10週での使用に最適化されていることに注意してください。この年齢範囲外のマウスは、ここに提示されたデータの代表ではないと同等の時点で細胞数につながる可能性がある、循...

神経膠腫は、中枢神経系（CNS）内に形質転換されたグリアから生じる神経上皮脳腫瘍のクラスです。すべての神経膠腫の、世界保健機関（WHO）グレードIVの神経膠腫、またはグリア芽腫（GBM）は、1最も一般的で致命的です。 GBMは、現在の標準のケアテモゾロミド2と放射線プラス付随およびアジュバント化学療法に続いて可能な限り腫瘍切除で構成さに非常に難治性です。これらの致命的な癌は5年3後の疾患の生存患者のわずか5％の初期診断時からの生存の唯一の15〜18ヶ月の悲惨な予後を運びます。 血液脳関門（BBB）の存在は、脳内の4細胞（APC）のプロフェッショナル抗原提示の欠如、および真正なリンパ管構造の以前に同定されていない存在は、免疫特権としてGBMの概念をもたらしました。しかし、今、多くの研究笙これらの脳癌は確かに、単球、マクロファージ、および骨髄由来抑制細胞（のMDSC）5を含む 、原点に主に骨髄ある末梢の免疫細胞の動員を生み出すことワットGBMはまた、6,7-プロ腫瘍形成になるための脳常駐ミクログリアの活性に影響を与えます。そのようなCD8 + T細胞8とCD56 +ナチュラルキラー細胞9などのリンパ系細胞はまた、腫瘍微小環境内に存在しているが、はるかに少ない数で、思ったことは、（、腫瘍関連マクロファージに神経膠腫由来因子によって扇動免疫抑制機能のためであるとするTAM）10。 CD4 + T細胞は、GBMにも存在するが、この集団の多くはまた、CD25とのFoxP3、免疫調節性T（TのREG）細胞11のメーカーを表しています。 GBMの全体的な免疫抑制状態は、免疫学的脱出し、腫瘍の進行12のプロモーションで最高潮に達します。 13-19を開発するために、脳腫瘍immunosuppressonのメカニズムを克服するために取り組んできました。この作品の集大成が今新たに診断されたGBM（：NCT01811992 ClinicalTrials.gov識別子）を持つ患者のために組み合わせた細胞傷害性および免疫刺激治療を評価するために設計された臨床試験につながっています。 私たちの最新作は、マウスGL26およびラットCNS-1 GBM細胞は、βガラクトシド結合レクチンガレクチン-1（GAL-1）20を大量に生産することにより、抗腫瘍NK細胞免疫監視をブロックすることを示しています。これは、shRNAを媒介遺伝子ノックダウンを用いた神経膠腫細胞におけるGAL-1の発現を抑制することにより実証された。 インビトロ experimenTSは、GAL-1欠損神経膠腫細胞は、培養中に正常に増殖していることを示した、まだ同系C57BL / 6JまたはRAG1に頭蓋内移植後すぐに急速な拒絶を受けた- / -マウスでは、このように、このフォームで、TまたはB細胞の独立性を確立します腫瘍拒絶。抗アシアロGM 1抗血清またはモノクローナルNK1.1抗体とNK細胞の免疫枯渇は、GAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応におけるNK細胞の役割を確立し、頭蓋内GAL-1欠損神経膠腫の成長の完全な回復につながりました。現在、GR-1 + / CD11bのの免疫枯渇+骨髄細胞は、このように、NK媒介ギャルの補助で骨髄細胞のための不可欠な補助的な役割を明らかにし、NK細胞の存在にもかかわらず、GAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応を予防するのに十分であることを示しています-1欠損腫瘍溶解（未発表データ）。この予想外の結果は、末梢血単核細胞（PBMC）の単離と解析のための包括的なプロトコルを開発するために私たちをリードしてきました私たちはより良いGAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応を述免疫浸潤イベントを特徴づ​​けることができるようにすぐに頭蓋内移植後の脳の腫瘍の微小環境を浸透させます。 この方法は、GL26-Citを呼ばれる構成的に発現mCitrine蛍光タンパク質は、蛍光顕微鏡21による直接の腫瘍細胞の可視化を可能にするマウスGL26神経膠腫細胞を用いて、ここに示されています。これらの細胞は、定位的に同系のC57BL / 6Jマウスの脳に移植され、前のマウス安楽死に24、48、または72時間増殖させます。神経膠腫浸潤PBMCを、次に抗-CD45を用いて単離し、免疫標識され、-GR-1、-CD11bおよびグランザイムBの細胞内免疫標識と一緒-NK1.1細胞表面抗体（GZMB）。抗体のこの特定の組み合わせは、腫瘍浸潤のGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11bおよびNK1.1 + NK細胞、細胞型、我々は、Bを持っているの同定を可能にしますEENは、GAL-1欠損腫瘍拒絶に関与します。 GAL-1欠損GL26-のCIT神経膠腫の免疫浸潤プロファイルは、GL26-CIT-gal1iとしてここでいう、その後非が含まれているGAL-1 GL26-CIT-NTと呼ばれるの正常なレベルで発現する神経膠腫のものと比較します対照shRNAのヘアピンをターゲットに。プロトコルは、同所同系のC57BL / 6Jマウスの線条体にこれらの細胞を生着する方法についての説明が続いて試験管内でどのように文化GL26-Citの神経膠腫細胞上の説明で始まり。その後、フローサイトメトリー分析のための神経膠腫浸潤PBMCの単離及び免疫標識に必要な手順を列挙するために進みます。プロトコルは、標準的なデータ分析とグラフ表示の説明を終わります。 デモでは、両方のGr-1 + / CD11bの+骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞は優先的に48内GAL-1欠損脳の腫瘍微小環境内に蓄積することが明らかになりました腫瘍移植の時間、これらの腫瘍は急速に完全な腫瘍溶解約1週間後の腫瘍生着20を受ける理由を説明するのに役立ちます結果。この方法は、脳への免疫浸潤に関する時間データが要求されるインビボでの異なる実験計画の数に容易に適応可能です。単一の実験者は、分析すべき試料の数に応じて、約4-6時間で神経膠腫浸潤PBMCのフローサイトメトリー分析するために脳の収穫からプロトコルを実行することができます。この方法はまた、特に腫瘍微小環境によって誘導される免疫抑制表現型を識別するよう脳に浸潤するものと比較するために、腫瘍担持マウスでのPBMCの循環プロフィールを特徴づけることを目的とした実験と組み合わせることができます。これと同じような方法の適用は、脳の腫瘍微小環境への末梢免疫細胞の輸送に関与する因子の理解を容易にするはずです。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコEagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td> の <td>4.5g/L D-グルコース、L-グルタミン、25 mM HEPES、フェノールレッドによる改造&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなし</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>オメガサイエンティフィック</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml ペニシリン; 10,000 μ;g/mlストレプトマイシン&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 硫酸塩&nbsp;</td><td>オメガサイエンティフィック株式会社</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>from Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase 非哺乳類トリプシン代替品&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>の SV30030.01</td><td>in DPBS with EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>位相差血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0.1 mm 深さ</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 0.9% NaCl 注射、USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>10 ml バイアル</td></tr><tr><td>0.6 ml 円錐形ポリプロピレン マイクロチューブ</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>アチパメゾール塩酸塩注射</td><td>オリオン ファーマ</td><td>NDC:52483-6298</td><td>5 mg / ml溶液</td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩注射</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC:0409-2051</td><td>100 mg / ml溶液</td></tr><tr><td>デクスメデトミジン塩酸塩注射</td><td>Zoetis</td><td>注射 NDC:54771-2805</td><td>0.5 mg / ml溶液</td></tr><tr><td>キシラジン塩酸塩注射</td><td>ロイド</td><td>NDC:61311-481</td><td>100 mg / ml溶液</td></tr><tr><td>カルプロフェン注射</td><td>ファイ</td><td>ザーNDC:61106-8501</td><td>50 mg/ml溶液</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン塩酸塩注射</td><td>レキットベンキーザー</td><td>NDC:12496-0757</td><td>0.3 mg/mlアンプル</td></tr><tr><td>1 mlツベルクリン注射器&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12;(0.45 mm x 13 mm)シリンジ針&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>外科用バリカン</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>プロビドンヨード溶液</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC:52380-1905</td></tr><tr><td>滅菌ワセリン眼科軟膏&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC:17033-211</td><td></td></tr><tr><td>70%イソプロピルアルコール準備パッドケン</td><td>ドール</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>不織布、4 "x 4"、4層&nbsp;</td></tr><tr><td>1.7 ml円錐形ポリプロピレンマイクロチューブジェ</td><td>ネシーサイエンティフィ</td>ック<td>22-281</td><td></td></tr>マウス<tr><td>定位フレーム</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>サージカルランプ</td><td>フィリップスバートン</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II可変スポットライト</td></tr><tr><td>湾曲解剖鉗子</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>コリブリ開創器&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>コードレス精密電動ドリル</td><td>Dremel&nbsp;</td><td>1100-01</td>ス<td>タイラスモデル;ドッキングステーション付き7.2ボルトリチウムイオン</td></tr>彫刻<tr><td>カッター</td>ド<td>レメル</td><td>105</td><td>1/32インチまたは0.8mmビット直径</td></tr>マイクロ<tr><td>リットルシリンジ</td>ハ<td>ミルトン</td><td>75</td>ハ<td>ミルトンマイクロリットルシリンジ700シリーズ; 5 &mu;l容量</td></tr>マイクロ<tr><td>リットルシリンジ針</td>ハ<td>ミルトン</td><td>7762-06</td><td>33 G、スモールハブRN NDL、1.5インチ、ポイントスタイル3、6 / PK</td></tr><tr><td>エチロン3-0ブラックモノフィラメントナイロン縫合糸&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>磁気攪拌子</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7.9 mm直径x 50 mm長さ(5/16 "直径x2 "長さ)</td></tr><tr><td>1 Lガラススクリューキャップ収納ボトル</td><td>コーニング</td><td>1395</td><td>タイプ1、クラスAホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>1,000 U/ml 溶液</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>コール・パーマー・インスツルメンツ・グループ</td><td>77200-60</td><td>マスター・フレックス・イージー・ロード II コンソール・ドライブ</td></tr><tr><td>圧縮カルボゲン (95% O2 / 5% CO2)</td><td>地元のベンダーから入手可能</td><td>N/A</td><td>Aタイプ、大型シリンダー&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 &frac12;" アルミハブ 鈍い針</td><td>ケンドール</td><td>8881202363</td><td>0.9 mm x 38.1 mm</td></tr><tr><td>ポリウレタン アイス バケツ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-591-45</td><td>容量: 0.152 オンス (4.5L)</td></tr> <tr><td>コラゲナーゼ (タイプ I-S)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>C1639</td><td>クロストリジウム ヒストリチカム&nbsp;</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI</td><td>ワージントンバイオケミカル株式会社</td><td>LS002007</td><td>>2,000クニッツ単位/mg乾燥重量</td></tr>帯<tr><td>電防止ポリスチレン六角形計量皿</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>20157-3</td><td>トップ内径 115 mm、ベース内径 85 mm、容量 203 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>ステンレス鋼の片刃カミソリの刃&nbsp;</td><td>ガーベイ</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>ボーンロンジャーFST</td><td></td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>止血</td><td></td><td>FST13014-14</td><td></td></tr><tr><td>大型解剖はさみ</td>テッド<td>ペラ株式会社</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>小さな解剖はさみ</td><td>FST14094-11</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鈍い端の鉗子</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml ガラス ダウンス ティッシュ グラインダー</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Density 遠心分離媒体&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清学的ピペット</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>12-104</td><td>単回使用; 滅菌</td></tr><tr><td>70 &mu;m 滅菌ナイロンメッシュセルストレーナー&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>PE標識ラット抗マウスGr-1 (クローン:RB6-8C5)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-標識ラット抗マウスCD11b (クローン:M1/70)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700標識ラットIgG2b、およびκ;(クローン:RTK4530)アイソタイプコントロール&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>APC標識マウスIgG2a, &kappa;(クローン:eBM2a)アイソタイプ制御&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>PE標識ラットIgG2b、およびκ;(クローン:eB149/10H5)アイソタイプコントロール&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-標識ラットIgG2b、およびκ;(クローン:RTK4530)アイソタイプコントロール</td><td>バイオレジェンド</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &kappa;(クローン:MOPC-21)アイソタイプ制御&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>円錐形底部&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mlポリプロピレン遠心分離管Genesee</td><td>Scientific</td><td>21-108</td><td>円錐底</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm丸底ポリプロピレンFACSチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria 特注研究 製品フローサイトメーター/セルソーター</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>クラスII生物学的安全キャビネット</td><td>ベイカー</td><td>カンパニーSG603</td><td>モデル:SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

私たちの研究室では最近、癌細胞はβガラクトシド結合レクチンガレクチンの発現が欠損しレンダリングされた場合に、ナチュラルキラー（NK）細胞はすぐに頭蓋内移植後に同所移植したマウスGL26およびラットCNS-1悪性神経膠腫を根絶することができることを実証しました-1（GAL-1）。より最近の研究は現在、GR-1 + / CD11bの+骨髄系細胞の集団がこの効果に重要であることを示しています。優れたNK細胞と骨髄細胞は、我々は、神経膠腫浸潤末梢血単核細胞（PBMC）の単離および分析のための総合的なプロトコルを開発したGAL-1欠損腫瘍拒絶を付与するために協力するメカニズムを理解するために。この方法は、shRNAのノックダウンを経由してGAL-1欠損レンダリングされたものとGAL-1を発現するGL26の神経膠腫の腫瘍微小環境へのPBMCの浸潤を比較することによって、ここに示されています。プロトコルはどのように文化の説明から始まり、GL26のCEを準備同系のC57BL / 6Jマウスの脳への接種のためにLLS。その後、初期の脳の腫瘍微小環境から神経膠腫浸潤PBMCの単離およびフローサイトメトリー解析に必要な手順について説明します。この方法は、脳への免疫浸潤に関する時間データが要求されるインビボでの実験計画の数に適応可能です。神経膠腫浸潤PBMCを、すぐに独立した実験を通して腫瘍一致した時点から観察同様の細胞数と24時間後に腫瘍生着などの頭蓋内腫瘍から単離することができるような方法は、高感度で再現性の高いです。単一の実験者は、分析されるサンプルの数に応じておよそ4-6時間で神経膠腫浸潤PBMCのフローサイトメトリー分析するために脳から採取方法を実行することができます。代替の神経膠腫モデルおよび/または細胞特異的な検出抗体は、他のいくつかのIMMUNの浸潤を評価するために実験者の裁量で使用することができます手順全体への変更を必要とせずに、目的の電子細胞タイプ。

CD11bの対FSC-W→CD45対数→GR-1対SSC-W→FSC-H対SSC-A→SSC-H対FSC-A→：次のゲーティング戦略は、典型的な実験のために使用されています数対NK1.1。ゲイツ氏はその後GZMB式（図5A）に基づいて層別化されたGR-1 + / CD11bの+骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞上に置きました。 NK1.1 + NK細胞およびGR-1 + / CD11bのSSC-Aは、NK細胞の小さいリンパサイズおよび骨髄細胞の比較的大きなサイズを確認する対FSC-Aへの我々の実験で+骨髄細胞（と同定された細胞をバックゲート図5B）。生データファイル（ すなわち 、FCSファイル）は、FlowJoソフトなどの市販のフローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアにより分析されます。 18 C57BL / 6Jマウス...

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

この手順の全体的な目標は、初期の脳腫瘍微小環境に浸潤した末梢血単核細胞の数を特徴付け、定量化することです。この方法は、末梢免疫細胞を脳腫瘍微小環境に輸送するために重要な因子を特定することにより、脳腫瘍免疫学の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、このCNSに侵入した白血球の数と活性化状態に関する時間依存の定量的データが得られることです。麻酔をかけたマウスを定位フレームにセットした後、メスの刃を使用して前頭骨から後頭骨まで頭蓋骨に2cmの正中線切開を行います。次に、Collibraリトラクターを使用して切開部で皮膚を引っ込めます。その後、33ゲージの針を備えたマイクロリットルシリンジをBMAの真上に下げます。腫瘍移植の標的部位に到達するように針の位置を調整します。次に、26ゲージの針を備えた1ミリリットルのツベルクリン注射器を使用して、その後、骨膜を穏やかに刺激することにより、この位置に印を付けます。0.8ミリメートルのドリルビットを使用して、穴を開けながら下にある硬膜に到達するまで、ターゲットサイトの頭蓋骨に穴を開けます。断続的な圧力を加えた後、ドリルビットを頭蓋骨表面からすばやく取り外して、過度の熱と力を避けます。次に、1.7ミリリットルの円錐形ポリプロピレンマイクロチューブに0.9%塩化ナトリウムでマイクロリットルシリンジを洗い流し、針が詰まっていないことを確認します。腫瘍細胞が入った0.6ミリリットルの円錐形ポリプロピレンマイクロチューブを数回静かにフリックして、細胞を完全に蘇生します。次に、2マイクロリットルの細胞をマイクロリットルのシリンジに引き込み、シリンジに気泡が入らないようにします。1マイクロリットルの細胞を70%イソプロピルアルコール調製パッドに分注し、シリンジに正確に1マイクロリットルの腫瘍細胞を残します。その後、針が硬膜に触れるまで針を下ろします。次に、針を脳内に3.5ミリメートル下げ、続いて針を0.5ミリメートルゆっくりとスムーズに引っ込めます。シリンジプランジャーを1〜2分間押し下げて細胞を送達します。深く麻酔されたマウスで経心筋灌流を行うこと。心臓の左心室に鈍い針を挿入します。解剖ハサミの小さなペアを使用して右心房を切り取り、放血灌流、肝臓と肺が完全に血液不足に白くなるまで数分間チロ溶液でマウスの循環器系を可能にします。総量の血液が右心房から出続けないようにします。20ゲージのアルミニウムハブを左心室から鈍い針を取り外す前に。針を取り外した後、押し出した発泡スチロールブロックからマウスのピンを外し、マウスの腹側を下にしておきます。大きな解剖ハサミを使用して、頭を体の他の部分から分離します。次に、頭蓋骨を露出させるために、後頭骨から鼻まで機能する小さな解剖ハサミを使用して、正中線上の頭皮を切断します。その後、頭蓋骨の両側の皮膚を引っ込め、頭蓋骨をしっかりと保持します。一対の骨URSを使用して、後頭骨から頭蓋骨を慎重に突破し、脳の背側と外側の表面を完全に露出させるために前進します。頭蓋骨からマウスの脳を損傷を与えることなく採取することは、最初は難しいと判明するかもしれません。この技術に不慣れな方は、適切な実験を行う前に何度か試してみるとよいでしょう。頭蓋骨を切除したら、マウスの頭を上に向けます。脳を頭蓋骨から解放するために、脳の基部にある脳神経を切断します。この手順では、きれいな片刃のカミソリの刃を使用して、脳の中心を矢状に切り込むことにより、腫瘍を含む脳の領域を分離します。2つの半球を解剖するには、同側の半球の内側を下にして、小脳に冠状動脈を1つ、嗅球にもう1つの冠状動脈を切開して、腫瘍インプラントを含む標的組織を分離します。次に、1ミリリットルのDPBSが入ったラベル付きのガラス製ダウンティッシュグラインダーにターゲット組織を置きます。プランジャーを完全に押し下げ、7回ひねって組織を破壊します。その後、プランジャーを持ち上げて、液体がティッシュグラインダーの底に戻るようにします。この手順を 3 回繰り返します。ただし、プランジャーをひねるのは、次の 2 回の繰り返しで 4 回、最後の繰り返しで 3 回だけです。脳組織を過度にテーティングしないようにするため。その後、プランジャーの側面に1ミリリットルの氷冷DPBSを3つ塗布して、残留脳物質をティッシュグラインダーにすすぎます。次に、ピペッティングで上下させてTRID脳物質を懸濁し、氷上の標識された15ミリリットルの遠心分離管に入れます。ダウンティッシュグラインダーの側面をさらに1ミリリットルの氷冷DPBSですすぎ、同じ15ミリリットルの遠心分離チューブに追加します。すべてのサンプルが処理されるまで、TRID脳物質を含むすべてのチューブを氷上に置いておきます。次に、15ミリリットルの遠心分離管内のTRID脳内物質をGの740倍で摂氏4度で20分間スピンダウンします。次に、上清を取り除き、ペレット化した脳物質を、コラゲナーゼとDNAの1つの消化酵素の予め調製した混合物の1ミリリットルに再懸濁します。15ミリリットルの遠心分離管を試験管ラックに入れ、ラックを37度のセルCSウォーターバスに15分間置きます。次に、インキュベーション期間中、チューブをフリックしてサンプルを2回穏やかに攪拌し、組織の解凝集を促進します。その後、各チューブに6ミリリットルのバイスコールドDPBSを追加して、消化酵素を希釈します。その上下にパイプをつないで再懸濁し、無菌の70ミクロンナイロンメッシュフィルターを介して、氷上の新しいラベル付き15ミリリットル遠心分離管に総量をろ過します。その後、脳細胞懸濁液をGの740倍で摂氏4度で20分間回転させ、単一細胞ペレットを作製します。15ミリリットルのチューブを遠心分離機から取り外し、氷の上に置きます。次に、次のステップに備えて、遠心分離機の温度設定を摂氏約21度に上げます。次に、セルスナットを完全に取り外し、最初にP 1000マイクロピペットを使用して、セルペレットを1ミリリットルの70%密度遠心分離培地に再懸濁します。次に、密度70%の遠心分離培地を4ミリリットル追加して各チューブに加えます。キャップをしっかりと装着し、チューブを数回穏やかに反転させて細胞懸濁液を均質化した後、脳細胞を70%密度で再懸濁した15ミリリットルの遠心チューブに移します。氷から試験管ラックに媒体を室温で一度に1つずつ遠心分離します。2ミリリットルの37%密度遠心分離培地溶液を5ミリリットルの70%遠心分離培地に慎重に重ねて、2つの密度遠心分離培地層間にきれいな界面を形成します。次に、2つの層間の界面の位置を先端の細いマーカーでマークし、遠心分離後に区別がわからなくなったときに簡単に識別できるようにします。15ミリリットルの遠心分離管をGの740倍で室温で20分間休憩なく回転させます。その後、密度遠心分離培地層間の界面が破壊されないように、P 200マイクロピペットをチューブ内に導入して、2つの密度遠心培地層間の界面に蓄積したpbmcを回収します。PBMCバンドのレベルに一度脂質層を慎重にバイパスし、密度70%の遠心分離媒体層の表面から200マイクロリットルをゆっくりと抽出し、氷上でそれぞれラベル付けされたポリプロピレンファックスチューブに移します。この手順を1回繰り返して、サンプルあたり合計容量400マイクロリットルを達成します。2つの密度遠心分離培地層間にクリーンな界面を形成する実験家の能力は、p BMCの再現性のある単離に不可欠です。1つは、ベンチトップの上にチューブを20〜30度傾けながら、37%密度の遠心分離媒体をゆっくりと注ぐ必要があります。この図は、ステップ5で示したGR 1陽性CD11B陽性骨髄系細胞およびNK 1.1にゲートを配置した典型的な実験ゲートのゲーティング戦略を示しています。ステップ6で示されたポジティブナチュラルキラー細胞は、ステップ5プライムと6プライムのそれぞれでGZMB発現に基づいて層別化されます。この図では、GR 1陽性CD 11 B陽性骨髄細胞とNK 1.1陽性ナチュラルキラー細胞をFSCA対SSCAにバックゲーティングすると、比較的大きなサイズの骨髄系集団と比較してナチュラルキラー細胞のリンパ系サイズが小さいことが示され、これら2つのpbmc亜集団の同一性がさらに確認されます。このデータは、GL 26 sital one I glioma細胞のシンゲンへの生着を示しています。XC 57ブラックシックスJマウスの脳は、GL 26 sit GALの1つのI曲線に沿った各データポイントに関連して示されるCD 45陽性PBMC数の動員を迅速に誘導し、腫瘍浸潤pbmcの倍率誘導を表しています。GGL 26 は、腫瘍移植後または特定の時間に NT 腫瘍を座らせます デモンストレーションで使用された特異的抗体カクテルに基づく GR 1 陽性 CD 11 B 陽性骨髄細胞と NK 1.1 陽性ナチュラルキラー細胞は、腫瘍生着から 48 時間以内に GAL One 欠損腫瘍微小環境に特異的に入ることが示されました。しかし、浸潤する骨髄細胞を浸潤する神経膠腫の総数は、ナチュラルキラー細胞の数をはるかに上回っていました。マスターすると、脳の収穫からフローまでの方法論が概説されます。サイトメトリー解析は、1人の実験家が約6時間で行うことができます。神経膠腫浸潤pbmc補完実験の総数を公正に比較するためには、各PBMCサンプルの全量をフローサイトメーターで分析することが不可欠です。このような免疫組織化学的分析は、免疫細胞浸潤に関する空間データを取得し、この手順を使用して評価されたものに対応する時点における全体的な腫瘍サイズおよび微小解剖学的構造の測定を可能にするために実施されてもよい。この手法は、全体的な手順に大きな変更を加えることなく、血漿DNAをコードする癌遺伝子を使用してde novoで生成されたものを含む、多様な脳腫瘍モデルの研究に適用できる可能性があります。このビデオを見た後、マウスの脳への定位および移植片のための神経膠腫細胞懸濁液の調製方法、大量の腫瘍、脳を担持マウスのトランジット方法、および細胞を計量的に分離して流動させる方法、末梢血単核細胞に浸潤する神経膠腫を分析する方法について十分に理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。...

パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

このビデオプロトコルは、細胞分裂の頻度に基づいて、ヒト神経膠芽腫の細胞の異なるサブ集団の同定と分離するための蛍光色素カルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）のアプリケーションを示しています。...

カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）を用いてヒト神経膠芽腫のスロー非分裂細胞の同定および単離

このビデオは、機械的解離と酵素消化を使用して、マウスの脳から腫瘍浸潤末梢血単核細胞を分離する方法を示しています。これに続いて、密度勾配遠心分離を行い、免疫細胞を採取してさらに分析します。...

マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

炎症は虚血性脳卒中の病因において中心的な役割を果たします。証拠の増加は、それが初期の脳損傷を悪化させるだけでなく、後の修復にも寄与する両刃の剣として機能することを示唆しています。このプロトコルは、虚血性脳からの免疫細胞の単離と、その後のフローサイトメトリー表現型について記述しています。...

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。...

患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP)...

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

私たちは、間質液の流れを組み込んだ浸潤前部の神経膠腫腫瘍微小環境を再現する方法を提示します。このモデルは、ヒアルロン酸-コラーゲンI型ハイドロゲルを組織培養インサートに含ませたもので、液圧ヘッドを適用することができる。浸潤を定量化し、細胞を単離または溶解することができます。...

間質流を有する浸潤性神経膠腫微小環境の光重合性ヒアルロン酸コラーゲンモデル

損傷した脊髄のミクログリア(MG)と末梢浸潤マクロファージ(Mø)の同定は困難です。このプロトコールでは、フローサイトメトリー(FCM)を使用して、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møを同定しました。この技術は、MGとMøの役割を理解するために、他の中枢神経系疾患にも適用できます。...

フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

ここでは、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞機能を評価するためのプロトコルを紹介します。この方法は、神経免疫相互作用の詳細な調査を可能にし、他の神経変性疾患の研究にも適応できるため、脳卒中病理における免疫応答の理解を深めることができます。...

ミニ脳卒中マウスモデルにおける神経免疫相互作用の単離とフローサイトメトリー評価

学ぶ神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離とフローサイトメトリー分析手法。マウス脳腫瘍微小環境における免疫細胞の定量的動態と活性化状態を時系列で評価し、脳腫瘍免疫学の重要な知見を提供します。

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

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