マウスで睡眠を測定するためのポリグラフ記録手順
2016年1月25日
自由に行動するマウスの脳波(EEG)と筋電図(EMG)の記録は、行動と生理機能を睡眠と覚醒と関連付けるための重要なステップです。本明細書に記載の実験プロトコルは、マウスにおけるEEGおよびEMG記録を取得するためのケーブルベースのシステムを提供する。
このポリグラフ記録手順の全体的な目標は、マウスの警戒状態を決定し、覚醒状態、急速眼球運動睡眠、または非急速眼球運動睡眠に費やされた時間を測定することです。この方法は、行動する動物の皮質ニューロンの活動と行動と生理学を関連付けようとするほぼすべての神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多くのノード、脳波、筋電図を記録でき、光ファイバーや注入カニューレなどの他の脳インプラントと組み合わせることができることです。
電極の埋め込みは適切に行う必要があり、電極の品質は物理的状態を判断するために非常に重要であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクである高田洋子さんです。始める前に、ホットビーズ滅菌器ですべての手術器具を滅菌してください。
つま先をつまんでマウスが麻酔されていることが確認されたら、頭と首の毛を剃り落とします。次に、家を定位固定装置フレームに固定し、2つのイヤーバーの間に頭を固定します。その後、眼に眼軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。
剃った肌をアルコールとヨウ素ベースのスクラブでクレンジングします。次に、メスで正中線に沿って切断して頭蓋骨を露出させ、クリップを使用して皮膚を横に固定して手術領域を開いたままにします。0.8ミリメートルのドリルで超硬カッターを使用して、2つの穴を開けます。
前頭皮質領域に1つの穴を開けます。右半球の頭頂部に2番目の穴を置きます。次に、宝石商のドライバーを使用して、ステンレス鋼のEEG記録ネジを穴にねじ込みます。
わずか2〜2回転半でネジを挿入して、皮質上の硬膜外の位置を取得します。ネジは一度挿入すると小刻みに動かないようにする必要があります。これは非常に重要です。
次に、ピンを頭蓋骨まで上向きにして電極アセンブリを固定します。電極はまっすぐに取り付ける必要があります。綿棒を使用して電極の位置を固定し、シアノアクリレートと歯科用セメントを使用して電極を接着します。
次に、僧帽筋に小さな穴を開け、その穴にEMG電極を挿入します。その後、直径0.1mmの絹糸で皮膚を縫合します。次に、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外し、ヒートパッドの上に置きます。
マウスにアンピシリンとメロキシカムの腹腔内注射を行い、マウスが胸骨の横臥を回復するまでマウスを監視します。.次に、マウスを一人で収容します。電極を埋め込んでから1週間後、マウスを防音記録室の実験ケージに移します。
マウスのEEG / EMG電極アセンブリをスリップリングに接続された記録ケーブルに固定します。ADコンバーターケーブルをEEG / EMG信号フィルターに接続します amplifierスリップリングに接続された。ADコンバーターを使用して信号を128ヘルツのデジタル信号に変換し、最後に信号をコンピューターに記録します。
マウスを記録室で2〜3日間慣らします。EEG/EMGの記録に薬物投与が含まれている場合は、薬物投与が行われた日と同様に、毎日マウスを優しく扱ってください。その後、EEG / EMG記録ソフトウェアを起動します。
まず、[データファイル情報]タブをクリックし、[ファイル名]の横にあるボックスをクリックします。ファイル名を入力し、[保存] をクリックします。次に、[記録条件]タブから、記録する必要のあるすべてのEEG / EMGチャネルを選択します。
また、このタブでサンプリング周波数を選択します。次に、[チャネル情報]タブで、選択したチャネルが正しく表示されているかどうかを確認します。確認したら、最初に[タイマー設定]タブを選択してレコードを開始します。
次に、[モニター]をクリックしてEEGとEMGを表示します。信号が正しく表示される場合は、メインタイマーエリアで録音の開始と終了のクロック時間を設定します。次に、 モニター ボタンをクリックして録音を開始します。
次に、ベースライン条件下でのシグナルと、数日間にわたるさまざまな治療条件下でシグナルを記録します。実験が終了したら、マウスをペントバルビタールで安楽死させます。EEG/EMG解析用のソフトウェアを起動します。
KCDファイルであるEEG/EMG生データを開きます。[Sleep] タブをクリックし、[Epoch time] を 10 秒に設定します。次に、Multi-screeningを選択すると、EEGとEMGの振幅とEEGのパワースペクトル分析に基づいて、10秒のエポックすべてが3つのステージに自動的にスコアリングされます。
次に、EEGタブのFFT条件をクリックします。そこで、パワースペクトル解析のパラメータを設定します。EEGの2秒ごとに対応する256個のデータムポイントを使用し、ハミングウィンドウ機能を使用し、エポックごとに平均5つのスペクトルを使用します。
次に、[OK]をクリックします。ここで、[スクリーニングの開始]をクリックして自動スクリーニングを開始します。次に、RAFファイル形式で保存された保存されたデータを開き、自動スクリーニングの結果を確認します。必要に応じて、標準基準を満たさない場合は結果を修正します。
修正するには、誤ってスコアリングされたエポックをマウスの左ボタンをクリックしたまま、誤ってスコアリングされたエポックの文字列にカーソルをドラッグします。マウスの左ボタンを放し、ポップアップウィンドウで正しい動作状態を選択します。ベースライン条件下では、マウスは夜間の性質と一致する明確な概日睡眠覚醒リズムを示しました。
12時間の光の期間中、マウスは平均して6.7時間のノンレム睡眠と0.9時間のレム睡眠を示しました。一方、12時間の暗部では、覚醒が優勢でした。他の測定値も記録されました。
これらには、睡眠エポック分布、その平均持続時間、および各警戒状態のステージ遷移が含まれていました。ノンレム睡眠とレム睡眠のEEGパワースペクトルは、ノンレム睡眠の0.5〜4ヘルツの周波数範囲で強いEEGパワー密度を示していますが、レム睡眠のパワー密度は6〜10ヘルツです。カフェインが睡眠に及ぼす影響を評価するために、C57ブラック6マウスを1日はビヒクルで治療し、翌日はカフェインで治療しました。
カフェインの腹腔内注射は、光サイクルの早い段階で行われました。予想通り、記録はカフェインがマウスの覚醒量を増加させることを明らかにしました。注射後3時間で覚醒度が3倍に増加しました。
一度習得すれば、電極の埋め込み手順は20分以内に完了します。24時間の脳波データのスコアリングと修正は、約30分で行うことができます。このビデオを見れば、マウスの脳波と筋電図の記録を設定する方法と、動物が起きているか眠っているか、または眠っているか、またはどのくらいの時間かを評価する方法についてよく理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、EEG（脳波）およびEMG（筋電図）の測定を通じて、自由行動下にあるマウスの覚醒状態を評価するためのポリグラフ記録手順について詳述します。この手法により、研究者は行動および生理学的状態を睡眠状態で相関させることができ、皮質ニューロンの活動に関する知見を得ることが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 行動解析
背景
- 睡眠と覚醒の研究には、脳波（EEG）および筋電図（EMG）の記録が不可欠です。
- この手法は、包括的なデータ収集のために、他の脳インプラントと組み合わせることが可能です。
- 正確な測定には、電極の適切な植え込みが極めて重要です。
- 視覚的なデモンストレーションにより、手術手順への理解が深まります。
研究の目的
- マウスの覚醒状態を判定すること。
- さまざまな睡眠状態で過ごした時間を測定すること。
- 生理学的データと行動観察を相関させること。
使用した手法
- マウスにおけるEEGおよびEMGのポリグラフ記録。
- データ収集のためのケーブルベースシステムの利用。
- 無菌条件下での電極の外科的植込み。
- 植込み手順の視覚的な実演。
主要な結果
- 複数の生理学的信号の記録に成功した。
- 自由行動下のマウスにおける睡眠と覚醒を評価することが可能である。
- 他の実験装置との統合が可能である。
- 電極配置の精度がデータの正確性に大きく影響する。
結論
- この手法は、行動と生理機能の間の関係を理解するために不可欠です。
- これは、さまざまな神経科学分野における今後の研究のための枠組みを提供します。
- 信頼性の高い結果を得るには、適切な技術と装置が極めて重要です。
よくある質問
産業界への実用的意義
前臨床モデルにおける睡眠・覚醒状態の正確な評価は、行動表現型を基礎となる神経活動に結びつけることで、中枢神経系（CNS）標的薬候補のリスクを軽減するために不可欠です。このポリグラフ記録法により、自由行動下のマウスにおける覚醒状態の定量的かつ縦断的なモニタリングが可能となり、睡眠調節化合物のメカニズム検証を支援します。本手法は、ターゲットエンゲージメントから機能的アウトプットまでのトランスレーショナルな連続性を提供し、早期創薬パイプラインにおける意思決定（go/no-go判断）に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：EEG/EMGで定義された睡眠状態を、薬理学的または遺伝学的操作と相関させることで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：メカニズムの曖昧さを排除する、客観的かつ定量化可能な覚醒状態の測定を通じて、機能的ターゲットの妥当性確認を支援する。
- 予測的価値：ターゲットへの結合および経路調節への信頼性を高める、用量反応およびタイムコースデータを生成する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：スペクトル分析および振幅閾値を用いた自動スコアリングパイプラインに適した、標準化された高忠実度のEEGおよびEMG信号を生成します。
- 定量的出力：覚醒、NREM睡眠、およびREM睡眠のエポックベースの分類を提供し、再現性のある群間比較を可能にします。
- 拡張性：慢性記録セットアップと互換性があり、治療条件やサーカディアンサイクルにわたる縦断的な評価が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 定量可能なNREM睡眠およびREM睡眠の指標を通じてヒトの睡眠構造をモデル化し、睡眠障害および神経精神疾患の研究を支援する。
- トランスレーショナルバイオマーカーの整合性： EEGパワースペクトルのシフト（NREM睡眠ではdelta 0.5–4 Hz、REM睡眠ではtheta 6–10 Hz）が、睡眠状態の移行を示す定量可能なバイオマーカーとして機能する。
- リスク調整後の進展： 睡眠・覚醒分布データは、特に覚醒または鎮静に影響を与えるCNS活性化合物における、前臨床段階の安全性および有効性プロファイリングに寄与する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、仮説検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、神経精神疾患治療薬の開発において、分子レベルの介入と行動上のアウトプットを橋渡しする生理学的リードアウトを提供します。
- 探索生物学：細胞型特異的な操作と生理学的読み出しを組み合わせることで、覚醒および睡眠・覚醒の移行を制御する神経回路の仮説駆動型の検証を促進します。
- スクリーニング：24時間周期における睡眠構造への化合物の影響を評価するための、アッセイ準備が整った再現性のある覚醒状態のモニタリングを可能にします。
- 分析：パワースペクトル分析と自動エポックスコアリングにより、睡眠時間および断片化における薬物誘発性の変化を評価するための、定量的な比較可能な読み出しを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：遺伝的に扱いやすいシステムでヒトの睡眠EEG表現型と概日調節をモデル化することにより、前臨床検証への継続性をサポートします。
- 企業での再利用：再利用可能な手術および記録インフラにより、複数のプロジェクトにわたる縦断的研究をサポートし、研究ごとのセットアップ負荷を軽減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 分子レベルの影響と機能的な睡眠・覚醒の結果との間の曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を提供します。
- 運用的価値： 電極植込および信号取得のワークフローを標準化することで、研究室間および実験バッチ間での再現性を向上させます。
- 戦略的価値： 中枢神経系（CNS）へのオフターゲット効果をより早期に特定することを可能にし、資本効率を改善し、予期せぬ睡眠障害による後期の脱落率を低減させます。
- ポートフォリオへの影響： 睡眠・覚醒への影響プロファイルに基づいた化合物のリスク調整済み優先順位付けを支援し、治療指数の検討事項に沿った開発進展の意思決定を実現します。
実施上の考慮事項
- 定位固定手術、EEG/EMG信号の取得、および睡眠段階判定のためのスペクトル解析に関する専門知識が必要です。
- スリップリング、アンプ、およびFFTベースのEEG解析と自動状態分類が可能なソフトウェアを含む、安定した記録インフラに依存します。
- データの比較可能性を確保するため、電極の配置、フィルタリングパラメータ、およびスコアリング基準のチーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項として、ベースラインの睡眠構造や信号品質を変化させる可能性のある、異なるマウス系統、年齢、または併存疾患モデルへの調整が含まれます。
- 実用上の制限として、手術後の回復時間、テザーによる行動制限、およびストレス誘発性の睡眠断片化を最小限に抑えるための記録チャンバーへの慣らしが必要となります。
