Name: アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶアレナウイルス粒子の細胞付着をqRT-PCRで高感度に定量化する方法。Vero E6細胞を用いたこの技術は、ウイルスエンドサイトーシスやゲノム放出の研究にも応用可能です。

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我々は、助成金T32 AI055402（JK）、R21 AI088059（JB）、およびP20RR021905（JB）を介してこれらの研究をサポートするために役立つ議論や国立衛生研究所のためにマルクス・ターリー、ネイサンロイ、クリストファー・ツィーグラー、エミリーブルース、とベンジャミン王に感謝します。

注：記載されているプロトコルは、（前のPCR実験室とどのように良いプレPCR法を用いた実験を行うための設定方法についての優れた概要については28を参照のこと ）、厳格な事前-PCR法を用いて行うことが重要です。すべての試薬および装置は定量PCR標的配列を含む増幅されたDNAを含まないと、適切なコントロールは、このような汚染を検出するための場所にあることが肝要です。プロトコルの概要を図1に示されています。 1. 48ウェルプレート中のメディアや種子細胞を準備します<ol><li> 50 mlで添加することにより、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸）を含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlの緩衝液を調製熱不活性化ウシ胎児血清、5mlのDMEM 500mlのボトルに100Xペニシリン - ストレプトマイシンおよび100X HEPES緩衝液の各々の。この試薬は4℃で保存することができます76;ヶ月間C。 </li><li>完全DMEM500μlの最終体積で48ウェル組織培養プレート中のウェル当たりの種子2.5×10 4のVero E6細胞。 10〜18時間、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。 <ol><li>終業時にプレートをシード。いずれかの複製または三連のウェル中の各ウイルスのサンプルをテストします。 注：このアッセイのために48ウェルベースの​​プラットフォームが記載されているが、96または384ウェルプレート中でダウン使用するためのアッセイをスケーリングすることが可能であるべきです。 </li></ol></li></ol> 2.ウイルスの細胞アタッチメントを行います注：このプロトコルで使用されるウイルス、JUNV株率直＃1（C＃1）は、成功しJUNV病29の予防のための弱毒生ワクチンとして使用されてきました。 JUNV C＃1は、in vivoおよびin vitroの両方でシリアル通路を通って病原性JUNV株XJに由来し、12個のアミノ酸30による親XJ株と異なりました。 Becaus＃1は、バイオセーフティーレベル（BSL）-2-定格病原体である電子JUNV Cは、このセクションの説明作業は、適切なBSL-2プラクティス31を使用して行わなければなりません。これは、個人用保護具（ 例えば眼の保護、白衣、二重手袋）、クラスIIバイオセーフティキャビネットの使用を含む、すべての職員が制度的訓練と安全にこの生物を処理するために必要な承認を受けていることを保証します。 <ol><li>希望のPFUにテストされるJUNV C＃1のサンプル（複数可）を希釈するか、氷冷完全DMEMに形成単位を集中し、各ウェルに追加する直前まで、氷上で保存します。 注：完全DMEMで希釈したウイルスとの結合試験を実施する代わりに、低血清濃度（2％）、血清がウイルスの添付ファイルとの干渉を引き起こす可能性があるかどうかを確立するために、適切な緩衝液を用いてPBSを含む最小培地を使用しています。代替ウイルスの同様の添付ファイルプロトコルはbicarboないRPMI 1640培地を使用することを報告しています0.2％ウシ血清アルブミン、10mMの（2-（モルホリノ）エタンスルホン酸）、および10mM HEPES、pH6.8の32を含むネイト。この結合のメディアは、メディアがインキュベーターのCO 2 -environmentから削除されたときに発生する可能性のpHの変化を防ぐために優れていることがあります。 <ol><li>非生産添付イベントを制限するために、200から2000までの範囲のPFUでウェルを接種します。 図2に示すように、このアッセイは、わずか20 PFU（又は多くの6×10 2 PFUなど）を使用して添付ファイルを検出することができます。 </li><li>細胞に接種するためのウイルスのマスターミックスを作成します。各ウイルスサンプルは、ウェルあたり50μlの容量で二連のウェルに接種されます。したがって、ウェルあたりのウイルス2000のPFUの添加が望まれる場合には、氷の120μlの総容積に4800のPFUを希釈DMEMを完了コールド。 <ol><li>アッセイの特異性を制御するために、いずれかTfR1（TRVb）またはEXPを発現しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株のペアを使用しRESS hTfR1（TRVb-1）これらの細胞にJUNVの添付ファイルとしてはどちらか減少かどうか、それぞれ13,33れるべきです。また、アレナウイルス添付ファイル34またはエントリ35を防止するために、このようなプロテイナーゼKなどのプロテアーゼで細胞を処理します。可溶性hTfR1またはhTfR1に特異的でありするモノクローナル抗体のch128.1は、また、それらが細胞13,36へJUNVの侵入を阻止することが知られているとみなすことができます。さらに、遊離マンノース14またはJUNV特異的中和抗体37を有する粒子のインキュベーションによる細胞の前処理は、ウイルス侵入を阻害することができます。 </li><li>しかし、これらの後者の試薬とアプローチすることを、JUNVエントリを遮断するにもかかわらず、これは可能性の高い説明であるが、添付ファイルをブロックすることが確認されていないのでご注意ください。ここで説明するプロトコルは、形式的に、これらの様々なアプローチの衝撃ビリオン付着するかどうかを決定するために使用することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> 37℃のインキュベーターからプレートを取り外し、4℃の冷蔵庫中またはエンドサイトーシスを行うためにプレートされた細胞の能力を阻害するために15分間氷上に置きどちら。 </li><li>次に、各ウェルから完全DMEMを吸引し、急速に氷冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）pH7.4の100μlのを使用して二回各ウェルを洗浄します。その後、適切なウェルに（ステップ2.1で調製した）前希釈したウイルスサンプルの50μlを添加します。 </li><li>プラスチックラップでプレートを包み、すぐにウイルス添付ファイルが発生することを可能にするために1.5時間に1のために戻って氷の上または4℃の冷蔵庫内にどちらかに配置します。このステップを通して4℃で冷緩衝液を洗浄、プレートを維持し、ウイルスサンプル。 </li><li> 4℃でのインキュベーションの終了後、ウイル​​ス接種物を吸引し、氷冷したPBS200μlで各ウェルを3回洗浄します。 </li></ol> 3.ウイルスRNA抽出<ol><li> JUNVのC＃からウイルスRNAを精製市販のキット（ 例えば 、RNeasyミニキット）を用いて、単層に付着した1粒子アコー製造業者のプロトコルに鼎。具体的には、以下のとおり変更とのRNeasy Miniプロトコール（ 第 4版、2006年4月）内のページ23-28の「スピン技術のプロトコルを用いて動物細胞からの全RNAの精製」に従ってください。 <ol><li>溶解を各ウェルに直接溶解緩衝液RLT350μlのを追加することにより、ステップ1（b）に指示されるように細胞が。細胞溶解を確実にするために、バッファを数回混合します。細胞は簡単にこのバッファに溶解し、完全な溶解が倒立顕微鏡下で井戸を見ることによって確認することができることに注意してください。 </li><li>キットカラム（ステップ3a）に得られた細胞溶解液を移し、記載されているように、プロトコルの残りの部分に従います。プロトコルの残りのステップは、クラスIIバイオセーフティキャビネットの外で行うことができますので、この時点では、ウイルスは、溶解緩衝液によって中和されたキット管が感染性ウイルスで汚染されていなかった提供。 </li><li> ADDITある製造業者のプロトコルから任意のステップ9を含み、Buffer RPEのキャリーオーバーの可能性を排除するためのスピンカラムのional遠心分離。 </li><li>最後のステップでは、製造業者のプロトコール（ステップ10）は、ヌクレアーゼフリーのddH 2 O30μlのを使用してスピンカラムから精製されたRNAを溶出しますこの時点で-80℃で保存RNAまたは定量RT-PCRアッセイで直接使用します。ヌクレアーゼによって精製されたウイルスRNAサンプルの分解を防止するために、ヌクレアーゼフリーの試薬および機器を使用し、氷上で解凍したRNAサンプルを保ちます。 注：バッファーRLTとRW1はグアニジン塩を含んでいる漂白剤と混合しないでください。 Buffer RW1は、エタノールが含まれています。 </li></ol></li></ol> 4.ウイルスゲノムの定量RT-PCR測定<ol><li>その後の定量PCR用のcDNAにJUNV C＃1 SセグメントRNAを変換するには、総容量50μlでRTに（ステップ3.1.4で生成された）ウイルスRNAを施します。 <ol><li>ヌクレアーゼの6.75μlの：RT反応を設定するには、最初の反応あたり以下の試薬のそれぞれを含むマスターミックスを作成フリーのddH 2 O、SセグメントゲノムRNAのNPの領域に相補的である2075-へRTプライマーS 2098-2μMの株式の5μlの（5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;）、5μlの10X PCR緩衝液II、25のMgCl 2溶液、RT酵素の1.25μlの（62.5単位）、RNaseインヒビターの1μL（0.4単位）、およびdNTPの500μMのストックの10μlを11μlの。 注：アレナウイルス複製の過程で、4ウイルスSセグメントRNA種が生成されます。完全長ゲノムRNA（vRNAの）、全長アンチゲノムRNA（vcRNA）（つまり、vRNAのの逆相補体である）、および2つのサブゲノムmRNAをそれぞれ、NPおよびGP遺伝子をコードします。ここに記載されているRTプライマーはSセグメントのvRNAはなく、vcRNA、NPのmRNA、またはGPのmRNAに特異的です。 </li><li>ゆっくりRTマスターミックスを混合し、次いで、個々の0.2ミリリットルのPCRチューブに40μlずつ分注し。各チューブにウイルスRNAを10μlを加えます。含めるⅰ）鋳型なしコントロールチューブ（ 例えば 、。ヌクレアーゼフリーのddH 2 O 40にマスターミックスのμL）およびii）無RT酵素制御10μlのを（ 例えば受信しなかったマスターミックスの40μlに知られている陽性ウイルスRNAサンプルの10μlを添加する追加ウイルスの標的配列を含む増幅されたDNAを用いたRT試薬の汚染をスクリーニングするための任意のRT酵素）。細胞RNAの存在下でのアッセイ特異性を制御するための完全なRTマスターミックスと非感染細胞から抽出したRNAを含みます。 </li><li>また、RT試薬の品質を検証するための完全マスターミックスに知られている陽性ウイルスRNAサンプルが含まれます。必要であれば、RT反応の体積は25μlに減少させることができることに留意されたいです。 </li></ol></li><li> 5分間、10分間、30分間、48°C、95°C、25°C以下のサイクリング条件をRT管を施します。サンプルは4℃のステップを追加することで、この時点では、-20℃で保存するか、またはサーモサイクラー中で一晩放置することができることに注意してください。 </li><li> P総量25μlでerform定量PCR。 <ol><li>以下を組み合わせることにより、定量PCRマスターミックスを行います。各の（9μM株式の）2.5μlのフォワードPCRプライマーS1937 +（5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;）を1958+と1982にPCRプライマーS 2001-を逆にする（5 qPCRプローブS 1960+の「-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3 &#39;）、2μM株式の2.5μlの（）1975+（5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&#39;）、および2Xユニバーサル定量PCRマスター12.5μlのミックス。 JUNV C＃1に特異的である、ここで報告されたフォワードプライマーは、ntの病原性JUNV株ロメロを対象とし、元々報告プライマー配列38から1によって異なることに注意してください。 </li><li>溶液を穏やかに混合し、次いで、各ウェルのqPCRに20μlを添加します。適切な定量PCRウェルに各RT反応の5μlを添加します。試験した各サンプルについて3回定量PCRを実施します。必要に応じてPCR反応容積は、わずか12.5μlに減少させることができることに注意してください。 注：関連付けられているソフトウェア定量PCRマシンは、定量PCRプライマーの標的であるJUNV C＃1 NP遺伝子をコードするプラスミドの標準希釈系列に各未知試料の値とを比較することにより、JUNV C＃1 SセグメントゲノムRNAの絶対的なコピー数を生成しますおよびプローブセット。定量PCRアッセイは、標準曲線の範囲内に入る値の定量化を提供することができます。 5、50、×10 3 5、5×10 5、5×10 7コピーウェルあたり：このため、以下の（三連のウェル中）プラスミドの量が含まれます。 </li></ol></li><li> 1分15秒、60℃で10分間および95℃での40サイクル：95℃サーモサイクラーに定量PCRプレートをロードし、以下の反応条件を実行します。 <ol><li>製造業者のプロトコールに従って、各試料中のウイルスRNAの存在量を決定するためにデータを収集し、分析します。 </li></ol></li><li>定量PCRタールを含むプラスミドの新たに精製されたサンプルを使用して標準曲線を確立するために、シーケンスを取得し、最初にこの溶液中でのプラスミドのコピー数を決定します。 <ol><li>プラスミドの分子量を計算します。プラスミド全体の配列が知られている場合は、以下の式を使用して、これを計算する：MW =（[A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13）。二本鎖プラスミドの各鎖上に見出される特定のヌクレオチドの合計数を含めることを忘れないでください。 </li><li>プラスミドのサイズは知られているが、その正確な配列がない場合、各二本鎖DNAの塩基対は、600のMWを有するという仮定の下でMWを計算します。 注意：ここで使用したpCAGGS-JUNV C＃1 NPプラスミドは、4.2×10 6のMWを持っています。 </li><li>プラスミドのMWが決定されると、1μl当たりどのように多くのコピーを計算ストックプラスミド溶液中に存在します。 </li><li>最初のx 1 6.9その後、プラスミドの69μgのは、300μlの水に含まれている場合は、プラスミド（ 例えばのモル数にこれを変換した後、溶液中でのプラスミドの合計μgのを計算コピー数に変換することができるプラスミド* 1モルの0 -5グラム/プラスミドの4.2×10 6グラム =プラスミドの1.6×10 -11モル）、（ 例えば、プラスミドの1.6×10 -11モル* 6.022×10 23分子/モル= 9.8×10 12分子（またはコピー））。 </li><li> 1μl当たりのコピーを取得するために、その溶液の容積によってプラスミド溶液中のプラスミドの総コピーを分割し（ 例えば 9.8×10 12コピー/300μlの= 3.28×10 10コピー）。 </li><li> 5μlの容積は、標準曲線を確立するために必要なコピー数の範囲を提供するために、PCRプレートにロードすることができるように、適切にこの溶液を希釈します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

私たちが説明するプロトコルは簡単であり、堅牢では、次の重要な考慮事項が観察されました。まず、厳格な事前-PCR法は、（優れたレビューのために28を参照） を使用しなければなりません。すべての試薬および装置は定量PCR標的配列を含む増幅されたDNAを含まないと、適切なコントロールは、このような汚染を検出するための場所にあることが肝要です。第二に、プロトコル、ウイルス、細胞および培地のウイルス - 細胞接着部に表面に結合したビリオンのエンドサイトーシスを防止するために4℃に保たれなければなりません。第三に、RNA抽出のために回収した細胞の量は、RNA精製フィルタのRNA結合容量を超えてはなりません。第四に、精製されたウイルスRNAサンプルは、ヌクレアーゼフリーの試薬や機器を使用することにより解凍時に氷の上にそれらを保つことによってリボヌクレアーゼ媒介分解から保護されなければなりません。第五に、定量PCRアッセイに含まれる標準曲線の範囲が十分に大きくなければなりません未知のサンプルから観察すべての値をキャプチャします。第六に、技術的反復は、アッセイのウイルス - 細胞の取付部だけでなく、個々のRNA...

アレナウイルスは、自然界1-3のげっ歯類で主に維持されている包まれ、一本鎖RNAウイルスのファミリーです。これらのウイルスは、通常、齧歯類貯水池1,2に無症候性、持続感染を確立しているが、それらは、ヒト3に重篤な疾患を引き起こす可能性があります。重要な病原性の種は、新世界フニンウイルス（JUNV）4とそれぞれアルゼンチン南米出血熱、アフリカのラッサ熱の病因剤である旧世界ラッサウイルス5が含まれます。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、家族6の原型ウイルスは、世界的な分布を持っており、免疫抑制における免疫応答性個体6で無菌性髄膜炎、胎児7に重篤な先天性欠損、または高い致死率を含む種々の疾患状態の原因であります固形臓器移植8,9を以下の個人。米国の欠如これらのウイルスに対抗するための食品医薬品局（FDA）が承認したワクチンや有効な抗ウイルス薬は、治療これらの新興/再新興病原体を標的とする新たな戦略を開発するための重要な必要性を強調しています。 アレナウイルスのゲノムは、2つの一本鎖RNAセグメント、大（L）（〜7.2キロバイト）と小（S）（〜3.6キロバイト）セグメント10から構成されています。 Lセグメントはウイルスポリメラーゼ（L）、およびマトリックスタンパク質（Z）をコードしながら、Sセグメントはウイルス核タンパク質（NP）およびエンベロープ糖タンパク質（GP）をコードします。 LとSのゲノムRNAセグメント（のvRNA）は、ビリオン10-12にパッケージ化されています。アレナウイルス感染の初期段階は、ウイルス粒子の付着はJUNVのために、ヒトトランスフェリン受容体1（hTfR1）13,14を含み、ウイルスGPとそれに対応する宿主細胞受容体との間の相互作用を介して細胞をホストすることです。添付ファイルの後、JUNV粒子はクラスリン依存性エンドサイトーシス15を介して細胞内に取り込まれます。その後、粒子このコンパートメントの低pHはGP 16,17の活性化を誘発後期エンドソームへのトラフィック。いったんウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、エンドソーム膜に、GP-コードされる融合ペプチド挿入を活性化しました。彼らは、ゲノムの複製および転写のための鋳型としての役割を果たす細胞質内へのビリオンにパッケージのvRNAのリリースで成功融合結果。ウイルス構造タンパク質とのvRNAの十分な量が生成されると、新しい粒子がライフサイクル18を完了するために感染細胞からアセンブルし芽。 治療的に病原性アレナウイルスを標的とするために新たな戦略の発見を容易にするために、当社グループは、ホスト用のウイルス増殖のために重要な、しかし必須では宿主因子の同定に焦点を当ててきました。この文脈において、そのような宿主因子によって制御されるウイルスのライフサイクルの正確なステージ（複数可）を定義する案内することが必要です抗ウイルス戦略の開発。ここで、我々は、選択された宿主タンパク質および/ ​​または抗ウイルス性分子がウイルス侵入19のこの初期の段階に影響を与えるかどうかを識別するためにアレナウイルス-細胞接着を測定するために使用することができる定量的（q）はRT-PCRに基づくアッセイを記載します。アレナウイルス-細胞付着を測定するための別のアプローチは、ビオチン20で標識されたビリオン、蛍光染料21、または放射性同位元素22を特色にしています。これらの方法の欠点は、入力されたウイルスの大量の要求（感染の例えば、高多重度（MOI））、放射能の使用、および/ ​​または入力ウイルスを調製するための追加の処理工程（ 例えば、濃度および/ ​​またはウイルスの標識）を含むことができます。特に、高いMOIを用いることが困難な非生産添付イベント15,23対生産性を区別することができます。ここに記載のqRT-PCRに基づくアッセイは、20プラークとしていくつかを使用して、添付イベントを検出することができます。48ウェルプレートのために0.0004のMOIに変換ウイルスの明単位（PFUの）、。したがって、アッセイの強い感度が高いMOIの要件だけでなく、任意のウイルス標識または濃縮工程を克服します。さらに、アッセイは、ⅰ）融合後のビリオンのエンドサイトーシスと同様に細胞質へのウイルスゲノムの放出を測定するように構成することができると、ii）参照、例のために（ウイルス特異的定量RT-PCR試薬の開発を通じて、他のウイルスで使用するために仕立て24-27）。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vero E6 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>バッファー RLT または&nbsp;漂白剤付きRW1</td></tr><tr><td>QIAシュレッダーホモジナイザー</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (5000U/100 &micro;l)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズN808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RTプライマー5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNAオリゴ</td><td>標準脱塩</td></tr><tr><td>フォワードqPCRプライマー&nbsp; 5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>標準脱塩</td></tr><tr><td>リバース qPCR プライマー 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>標準脱塩</td></tr><tr><td>TaqMan プローブ 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4316033</td><td>HPLC精製</td></tr>マイクロ<tr><td>アンプ Fast Optical 96ウェル反応プレート (0.1 mL)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td></td> 4346906 <td></td></tr><tr><td>StepOnePlus リアルタイムPCRシステム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4376598</td><td>またはその他のqPCR装置</td></tr></tbody></table>

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenavirusesは、重篤なヒトの病気を引き起こすエンベロープRNAウイルスのファミリーです。アリーナウイルスのライフサイクルの最初のステップは、ウイルス粒子の宿主細胞への付着です。ウイルスと細胞の接着は、ビオチンで標識されたビリオン、放射性同位元素、または蛍光色素を使用して測定できますが、これらのアプローチでは、結合したウイルスの検出を可能にするために、通常、高い感染多重度(MOI)が必要です。ここでは、ビリオンパッケージウイルスゲノムRNAの定量により、Juninウイルス株Candid 1の付着を測定する定量的(q)RT-PCRベースのアッセイについて説明します。このアッセイには、その極めて高い感度や、インプットウイルスの精製や標識を必要とせずに、広いダイナミックレンジのMOIで付着を測定できるなど、いくつかの利点があります。重要なことは、このアプローチは、ウイルス特異的なqRT-PCR試薬を使用することで、他のウイルスとの使用に容易に適合させることができるということです。さらに、このアッセイは、粒子エンドサイトーシスおよびゲノムアンコーティングの測定を可能にするように変更することができます。結論として、アレナウイルス-細胞付着の高感度測定のためのシンプルでありながら堅牢なアッセイについて説明します。

プロトコルの第4節で説明したように定量PCRアッセイの感度とダイナミックレンジを実証するために、JUNV C＃1（範囲5-5×10 7コピー）のNP遺伝子をコードするプラスミドの既知量を定量PCRに供しました。アッセイは敏感であり、確実に標的核酸の5コピー（ 図2）のようにいくつか検出することができます。さらに、アッセイのダイナミックレンジが大きく、 図2に示すように、テンプレートの少なくとも7ログを覆うことができます。図示していないが、我々は、核酸のような多くの9×10 5のようなコピーを検出しました。 プロトコールに記載されるようにJUNV C＃1粒子付着を測定するためのアッセイの有用性を例示するために、JUNV C＃1の様々な量は、ベロE6細胞に予め結合させました。未結合粒子を洗浄した後、細胞をRNA精製のために溶解し、得られたRNA試...

アリーナウイルスのライフサイクルの最初のステップは、ウイルス粒子の宿主細胞への付着です。アリーナウイルス付着イベントの超高感度検出と定量のための定量的(q)RT-PCRベースのアッセイを報告します。

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

このプロトコルの全体的な目的は、宿主細胞へのアレナウイルス粒子の付着を定量的に測定することです。この手法の主な利点は、感度が高いことです。また、本手法はビリオンのエンドサイトーシスや、融合後の細胞質へのゲノム放出の測定にも応用可能です。まず、完全DMEMを調製するため、500 mLのDMEMボトルに、50 mLの熱不活化ウシ胎児血清と、100Xペニシリン-ストレプトマイシンおよび100X HEPES緩衝液をそれぞれ5 mLずつ加えます。一日の終わりに、48ウェル組織培養プレートの各ウェルに、ウイルスごとに3連で2.5×10⁴個のVero E6細胞を、最終容量500 µLの完全DMEMで播種します。プレートを、5% CO2濃度の加湿インキュベーター内にて37 °Cで10〜18時間インキュベートします。クラス2バイオセーフティーキャビネット内において、氷冷した完全DMEMを用い、試験に使用するJunin Candid 1ウイルスのサンプルを200から2,000 focus forming unitsまたはプラーク形成単位に希釈します。以降のプロトコルでは、プラーク形成単位をPFUと表記します。例えば、2,000 PFUを50 µLずつ二連で接種する場合、合計120 µLの培地に4,800 PFUを添加します。Vero培養細胞に添加するまで氷上で保存します。プレートを37 degree Celsiusのインキュベーターから取り出し、氷上または4 degrees Celsiusで15分間静置して、播種した細胞のエンドサイトーシス能を抑制します。次に、各ウェルから完全DMEMを吸引し、100 µLの氷冷PBSを用いて各ウェルを迅速に2回洗浄します。次に、適切に希釈したウイルス検体50 µLを対応するウェルに加えます。プレートをプラスチックラップで包み、直ちに氷上または4 °Cに戻し、ウイルスを吸着させるために60分から90分間静置します。この工程の間、洗浄バッファーとウイルス検体は4 °Cに保持してください。インキュベーション後、ウイルス接種液を吸引し、氷冷PBS 200 µLを用いて各ウェルを3回洗浄します。Junin Candid 1粒子からウイルスRNAを抽出するため、スピンテクノロジーを用いた動物細胞からのRNA精製に関するメーカーのプロトコルに従い、市販のRNA分離キットを使用します。手順は以下の通りです。各ウェルにライシスバッファーRLT 350 µLを直接加え、指示通りに細胞を溶解させます。バッファーを数回混ぜ、細胞が完全に溶解するようにします。次に、倒立顕微鏡を用いて、細胞が消失していることを確認し、溶解を担保します。この時点でウイルスは不活化されているため、キットのチューブが汚染されていない限り、以降の工程はクラス2バイオセーフティキャビネット外で実

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Extraction of Viral RNA from Surface-Bound Virions Using a Silica Spin Column

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

このビデオでは、ヒツジの血清サンプル中のアルカリホスファターゼ発現組換えアデノ随伴ウイルス血清型6(rAAV6)ベクターに対する中和抗体の存在を検出するためのin...

細胞ベースのAAV中和抗体アッセイ:血清中の特定のアデノ随伴ウイルスに対する中和抗体を検出するための比色技術

このビデオでは、抗ウイルス化合物をスクリーニングするためのウイルス付着アッセイを実演しています。遺伝子組み換えC型肝炎ウイルスとルシフェラーゼを用いて、ウイルス単独のウェルと比較して、共治療したウェルの光強度が低いことからわかるように、ウイルス付着に対する阻害効果を評価します。...

抗ウイルス化合物のスクリーニングのためのウイルス付着アッセイ

このビデオは、ウイルスが宿主細胞に侵入し、エンドソームと融合する特定のステップを標的とする抗ウイルス剤を評価するためのアッセイを示しています。細胞を低温でインキュベートした後、HCVに感染させます。低温は宿主細胞へのウイルスの結合を可能にしますが、エンドサイトーシスによる内在化を阻害します。試験用抗ウイルス化合物を添加し、細胞を生理的温度でインキュベートします。この高温へのシフトにより、ウイルスの侵入が容易になり、エンドソームとのウイルスエンベロープ融合に対する試験化合物の影響を評価できます。...

宿主細胞へのウイルス侵入と融合に対する被験化合物の影響を評価するためのアッセイ

ここでは、新規抗ウイルス剤を特定し評価するために、ウイルス侵入の特定のステップを調べるプロトコルを提示します。...

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

私たちは、インフルエンザAウイルスのA549細胞への付着と、フローサイトメトリーによる標的細胞へのウイルス粒子の内在化の両方を測定するための半定量的な方法を説明するプロトコルを提示します。...

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

印刷された糖鎖マイクロアレイ戦略を使用して、従来の96ウェルプレートアッセイを小型化し、インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンの結合性とシアル酸含有受容体の特異性を分析しました。...

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

アデノ随伴ウイルス (AAV) 抗体とアセンブリ活性化の役割を研究する応用を定量化するための簡単なドット プロット法の詳細を本稿では蛋白質 (薬学会合同)、すべて AAV が見つかりましたウイルスの非構造タンパク質の新規クラス血清型、同種および異種 AAV...

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

AAV6に対する中和元素を検出するための、迅速で費用対効果が高く、簡単な比色細胞ベースのアッセイについて、包括的なラボプロトコルと分析ワークフローが説明されています。...

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

学ぶアレナウイルス粒子の細胞付着をqRT-PCRで高感度に定量化する方法。Vero E6細胞を用いたこの技術は、ウイルスエンドサイトーシスやゲノム放出の研究にも応用可能です。

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

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