不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

この手順の全体的な目標は、不死化多能性耳前駆細胞を内耳細胞タイプに分化することです。したがって、この方法は、耳前駆細胞がどのようにして蝸牛有毛細胞や聴覚ニューロンになるかなど、聴覚再生における重要な問題に対処するのに役立ちます。重要なことは、この技術は、in-vivo哺乳類動物モデルシステムと並行して使用できるin-vitro細胞システムを提供することです。

本日は、私の研究室のポスドク研究員であるAzadeh Jadali氏と、研究室の大学院生であるZhichao Song氏とAlejandra Laureano氏が、その手順を実演します。テキストプロトコルに記載されているように培地を調製した後、この液体の3ミリリットルを使用して、60ミリメートルの組織培養皿に1回10〜6番目の不死化多能性前駆細胞をプレートします。細胞を摂氏37度で5〜7日間、5%の二酸化炭素とインキュベー

一日おきに、新鮮な培地を加えて、培養液中の液体の量を2倍にします。細胞を継代するには、まず細胞を培養皿から15ミリリットルの円錐管に移します。次に、チューブを摂氏37度で5〜10分間置きます。

この間、コロニーを形成する耳球は、重力沈殿によって円錐形の底に集まることが予想されます。次に、パレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引します。0.5ミリリットルの予め調製した予熱済みEDTA強化平衡塩溶液(HBSS)を1ミリモル加え、その後、ピペッティングで2〜3回ピペッティングして、耳球を再懸濁します。

耳球の単一細胞への解離を促進するために、円錐形を摂氏37度のインキュベーターに入れます。溶液を定期的に渦巻かせ、チューブの底に沈殿物として耳球が観察されない場合は、室温に移します。EDTAを中和するために、細胞に2ミリリットルの培地を追加します。

そして、それらを室温で200gで5分間遠心分離します。次に、希釈したEDTA溶液を吸引し、5ミリリットルの1x PBSで細胞を洗浄します。同じ設定で細胞をスピンダウンした後、1x PBSを吸引します。

次に、0.5ミリリットルの培地を円錐形に加えます。そして、セルパレットを再一時停止します。計数には、IMOP細胞を培地で1〜100個希釈します。

次に、この溶液の75マイクロリットルをマイクロ流体粒子カウンターに配置したカセットに加え、セル番号を決定します。その後、前述したように60mm組織培養皿にIMOP細胞を10〜6個ずつ10個ずつプレートし、この継代手順を5〜7日ごとに繰り返す。めっきの3日後、重力沈殿法を用いて前述したように耳球を採取します。

上清の吸引に進みます。そして、細胞を2ミリリットルの感覚上皮分化培地に穏やかに再懸濁します。次に、10ミリリットルの大きな細孔ピペットを使用して、耳球を新しい60ミリメートル皿に移します。

10日間耳球を区別します。2ミリリットルの新鮮な分化培地を一日おきに培養に加えます。その後、重力沈殿により再び耳圏を採取します。

そして、使用済みの媒体を吸引します。次に、耳球を1x PBS中の4%パラホルムアルデヒドに室温で15分間固定します。次に、ホルムアルデヒド溶液を取り出し、0.1%のTriton x100を含む1x PBSで細胞を洗浄します。

10%のヤギ血清と0.1%のTriton x100を添加した1x PBSで耳球をブロックして進行します。1時間後、ブロッキングバッファーを適切な希釈量のCdkn1bまたはCDH1抗体を含むものと交換します。その後、細胞を一次抗体で摂氏4度で一晩インキュベートします。

そして翌日、他の場所で説明したように、蛍光標識された二次抗体、ファロイジン、およびヘキストを使用して免疫染色を続けます。イメージングの準備として、スライドガラス上に封入剤を置きます。次に、染色された耳球を培地に導入します。

次に、サンプルの上にカバースリップを置きます。埋込培地を4°Cで一晩乾燥させた後、16ビットCCDカメラを搭載した倒立顕微鏡のステージにスライドを置きます。20x 0.75の空気対物レンズを使用して、青、緑、赤、および赤外線チャネルからデータを収集することにより、落射蛍光画像を取得します。

まず、丸いガラスカバースリップを滅菌済みの100ミリメートルプレートに入れ、70%のエタノールに浸して清掃します。カバースリップをそっと攪拌して蓋がかかっていることを確認し、皿を室温で10分間放置します。次に、カバースリップを滅菌1x PBSで3回すすぎ、次に滅菌水で1回すすぎます。

次に、組織培養フード内でカバーをUV光に15分間さらして、カバーを滑り込ませて乾かします。すぐに使用するには、滅菌カバースリップを1枚、24ウェルプレートの各ウェルに入れます。そして、プレートを静かに振って、すべてのカバースリップが平らになるようにします。

次に、ポリDリジン1ミリリットルあたり10マイクロガムを含む0.25ミリリットルの1x PBSを各ウェルに追加して、カバースリップをコーティングします。プレートを摂氏37度で1時間インキュベートした後、ポリDリジン溶液を取り出し、滅菌済みの1x PBSでウェルを3回洗浄します。最後の洗浄からの液体が吸引されたら、1ミリリットルあたり10マイクログラムのラミニンを含む0.25ミリリットルの1x PBSを24のウェルのそれぞれに導入します。

プレートを摂氏37度で一晩インキュベートした後、ラミニン溶液を吸引し、次に各ウェルを1ミリリットルの1x PBSで3回洗浄しますが、細胞をプレーティングする準備ができるまで、最後の洗浄からPBSをウェルに残します。ニューロンの分化を開始するには、前述のように解離した耳圏の細胞を数えます。次に、温めたニューロン分化培地に再懸濁します。

1〜1点の間に1〜5個のIMOP細胞を10〜5のIMOP細胞をコーティングされたカバースリップを含むプレートの各ウェルに播種して進めます。プレートを摂氏37度で、5%の二酸化炭素でインキュベートします。神経分化培地を一日おきに交換します。

7日後、培地を吸引し、カバースリップに付着させるべき細胞を、各ウェルに4パーセントのホルムアルデヒドを加えて固定します。そして、室温で15分間放置します。次に、ホルムアルデヒドを除去し、0.1%のTriton x100を含む1x PBSで細胞を1回洗浄します。

次に、ウォッシュバッファーを取り外します。そして、10%の正常ヤギ血清を含む1x PBSと0.1%のTriton x100からなるブロッキングバッファーを各ウェルに加えます。細胞を室温で1時間放置します。

次に、液体を取り出し、適切な希釈量のCdkn1bまたはTubb3抗体を含むブロッキングバッファーと交換します。摂氏4度で一晩インキュベートした後、1%のTriton x100を含む1x PBSで細胞を1回洗浄します。その後、前述のように免疫染色を進めます。

染色が完了したら、ウェルに1x PBSを添加して最終洗浄を行います。それらを分析用に準備するには、染色細胞が付着しているカバースリップを24ウェルプレートから取り外します。そして、スライドガラス上の封入剤に載せます。

マウンティング用メディウムを摂氏4度で一晩乾燥させた後、前述のように落射蛍光画像を取得します。上皮分化培地で10日間培養した耳球は、未分化細胞と比較して、循環依存性キナーゼ阻害剤であり、内耳分化のマーカーであるCdkn1b発現の増加を示しています。ここでは、ヘキスト染色は細胞核に注目しました。

これらの細胞はまた、アクチンフィラメントおよび上皮に特徴的な細胞間接着領域の形態学的変化を示します。ファロイジンの出現、および細胞末梢でのCdh1標識によって示されます。耳球は、ニューロンを形成するように指示することもできます。

この明視野画像は、ニューロン分化培地中で7日後、IMOP細胞が神経突起を示すことを示しています。これらの細胞をニューロンマーカーTubb3で免疫染色すると、それらの分化が確認されます。また、Cdkn1bも強力に発現します。

このことは、二重のTubb3、Cdkn1bシグナルがIMOP細胞のニューロン分化の指標として使用できることを示唆しています。Cdkn1b蛍光の分化細胞と未分化細胞も、Hoechstシグナルに対するその比率を決定することによって正規化され、定量的な結果が得られました。このデータのヒストグラムを次に示します。

これらのグラフには、正規化されたCdkn1bの所定の閾値を超える未分化IMOP細胞および分化IMOP細胞の割合が示されています。分化した両集団は、未分化の対照と比較して、Cdkn1bを発現する細胞の割合が有意に増加したことを示し、免疫蛍光法によって示唆される分化を裏付けています。一度習得すれば、IMOP細胞のルーチン培養と分化は、適切に行えば30分で行うことができます。

このビデオを見れば、IMOP細胞の分化を開始する方法について十分に理解できるはずです。この動画をご覧いただき、誠にありがとうございます。そして、あなたの実験に幸運を祈ります。