Name: 管理と分散研究のための節足動物にプロテインマークを検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶ節足動物へのプロテインマーク法とELISAによる検出技術。個体識別により移動パターン、侵入種の拡散、生態動態を解明する簡便で低コストな手法を習得できる。

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資金は、農業・食品産業技術総合研究イニシアティブ競争グラントノーにより、部分的には、米国農務省CRIS 5347-22620-021-00Dによって提供されました。食糧農業のUSDA国立研究所から2011-67009-30141。私たちは、ジョアンナナシフの技術サポートのために感謝しています。また、 図3で使用される写真のいくつかを提供するためのポール・ベイカー、デビッド・ホートン、ディエゴ・ニエト、とフランシスSivakoffに感謝します。

1.内部マーク、保存、および検出手順<ol><li>内部マーキング手順<ol><li>人工飼料上またはフィールドから飼育実験室コロニーから（nは 100人を≈）関心の昆虫を集め、2きれいな飼育容器に分割します。 </li><li>コンテナのいずれかに、通常の20ミリリットルダイエットパケット（マークされていないネガティブコントロール治療）を配置します。 、1.0 mg / mlの鶏のIgG / IgYの溶液を1.0 mlの第20ミリリットル人工飼料パケットを補足完全に混合し、他の容器に入れてください。 注意：利息の昆虫が人工飼料を持っていない場合、マークは上または、それらは通常（ 例えば 、緑豆、蛾の卵、水、砂糖、蜂蜜）に維持されるどんな食事に配置することができます。 </li><li>昆虫が24時間のために彼らの摂食活動を再開できるようにします。 </li></ol></li><li>内部マーク保持手順<ol><li>各容器からダイエットパケットを削除し、wは昆虫を供給実験（ 例えば、緑色の豆）の期間にわたって、それらを維持するために別の食料源番目。 </li><li>毎日（または任意の所望の時間間隔で）、各処理からの虫のコホートを（N = 20）を収集し、-20℃で直ちに凍結します。 </li></ol></li><li>サンドイッチELISA法<ol><li> 1希釈したウサギ抗ニワトリIgYを一次抗体50μlの追加：トリス500は、クリーン、ELISAマイクロプレートの各ウェルに生理食塩水（TBS）をバッファリングし、RT（ノートで1時間の最小インキュベート：マイクロプレートもインキュベートすることができるO 4℃/ N）。 </li><li>プレートから抗体を捨て、30分間1.0％脱脂粉乳溶液を300μlの各ウェルをブロックします。 </li><li>前のインキュベーションステップを待っている間、TBS 1.0mlの1.6 mlマイクロチューブに個別に凍結昆虫を置きます。 </li><li>十分に均質化されるまでクリーン乳棒で各昆虫を挽くし、ELISAの個々のウェルにそれぞれ100μlの試料を追加プレート。サンプルは、室温で1時間インキュベートすることを許可します。 </li><li>各ELISAプレートの最初の列のウェルに100（TBS中卵白）負（TBSのみ）および陽性μlのコントロールを追加します。また、各プレートの最後の列の8ウェル（ 図1）に負の昆虫コントロール（マークされていない昆虫）の100μlを添加します。対照サンプルは、室温で1時間インキュベートすることを許可します。 図1に提供されるテンプレートは、私たちが標準化されたアッセイのために使用するテンプレートであることに注意してください。ウェル中の試料の配置は​​、研究者の裁量に任されています。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）-tweenで各ウェルを3回洗浄し、その後1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したウサギ抗ニワトリIgGを/のIgYを50μl加える：1％ミルクの溶液中で10,000、室温で1時間インキュベートします。 </li><li> PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、各ウェルにテトラメチルベンジジン（TMB）基質の50μlを添加します。 </li><li> 10分後、ウェルを読みます650nmの波長に設定したマイクロプレート分光光度計です。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> 典型的な96ウェルELISAマイクロプレートに使用される標準化された井戸の指定を示す図1の模式図は、各プレートは、トリス緩衝食塩水陰性対照（TBS）に捧げ7井戸、正のタンパク質制御（順位はCtrl）にも専用のが含まれています無印（負）昆虫コントロール専用の奪還虫（サンプル1 ... 80）、および8ウェルに専用の80個々のウェル（NegのCtrlキー1 ... 8）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2.外部マーク、保存、および検出手順<ol><li>外部マーキング手順<ol><li>興味の昆虫を集めて（nは ≈100実験室コロニーからか、フィールドと場所から個人）に直径2.5cmの穴を持つ2つの1.0リットルのプラスチック容器は、各容器の側面から打ち抜い。 </li><li>医療噴霧器を使用してのdH 2 O（ネガティブコントロール治療）を1.0 mlの第一の容器内の昆虫をスプレーしてください。医療ネブライザーを用いて、ニワトリの卵白の5.0％の溶液1.0mlと第二の容器内の昆虫をスプレーしてください。 </li><li>標準的な実験室の空気出口に噴霧器のホースを取り付け、その後、容器2.5cmの穴に噴霧器の口を挿入します。噴霧器は、蒸気を生成するまで、徐々に空気出口をオンにします。 </li><li>卵白溶液は（約2-5分）に分配されるまで（マーキング）を噴霧し続けます。 </li><li>噴霧器を取り外し、プラスチック容器の穴にコルクを配置します。ソリューションが完全に乾くまで昆虫は室温で放置します。 </li></ol></li><li>外部マーク保持手順<ol><li>マークへのさらなる露出を避けるために、別々の清潔な飼育容器に乾燥昆虫のそれぞれの処理を配置します。 </li><li>研究の期間にわたって昆虫を維持するために清潔な容器に食料と水を追加します。 </li><li>毎日、各処理から昆虫のコホート（N = 20）を収集し、-20℃で直ちに凍結します。 </li></ol></li><li>間接ELISA法<ol><li> 1.6ミリリットルのマイクロチューブに個別に凍結した昆虫を置き、TBSの1.0ミリリットルを追加します。 </li><li> 120 rpmでオービタルシェーカーセットで1時間サンプルを浸します。 </li><li>ステップ1.3.5で説明したようにネガティブとポジティブコントロールを追加します。 </li><li> 図1に示すように浸漬した後、新しい96ウェルELISAプレート上の80の指定サンプルウェルの一つに、各試料からの100μlのアリコートをピペットでサンプルを室温で1時間インキュベートすることを許可する（注：マイクロプレートにもすることができます4℃でO / N）インキュベートしました。 </li><li>でウェルを3回洗浄しその後、PBS-Tweenで、各ウェルに1％ウシ血清アルブミン（PBS-BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水300μLを加えます。 </li><li>室温で30分後、PBS-Tweenで二回洗浄します。 </li><li>各ウェルにPBS-BSA-シルウェット（0.05％）で8,000、室温で1時間インキュベート：1に希釈したウサギ抗卵アルブミン一次抗体50μlのを追加します。 </li><li> PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、その後1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを50μl加える。室温で1時間、PBS-BSA-のSilwet（0.05％）で2,000。 </li><li> PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、各ウェルにTMB基質の50μlを添加します。 </li><li> 10分後、650nmの波長で設定したマイクロプレート分光光度計を用いて井戸をお読みください。 </li></ol></li></ol> 3.データ分析<ol><li>各ELISAプレート上の8陰性対照虫の平均吸光度値を計算して、あちこちにプールされた陰性対照に基づいて標準偏差を計算M与えられた研究12のELISAプレートのすべて。 </li><li> ELISA正の閾値を得るために、各ELISAプレートについて得られた平均値に6回プール標準偏差を加えます。この値以上の吸光度値を生じる任意の昆虫タンパク質サンプルはマークの存在について陽性であるとみなされます。 </li></ol>

本書の商号または市販製品の言及は、特定の情報を提供する目的のためだけであり、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。 USDAは機会均等プロバイダーおよび雇用主です。

節足動物タンパク質の免疫標識手順は、最初の世紀前9のほぼ4分の1を説明しました。それ以来、手順が内部と外部の両方投与のIgG / IgYsを使用して、節足動物の多様な分散パターンを研究するために適応されています。これらのタンパク質は、これまでテストした昆虫種の多種多様な不動のマーカーを証明されています。しかしながら、上述したように、IgGの/ IgYsを使用するための主な制限は、それらが非常に高価であることです。その結果、IgGを/ IgYsのみ昆虫の大きなバッチが小さなスペースにマークすることができるか、マークが食事や餌に配合することができるMRRと自己マーキングタイプの研究に有用です。ここでは、内部のマークが鶏のIgG / IgYので強化された人工飼料昆虫ターゲットを供給することにより投与することができる方法の簡単なデモを提供しました。ターンでは、IgG / IgYを、サンドイッチELISAを用いて検出しました。このシステムは、すでに使用していることを研究者に特に有利であるかもしれませんアッセイは当然のIgG /のIgYを検出しますので、鶏の卵が含まれている食事は卵で見つかりました。さらに、IgGの/のIgYの...

節足動物害虫、天敵（寄生蜂と捕食者）、そして自然の中で花粉媒介の動きを追跡することは、生態系サービスを改善するための方法をより良く理解するために不可欠です。分散研究のほとんどのタイプのための重要な構成要素は、関心の節足動物（複数可）をタグ付けするための信頼できる方法を有しています。様々な材料（例えば、塗料、染料、着色粉剤、タグ、希少元素、タンパク質）は、それらの個体群動態、分散能力、摂食行動、及び他の生態系の相互作用を評価するために、1,2-節足動物をマークするために使用されています。 任意の分散研究のために使用されるマーカーの妥当性は、行われている研究の種類に依存することになります。 （1）マーク・リリース・再捕獲（MRR）、（2）マーク・キャプチャー、および（3）自己マークキャプチャ：節足動物をマーキングするための3つの広範な分類があります。マーク・リリース・再捕獲調査のために、研究者は一般的にlaboratoに一括して節足動物をマークRYとフィールドの中心点でそれらを解放します。節足動物は、異なる収集装置（例えば、掃引ネット、真空、粘着トラップ）3,4,5を用いて様々な空間的および時間的間隔で再捕獲されています。奪還の標本は、その後ネイティブ個人から解放区別するために、特定のマークを調べます。マーク捕獲調査のために、研究者は通常、噴霧装置（例えば、バックパック噴霧器、ブーム及びノズル噴霧器）を使用して、フィールドに直接マークを適用します。マーク・キャプチャ研究のための最善のマーカーは、安価であり、容易に節足動物の生息地に適用されます。自己マーク捕獲調査のために、研究者は通常、節足動物の餌6,7または巣の入り口8にマークを適用します。ターンでは、節足動物は、巣を出るときにマークアップに対する「ブラッシング」でマークされた餌または外部をむさぼり食うことにより、内部で自身をマーク。 前述したように、マーカーの多くの種類は、私たちがしていますedは節足動物の種の多様性をタグ付けします。しかし、非常に少数のは、これらの分散の研究カテゴリーのすべての3のために有用です。タンパク質の免疫標識法の開発は、昆虫をマークするための主要なブレークスルーでした。免疫標識は、内部または外部節足動物にタンパク質標識を置​​くれ、次に、抗タンパク質特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって検出されます。使用された最初のようなタンパク質マーカーは、ウサギ免疫グロブリン（IgGの）およびニワトリのIgG / IgYの9,10ました。彼らは（説明を参照してください）​​MRRと自己マークキャプチャー・研究のための非常に有効なマークであることが判明しました。残念ながら、IgGの/ IgYのタンパク質は高価であり、したがって、マーク・キャプチャ・研究と自己マーク捕獲調査のほとんどのタイプのための実用的ではありません。続いて、第2世代のタンパク質検出ELISAは鶏卵の白身（アルブミン）、牛乳（カゼイン）と豆乳（トリプシンインヒビタータンパク質）に含まれるタンパク質のために開発されました。各アッセイは、特異的、高感度であり、そして、最も重要なのは、はるかに安価のIgG / IgYのタンパク質11よりもタンパク質を使用しています。これらのタンパク質は、（議論を参照）MRR、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャー・研究のための有効であることが判明しました。 この記事では、説明し、タンパク質マーク実験室での保持試験を実施する方法を示します。このような研究は、フィールド分散試験の任意のタイプのために必要な研究の第一段階です。具体的には、研究者はマークが前のフィールド分散の研究に着手をターゲットと節足動物の種に保持される時間の長さを知っていることが重要です。ここでは、説明し、内部と外部のMRRのための昆虫、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャ型のフィールドスタディをマークする方法を示します。それから、間接的なサンドイッチELISA法でマークの存在を検出する方法を示します。

<table><tbody><tr><td>食品保存容器(昆虫飼育用)</td><td>ラバーメイド/タッパーウェア</td><td>各種サイズ</td><td>各種メーカー&ベンダーメッシュ生地は窓に接着されています</td></tr><tr><td>小容量ネブライザー(マイクロミスト)</td><td>テレフレックスハドソンRCI</td><td>1881</td><td>オンラインおよび医療用品店で入手できます。他のブランドも同様に機能します。</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、1.6 ml、キャップ付き</td><td>コンチネンタルラボプロダクツ</td><td>4445.X</td><td>同様のタイプであれば何でも機能します。私たちは、フタが開けやすいブランドを好みます。</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ用発泡スチロール製収納ボックス(5×20グリッド)</td><td>RPI株式会社</td><td>145746</td><td>このデザインはチューブが密集しないのでいいですね。</td></tr><tr><td>ディスペンサー、リピーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>4982000322</td><td>同様のものがあれば、ディスペンシングをスピードアップするのに役立ちます。</td></tr><tr><td>乳棒、プラスチック製の使い捨てティッシュグラインダー、1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>さまざまなベンダーで利用できます。乳棒は洗浄してオートクレーブ滅菌して再利用できます。</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISAプレート、96ウェル(平底)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovationピペット、手動(20-200 &micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200または1070-0200</td>同様の<td>タイプで機能します。このモデルは人間工学的です。</td></tr><tr><td>リザーバー、滅菌試薬</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>同様のものなら何でも機能します。</td></tr><tr><td>電動ピペット、8チャンネル(50-1,200 &micro;l) (Biohit eLine)</td><td>ザルトリウス</td><td>730391</td><td>電子モデルを1つ選ぶとしたら、このサイズが最も便利です。</td></tr><tr><td>電動ピペット、8チャンネル(10-300 & micro;l) (Biohit eLine)</td><td>ザルトリウス</td><td>730361</td><td>似たようなものなら何でも動作します。</td></tr><tr><td>マニホールド、マルチウェルプレートワッシャー(8ポジション、ストレート)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>同様のものはすべて、手動プレート洗浄に機能します。</td></tr><tr><td>吸光度検出付きマイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>似たようなものなら何でも使えます。</td></tr><tr><td>チキンIgG / IgY</td><td>米国生物学的</td><td>I1903-15R</td><td>他のソースからも入手可能</td></tr>卵<tr><td>白食料品</td><td>店</td><td>オールホワイト」、「」エッグビーター」、etc.</td><td>5 mlを95 ml dH2Oと混ぜて5%溶液Tris</td></tr><tr><td>(Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g / LでTBS塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム(NaCl</td>)を作る<td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g / LでTBSと8.0を作る。g&#8288;/&#8288;PBS</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g / L PBS</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>PBS用0.2 g / L</td></tr> 塩化<tr><td>カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>PBS用0.2 g / L</td></tr><tr><td>Tween 20、 EIAグレードの</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>塩を溶解した後、PBSに1Lあたり0.5mlを加えます。</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 パケット in 1 L dH2</td></tr>O <tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (全分子) 抗体 (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &micro;l 50 ml TBS</td></tr><tr><td>ドライミルク、粉ミルクまたはフレッシュミルク(1%)</td><td>食料品店</td><td></td><td>10 gを1 L dH2Oと混ぜる1%溶液</td></tr><tr><td>抗チキンIgY(IgG)(全分子)-ウサギで産生されたペルオキシダーゼ抗体(1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 & micro;ウサギで産生された1%牛乳</td></tr><tr><td>抗鶏卵アルブミン抗体1 L中のl (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>0.5 ml を 1 L PBS-BSA で希釈し、1.3&nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) シリコン-ポリエーテル共重合体</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>最後の成分として</td></tr><tr><td>TMB Microwell 1 成分ペルオキシダーゼ基質</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr> を追加</tbody></table>

管理と分散研究のための節足動物にプロテインマークを検出

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

節足動物の動きを監視することは、多くの場合、よりよい関連する人口動態、分散パターン、宿主植物の環境、およびその他の生態系の相互作用を理解するために必要です。節足動物は、通常、分散能力を決定するために、時間と空間の上にそれらをユニークなマークでそれらをタグ付けし、その後再収集することにより、自然の中で追跡されます。そのような着色埃や塗料などの実際の物理的なタグに加えて、タンパク質の様々なタイプの生態研究の節足動物をマーキングするための非常に効果的であることが証明されています。タンパク質は、内部および/または外部から投与することができます。タンパク質は、その後、タンパク質に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって奪還節足動物に検出することができます。ここでは、外部と内部のタンパク質と節足動物をタグ付けするためのプロトコルについて説明します。 2つの単純な実験例が示されています。タンパク質が豊富な食事を提供することで、昆虫に導入​​（1）内部のタンパク質マークと（2）外部のタンパク質マーク局所医療ネブライザーを用いて、昆虫にpplied。それから、サンドイッチや昆虫タンパク質にマークを検出するために使用される間接的なELISA法を順を追って説明を関連付けます。このデモでは、マーク・リリース・再捕獲、マーク・キャプチャ、および研究の自己マークキャプチャー・タイプの節足動物の取得及びタンパク質マーカーの検出の様々な側面は、免疫標識手順がされているさまざまな方法と一緒に、議論されています研究目的の多種多様に合うように適合されます。

内部マーキング： 内部マーク保持試験の結果を図2Aに示されています。計算されたELISAクリティカルのしきい値は0.054でした。総合（すべての4つのサンプルの日付を合わせ）、タンパク質なしで処理された昆虫は一貫して低いELISA値（X = 0.038±0.002、N = 80）を得ました。逆に、昆虫のすべては、一貫して強いELISA値（X = 0.475±0.221、N = 80）を得た蛋白質に富む食餌を与え。 外部マーキング： 外部マー...

タンパク質は、分散研究のために節足動物をマークするためによく使用されます。節足動物に内部および外部のタンパク質マークを投与する方法が実証されています。間接的またはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によるタンパク質マーク検出技術も示されています。

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

このデモンストレーションの全体的な目標は、分散または移動研究のために昆虫にタンパク質をマーキングする方法を説明することです。このデモンストレーションには、サンドイッチまたは間接的な酵素結合免疫吸着アッセイによるマークの検出方法が含まれています。この方法は、昆虫散布研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。昆虫の移動パターン、昆虫の宿主植物の好み、侵入種の拡散を研究するために使用できます。この手法の利点は、検出方法がシンプルで安価であることです。ハイスループットに適しており、動物は自然の生息地で直接簡単にマーキングできます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、ほとんどのフィールド研究者がこの単純な手法の経験を持っていないため、実際よりも困難に思えるため、苦労するでしょう。私がこの方法を最初に思いついたのは1989年でした。私たちは、大きな目の昆虫捕食者を人工飼料で飼育していました。私たちは、これらの虫が不自然な食事で長期間飼育された後、Lygusバグの害虫にとって効果的な捕食者にならないことを懸念していました。言い換えれば、彼らは飼いならされるでしょう。私たちは、彼らが現場に放出された後、ネイティブの対応物と区別するために、安全で効果的で安価な方法を必要としていました。現在のマーキング方法はいずれもこれらの基準に適合しません。ELISA法を使用して捕食者の腸内含有量分析を行った以前の経験から、Lygus特異的なタンパク質の残骸について、実験室で飼育された捕食者に外来タンパク質マークを適用するというアイデアを得ました。次に、採取した野外で採取したオオカメムシを分析し、ライガスの遺骨と外来タンパク質の遺体を探すことができました。まず、実験室のコロニーまたは野外から関心のある昆虫を約100匹収集し、それらを2つのきれいな飼育容器に分けます。ネガティブコントロールとして機能するために、通常の20ミリリットルのダイエットパケットを1つの容器にロードします。もう1つは、ダイエットパケットにミリグラムの鶏肉IgG-IgYをひもで締めます。1ミリリットルの溶液を加え、よく混ぜます。必要に応じて、パケットの代わりに昆虫が通常与えられているものを使用してください。これらのダイエットパケットで飼育されてから24時間後、昆虫の両方のグループに通常のマークのない食品を供給します。希望の時間間隔で、各コホートから20匹の昆虫を採取します。実験に必要なコホートがすべて収集されるまで、摂氏マイナス20度で凍結します。ELISA用の96ウェルプレートを調製するには、各ウェルに50マイクロリットルのウサギ抗ニワトリIgY一次抗体を500分の1希釈してTris-Buffered Saline(TBS)で追加します。ロードしたプレートを室温で少なくとも1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、ウェルを空にし、各ウェルに300マイクロリットルのブロック溶液を追加します。これは1パーセントの脱脂粉乳溶液です。プレートを室温で30分間インキュベートします。ブロックインキュベーション中に、個々の凍結昆虫を1ミリリットルのTBSを充填したマイクロ遠心チューブに移します。次に、きれいな乳棒で各昆虫を完全に均質化します。プレートの準備ができたら、各ウェルに100マイクロリットルの均質化された昆虫サンプルをロードします。各96ウェルプレートは80個の標本を収容します。プレートの最初と最後の列は、コントロール用に空のままにします。1列目には、TBS単体の100マイクロリットルアリコートを7個ロードし、卵白ポジティブコントロールのTBS100マイクロリットルをウェル1個ロードします。最後の列に、100マイクロリットルの8つの個々のマークされていない昆虫製剤をロードします。サンプルを室温で少なくとも1時間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルをPhosphate Buffered Saline TweenまたはPBS-Tweenで3回慎重に洗浄します。私たちの経験を通じて、ほとんどのエラーは洗浄ステップ中に発生することを学びました。飛沫は誤検知反応の発生率が高くなる可能性があるため、注意が必要です。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したウサギ抗鶏IgG-IgYを50マイクロリットル加え、1%の牛乳溶液で1〜10,000に希釈します。溶液をウェル内で室温で少なくとも1時間インキュベートします。その後、前と同じようにPBS-Tweenでプレートを3回洗い流します。次に、ウェルに50マイクロリットルのTMB基質をロードします。すぐに色が変わり始めることがあります。プレートを10分間インキュベートしてから、マイクロプレート分光光度計で読み取ります。650ナノメートルでプレートを読み取り、値を記録します。昆虫を外部にマークするには、アクセス穴のある1リットルのペットボトルを準備し、100匹の昆虫を2つのボトルに分割します。次に、1つの容器に昆虫に1ミリリットルの蒸留水を噴霧します。これはネガティブコントロールとして機能します。次に、医療用ネブライザーを排気口に取り付け、ネブライザーが蒸気を生成するように空気の流れを調整します。他の昆虫に1ミリリットルの5パーセントの鶏卵白溶液をスプレーします。スプレープロセスは、完了するまでに2〜5分かかります。次に、穴をコルク栓し、溶液を室温で完全に乾かします。乾燥したら、昆虫を通常の飼育容器に戻し、通常の食事で、通常どおり維持します。その後、所定の時間間隔で昆虫を収集してテストします。外部マーク保持を確認するには、ELISAアッセイと同じ手順を使用して内部マーク保持をテストしますが、わずかな変更を加えます。昆虫をTBS付きのマイクロ遠心チューブに移した後、昆虫を均質化するのではなく、120 RPMのオービタルシェーカーに1時間浸します。昆虫を浸した後、100マイクロリットルの溶液をプレートウェルにピペットで入れ、プレートを少なくとも1時間インキュベートします。昆虫サンプルを洗い流した後、各ウェルに300マイクロリットルのPBSと1%のBSAを加えます。室温で30分後、PBS-Tweenでウェルを2回洗浄します。次に、各ウェルに、PBS-BSAシルエットで8000分の1に希釈した50マイクロリットルのウサギ抗卵アルブミン一次抗体を追加します。プレートを少なくとも1時間インキュベートし、前と同じようにウェルを洗い流します。次に、各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した50マイクロリットルのヤギ抗ウサギIgGを加え、PBS-BSAシルエットで2000分の1に希釈します。プレートを室温で少なくとも1時間インキュベートした後、前述のプロトコールを進めます。内部マークの保持は、4つの時点でテストされました。全体として、タンパク質なしで処理された昆虫は、一貫して低いELISA値をもたらしました。一方、タンパク質が豊富な食事を与えられたすべての昆虫は、一貫して強いELISA値をもたらしました。外部マークも4つの時点でテストされました。卵白で局所的にマークされた昆虫は、一貫して強い値をもたらしました。予想通り、水噴霧されたネガティブコントロールは、非常に低いELISA値を記録しました。このビデオを見た後、昆虫をマークする方法をよく理解し、マークの存在について分析するはずです。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば4時間30分で習得できます。1日の間に、1000をはるかに超える検体を含む16枚のアッセイプレートを処理できます。この手順を試行する際には、アッセイが非常に感度が高いことを覚えておくことが重要です。そのため、すべての表面、容器、および機器にタンパク質汚染がないことが不可欠です。その開発後、この技術は、研究者が農業、都市、森林、およびその他の自然生息地における昆虫の局所的および地域全体の分散パターンを調査する道を開きました。ここでは小規模な例で示しましたが、この手法は、市販のスプレー装置を使用して昆虫を自然の生息地で直接タグ付けするためにはるかに大規模に使用されています。私たちは、協力者の創造的なアプリケーションに驚かされています。

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環境

このプロトコルは、クローン細胞ラインの選択とその同族のGPCRで合成された節足動物の神経ペプチドの構造活性相関を分析するためにカルシウムの生物発光アッセイの手順について説明します。このアッセイは、受容体のdeorphanizationと合成アナログ設計およびペプチド/薬物リード発見のための構造活性相関の研究にも使用できます。...

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このビデオでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)でのタンパク質間相互作用の可視化を示しています。体壁を単離した後、相互作用するタンパク質を一次抗体とPLA標識二次抗体でプローブします。相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターオリゴヌクレオチドによるプローブのライゲーションが促進され、環状DNAが形成され、ローリングサークル増幅によって増幅されます。蛍光プローブは増幅されたDNAに結合し、NMJでのタンパク質間相互作用の可視化を可能にします。...

近接ライゲーションアッセイを用いたショウジョウバエ幼虫のタンパク質間相互作用の検出

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正確にショウジョウバエのティッシュの成績証明書または蛋白質を検出する能力は、その豊かさとローカライズ開発プロセスに関連の勉強にとって重要です。ここ蛹翼を分析する簡単な手順の説明です。これらの翼は、いくつかのテクニック(免疫組織化学、PCR...

Immunodetections または PCR の試金に適したショウジョウバエの蛹の翼を解剖する迅速かつ効率的な方法

このプロトコルは、従来のコンピューターを使用して従来の web カメラの動画から昆虫のアンテナとテングの位置のフレーム単位で追跡するため、斬新なソフトウェア、SwarmSight を使用するための手順を説明します。無料、フリー、オープン ソースのソフトウェアは、フレーム ・ プロセスが約 120...

SwarmSight: 昆虫アンテナの動きと共通の準備と従来のハードウェアを使用して吻伸展反射のリアルタイム追跡

葉の枝と枝の端を袋に入れ、袋詰めされた材料を切り取って冷凍し、以前に凍結した材料を水中ですすいで、定量化のために基板から節足動物を分離することで、葉の住居節足動物を定量化する方法を説明します。...

葉住まいの節足動物を定量化する方法

本プロトコルは、人工培地を用いて穿刺吸引昆虫から十分な唾液を採取する方法を説明する。昆虫の唾液を採取し、昆虫の摂食行動やベクター媒介ウイルス感染に関する唾液機能を研究する便利な方法です。...

ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法

我々は、その後の解析のために、小型節足動物から定量可能な血リンパを効率的に採取する方法について述べる。...

小型節足動物から血リンパを採取するための正確で定量可能な方法

AC-DC電気浸透学を使用して、人間の手に対するCulex...

人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査および摂取行動の研究のためのAC-DC電気浸透学

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

学ぶ節足動物へのプロテインマーク法とELISAによる検出技術。個体識別により移動パターン、侵入種の拡散、生態動態を解明する簡便で低コストな手法を習得できる。

管理と分散研究のための節足動物にプロテインマークを検出

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