マウス海馬アストロサイトにおける性差後

本手法の全体的な目的は、新生マウスから性別特異的な濃縮海馬アストロサイト培養物を調製することです。これにより、細胞培養環境で生体内の低酸素性虚血を模倣した酸素・グルコース剥奪および再酸素化後の、アストロサイトの性別特異的な役割を研究するためのツールを提供します。この方法は、発達段階にある雄および雌の脳において、低酸素性虚血後の海馬アストロサイトが果たす性別特異的な役割に関する、重要なメカニズムおよびトランスレーショナルな疑問への回答に寄与します。小さなハサミを用いて皮膚を後方から前方へ正中線に沿って切開し、頭蓋骨を露出させて、新生マウスの頭部から脳を取り出します。

首から鼻にかけて、頭蓋骨の正中線を慎重に切開します。滅菌済みの平鉗子を用いて、頭蓋骨を剥離します。弯曲鉗子を用いて脳幹を除去し、残りの脳を解剖皿に移します。

曲がったピンセットを使用して、脳を反転させて腹側を上に向け、その後、鋭利で滅菌済みの外科用メスで大脳半球を分離します。平型の曲がったピンセットを用いて大脳半球を剥ぎ取り、膨らんでいる中脳および視床組織を慎重に取り除いて、内側側頭葉にあるタツノオトシゴのような形状の小さな構造物である海馬を露出させます。両側の海馬葉を取り出し、微細ピンセットで牽引して、葉の表面から髄膜および線維芽細胞を慎重に除去して清掃します。

単一のマウスから採取した両側の海馬葉を、約5 millilitersのHBSSを満たした2つ目のディッシュに移し、氷上に置きます。鋭利で滅菌済みの外科用メスを用いて、海馬葉を約4回細切にします。1 milliliterの滅菌ピペットを使用して、HBSSと組織を50 milliliterの滅菌コニカルチューブに移し、300 times Gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を吸引します。0.25% トリプシンを 3 milliliters 加えて混ぜ合わせ、組織を 37 °C で 20 分間、緩やかに振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、チューブを 300 ×g で 5 分間遠心分離します。

遠心分離後、滅菌済みのガラスピペットを用いて上清を慎重に吸引し、あらかじめ加温しておいたアストロサイト播種用培地を10 milliliters添加します。火炎滅菌したガラスピペットを用いて20〜30回トリチュレーションを行います。さらに300 times Gで5分間遠心分離した後、上清を吸引し、アストロサイト播種用培地を2 milliliters添加します。

細胞懸濁液を70 micronのメッシュフィルターに通し、新しい50 milliliter円錐チューブに回収します。全量の細胞懸濁液を、3 millilitersのアストロサイト播種用培地を含むコート済み滅菌T-25培養フラスコに加えます。フラスコを5%carbon dioxideインキュベーター内、37 degrees Celsiusで培養します。

翌日、光学顕微鏡下でアストロサイトのコンフルエンスの進行を確認し、培地を吸引して、2 millilitersの新鮮なアストロサイト播種用培地と交換します。in vitroで11日目あたりに、培地を吸引した後、2 millilitersの0.25%trypsinを添加して、コンフルエントになったアストロサイトを回収します。フラスコを数回静かに回転させ、滅菌ガラスピペットを用いてtrypsinを吸引します。

0.25% trypsinをさらに2 milliliters加え、フラスコを室温で4-5分間静置します。trypsinを除去した後、フラスコを5%CO2インキュベーターに入れ、37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。インキュベーション後、astrocyte plating mediumを5 milliliters加え、フラスコを3～4回叩いてアストロサイト層を剥離させます。

細胞懸濁液をフラスコの底で緩やかにピペッティングし、完全に剥離させた後、アストロサイトを15 mLのコニカルチューブに回収します。チューブを300 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1 mLの新鮮なアストロサイト播種用培地を加えます。

細胞懸濁液 10 µL をヘモサイトメーターに添加し、10倍対物レンズを備えた倒立位相差顕微鏡を用いて、中央の大きな格子状エリア内の細胞数をカウントします。細胞を、アストロサイト播種用培地 2 mLあたり約 1 × 10⁵ 個になるように希釈します。細胞懸濁液 2 mL を、24ウェル培養プレートのウェル内にあるポリL-リジンコートガラスカバースリップ上にピペッティングします。

5%二酸化炭素インキュベーターを用いて37°Cでインキュベートします。酸素およびグルコース剥奪を開始するには、接着アストロサイトを含むカバーガラスから培地を吸引し、1 mLの等張OGD溶液で1回洗浄します。ウェルに0.2 mLのOGD溶液を加え、低酸素インキュベーターに入れます。

低酸素状態の最初の30分間、50 rpmに設定したオービタルシェーカーで緩やかに混合します。再酸素化のためには、OGD溶液を2 mLのアストロサイト播種用培地に置換し、5% 二酸化炭素および大気条件下、37 °Cで5時間インキュベートします。この免疫蛍光画像は、マウス初代海馬アストロサイト培養の純度を示しています。

アストロサイト培養において、神経細胞樹状突起マーカーであるMAP2を赤色に、ミクログリアマーカーであるIBA1を緑色に免疫染色した。核はDAPIで染色されており、青色に呈している。矢印はミクログリアの混入を示している。

正常酸素条件下で培養された海馬アストロサイトの代表的な免疫蛍光画像である。GFAPの免疫反応性が赤色で、HIF1-alphaのラベルが緑色で示されている。同様に、核はDAPIで染色されており、青色に表示される。矢印はHIF1-alphaの発現が低いことを示している。

2時間の酸素・グルコース欠乏および5時間の再酸素化後、培養海馬アストロサイトにおいてHIF1-alphaの発現が増加しており、これはHIF1-alphaの核内発現の上昇を示す矢印頭で示されている。雄マウス由来の海馬アストロサイト培養において、酸素・グルコース欠乏および再酸素化に伴い、GFAPおよびS100bの発現が上昇した。S100bおよびGFAPの上昇は、雌マウスから得られたアストロサイトでも認められた。

本手順に続き、定量PCR、ウェスタンブロッティング、siRNA、免疫組織化学染色などの他の手法を実施することで、in vitroにおける虚血後の特定の遺伝子およびタンパク質発現における性差などの追加的な疑問を解明することができます。本技術の開発により、神経科学分野の研究者が培養アストロサイトを用いて、海馬における脳卒中の影響と結果を探索するための道が開かれます。