Name: マウス海馬アストロサイトにおける性差後インビトロ虚血 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶマウス海馬アストロサイトの性差を用いた虚血モデル。新生児マウスから性別を分けてアストロサイトを培養し、酸素・グルコース欠乏と再酸素化による虚血性脳障害の細胞応答を解析する手法です。

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NCATS UL1 TR0000427 および KL2 TR000428 (Cengiz P) の臨床およびトランスレーショナル サイエンス アワード プログラム、NIH/NCATS から UW ICTR へのUL1TR000427、Waisman Center (Cengiz P) からのNS088563資金、NINDS (Cengiz P) および NIH P30 HD03352 (Waisman Center)、NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P) からの資金。GFAPノックアウトマウスを提供してくださったAlbee Messing博士に感謝いたします。

注：この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に従って行きました。動物プロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン、施設内動物管理使用委員会の大学によって承認されました。ここで提示された初代星状細胞培養プロトコルは、張Y 19 らとCengiz P 20 らによって提示されたプロトコルから採用されている。いくつかの変更を加えて。 1.海馬解剖とアストロサイトの文化<ol><li> 2 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）それぞれで満たされた氷の上で手術用はさみ、滑らかな細かい鉗子、平坦な先端の鉗子、ペーパータオル、廃棄バッグ、70％エタノールと2解剖皿（直径3.5cm）を含むすべての必要な試薬および材料を準備します。 + DMEM + 5％ウマ血清：手術用機器の事前手続きへ（オートクレーブ）滅菌されていることを確認し、他のすべての材料（アストロサイトメッキ媒体を用います1％ペニシリン-ストレプトマイシン、ウマ血清、HBSS、0.25％トリプシン、カバーガラス、ペトリ皿、15/50 mLチューブ、T25フラスコ、 など ）予め滅菌など。 </li><li>静かに保持し、スプレー、マウスの子犬の頭と首を70％エタノールでシャープな滅菌ハサミを使って首をはねる[ 図1（1）]。 </li><li>脳[ 図1（2-3）]を公開するために頭皮に沿って小さなハサミで頭蓋骨を前方ために後方から正中切開を行います。 </li><li>小さなはさみで鼻に首から慎重に頭蓋骨をカットします。そして、頭蓋底から頭蓋を切断する小脳に嗅球と下に頭蓋前方をカット。 </li><li>頭蓋底に小さな切開を行い、正中線に沿って切断。頭蓋骨を剥がすために滅菌フラット先端鉗子を使用してください。湾曲した鉗子の助けを借りて、脳幹を削除します。頭蓋から脳を削除し、最初の解剖皿に置く[ 図1（4-9）] 21。 </li><li>湾曲した鉗子を使用すると、脳の腹面が上を向くように脳を反転した後、鋭利な無菌手術用刃[ 図1（10,11）]との両半球を分離します</li><li>ピールバック大脳半球と慎重には、海馬、内側頭葉[ 図1（12-14）]の小さい、タツノオトシゴ状の構造を明らかにするために、無菌の平らな湾曲鉗子で膨らみ、中脳と視床組織を取り除きます。 </li><li>海馬ローブ[ 図1（15,16）]の両方を取り外し、慎重に微細な鉗子で引いて、葉から髄膜を分析。このステップは、髄膜細胞および線維芽細胞によって最終的な星状細胞培養物の汚染を避けることができます。 </li><li> HBSSで充填された第2皿に準備された海馬のローブを移し、氷[ 図1（17,18）]の上にそれを返します。カバの製造方法 - 単一のマウスからプールの両方の海馬のローブ（P2 P0）campalの星状細胞培養物。これは、アストロサイト、適切な密度を提供します。鋭い無菌手術用ブレード（約4倍）を用いて、海馬葉をみじん切りに。 </li><li>皿から吸引しHBSS 1 mLのピペットに取り付けられた滅菌チップを使用し、0.25％トリプシンの3 mLを加え混ぜ、15 mLの滅菌コニカルチューブに移し、穏やかに振盪しながら20分間37℃で組織をインキュベートします。 </li><li> 5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ラインに取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて上清を吸引。組織片が均質化するまで、火災研磨したガラスピペットを用いて - （30回20）メディアと粉砕物をメッキ10 mLのアストロサイトを追加します。 </li><li> 5分間、300×gで遠心分離管。上清を吸引し、メディアをメッキ新鮮予め温めアストロサイトの2 mLを加え。新しい50 mLコニカルチューブに70ミクロンメッシュフィルター（セルストレイナー）を介して細胞を渡します。 </li><li>の3 mLを含むポリ-D-リジン/ラミニンコーティングされた無菌のT25培養フラスコにプレート全体の細胞懸濁液メディアメッキアストロサイトは、その後、5％CO 2インキュベーター中、37℃でフラスコをインキュベートします。 </li><li>昼間で吸引し、メディア全体I N-試験管内 （DIV）1、DIV 3およびDIV 7、新鮮なアストロサイトメッキ培地2mLで交換してください。アストロサイトメッキメディアを交換しながら、光学顕微鏡下たびに進行し、アストロサイトの合流を観察します。 注：DIV 1では、すべての実行可能な星状細胞は培養フラスコの表面に付着され、神経細胞を含む死亡または瀕死の細胞は、上清中に浮遊しています。 DIV 3では、付着した細胞は、星状細胞層を形成するために分裂し始めます。支持条件の非存在下で、培養物は、任意のニューロン成長のほとんどを欠いています。 DIV 7では、アストロサイト層は約80 - 90％コンフルエントといくつかのミクログリアだけでなく、オリゴデンドロサイト前駆細胞アストロサイト層の上に存在しています。 </li><li>吸引除去し、フラスコからメッキ媒体、すすぎ、培地をメッキ新鮮予め温めアストロサイトの2 mLを加えNDアストロサイトがコンフルエント培養をサブするための準備ができているとき、DIV 11で再び削除します。 </li><li>静かに滅菌ガラスピペットを用いてフラスコを数回吸引トリプシンを回転させ、0.25％トリプシン2mLのを追加します。 </li><li> 0.25％トリプシンの2 mLを加え、フラスコが4のための組織培養フードに座ってみましょう - RTで5分。 </li><li>トリプシンを削除し、10分間、5％CO 2インキュベーター内で37℃でフラスコを保ちます。 5 mLの培地をメッキアストロサイトを予め温め追加し、あなたの手のひらに対してフラスコをタップして星状細胞層を切り離し（3から4回）完全な分離を達成し、15 mLのコニカルチューブにアストロサイトを収集するために、穏やかな粉砕しました。 </li><li>遠心管は、5分間300×gで、上清を吸引し、1mLの新鮮なアストロサイトメッキ媒体を追加します。 </li><li>血球計数器に細胞懸濁液の10μLを追加し、倒立位相差顕微鏡（10倍対物レンズ）を使用して、大きな中央グリッド面積（1ミリメートル2）で細胞を数えます。ムルtiply 10 4でミリリットル当たりの細胞数を推定します。 One T25フラスコは〜1×10 6合計解離した細胞が得られます。シード〜1×10 24ウェル培養皿のウェル中の12ミリメートル直径ポリ-D-リジンプレコーティングしたガラスカバースリップ上に2 mLのアストロサイトメッキ培地中で5個の細胞。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 14（セクション2） - DIV 12でOGD / REOXを実行します。 </li><li>ミクログリアを欠い海馬培養が望ましい場合DIV 11まで5 mMのL-ロイシンメチルエステル（LME）塩酸塩DIV 3で星状細胞培養物を扱います。 LMEのインキュベーションの後、対象の文化の汚染ミクログリアを除去するために（1時間300 rpm）し振とうします。 注：LMEが増殖ミクログリア22を除去する方法として広く使用されてきた小グリア細胞毒性剤です。 </li></ol> 2. OGD / REOXトリートメント<ol><li>カバースリップから培地を吸引し、接着性アストロサイト培養物（DIV 12から14）を含有し、3回すすぎ静かにカバースリップを（mM単位）を含有する1mLの等張OGD液（pH7.4）で数回保持24ウェル培養皿回転させることによって：0グルコースを、21のNaHCO 3、120のNaCl、5.36のKCl、0.33のNa 2 HPO 4、 0.44 KH 2 PO 4、1.27のCaCl 2、および0.81のMgSO 4。 </li><li>カバースリップをカバーし、94％のN 2、1％O 2および5％CO 2を含有する低酸素培養器中で2時間インキュベートするウェルに0.2mLのOGDの溶液を加えます。静かにガス交換を容易にするために、低酸素状態の最初の30分間オービタルシェーカー（50回転）と混合。 </li><li> 5.5 mMグルコースの追加を除き、OGD液と同一の緩衝液中の5％CO 2および大気中で2時間の正常酸素対照細胞をインキュベートします。 </li><li> REOXについては、吸引OGD液と培地をメッキアストロサイトの2 mLを加え。 5時間、37℃で5％CO 2大気中でインキュベートします。 </li></ol> 3.免疫細胞化学染色&lt;/ P&gt; <ol><li>真空ラインに取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて培地を吸引し、すぐに0.1 Mトリス緩衝生理食塩水（TBS）の1mLのを添加することによってカバースリップを一度リンス（154ミリモルのNaCl、16mMのトリズマ塩基、84 mMのトリス-HCl、pH7.4）でウェルに。吸引し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を2mLを加えます。 RTで15分間インキュベートします。 </li><li>吸引し、0.1 M TBSの1 mLを加え、次に2分間、ロッキングシェーカー上に置きます。 3回繰り返します。溶液（10％のヤギ血清、0.1 M TBS中10mg / mLのBSA、0.025％トリトンX-100）をブロック1ミリリットルを加え、ロッキングシェーカー上にて37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 60分間およびウサギポリクローナル抗S100B（1：500）またはウサギポリクローナル抗HIF1α（200 1）：吸引して溶液と一次マウスモノクローナルを追加抗GFAP抗体（ブロッキング溶液中で500倍希釈の0.2 ml）をブロックしますロッキングシェーカー上で37℃で。 </li><li>マウス月：あるいは、いくつかの星状細胞は、ウサギポリクローナル抗IBA1（200 1）とインキュベートします文化純度にアクセスするためのoclonal抗MAP2。 </li><li>吸引した一次抗体および0.1 M TBS 1mLのを追加し、2分間、その後、吸引用のロッキングシェーカー上に置くことによってカバースリップをすすぎます。二回繰り返します。 </li><li>ロッキングシェーカー上にて37℃で60分間、ブロッキング溶液中で二次ヤギ抗ウサギ488結合抗マウス568結合抗体の200倍希釈1の0.2 mLを加え。 </li><li>吸引した二次抗体と2分した後、吸引用のロッキングシェーカー上、0.1M TBSと場所の1ミリリットルを追加することにより、カバースリップをすすぎます。二回繰り返します。 </li><li>スライド乾燥機の上に位置するスライド上に配置することにより、ウェル・ドライからカバースリップを削除します。 VECTASHIELDの一滴に反転させることによって新しいスライドにマウントカバースリップは、DAPI（1.5 ngの/μL）でマウンティング培地をhardset。 </li><li>どちらか20X乾式または60X油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡の画像カバースリップ。 DAPI用の画像（512×512）を取得（405 nmの元/ 450 nmのEM）と蛍光色素488（488 nmの元/ 515 nmのGFAP抗体をタグ付けしました。EM）。 20Xと60Xグループ内で一定収集パラメータを保管してください。 </li></ol> PCRを使用して4.セックス決意<ol><li> 50mMのNaOH中で45分間95℃で熱子犬つま先や指の切り抜きと1 Mトリス、pHを6.8等量の中和。 </li><li> MyogとSRY遺伝子のためのプライマーの5ピコモル、1×反応緩衝液、0.2mMの各デオキシヌクレオチドおよび8 UのTaqポリメラーゼ：以下の混合物の19μLに抽出したDNA溶液1μLを追加します。 </li><li>プライマー配列を使用します。 SRY 5&#39;TCATGAGACTGCCAACCACAG3 &#39;、5&#39;CATGACCACCACCACCACCAA3&#39;とMyog 5&#39;TTACGTCCATCGTGGACAGC3 &#39;、5&#39;TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3」23。 </li><li> 1分間、72℃で15秒間、58℃で15秒、アニーリング95℃で3分間の変性の後、30サイクルの95℃、伸び：以下のPCRプロトコールを実行します。この30サイクルの後、反応物を1分間の最後の72℃の伸長で終了します。 </li><li>個別のPCR製品は、電気泳動、エチジウムブロマイドを含む2％アガロースゲル上で、紫外線照射下で可視化します。 （ 図2A）。 注意！臭化エチジウムは、潜在的な発がん性物質であり、慎重に処理し、金融機関の規制に従って適切に処分しなければなりません。 </li></ol>

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著者のいずれも競合しないか、利害の対立しています。

生理学的および病理学的条件の下での特性とアストロサイトの機能における性差を研究するために、細胞培養における有性初代星状細胞の調製は、利用するための重要なツールです。本研究では、in vitroで新生児から有性海馬アストロサイトの高濃縮均質な集団（P0-P2）C57BL / 6（野生型）またはK19F（GFAPヌル）仔マウス高効率と文化に再現性のある方法を報告しています。この方法論を確立することは、研究者は、 インビトロ虚血後有性海馬アストロサイトの生理学的および病理学的機能を理解するのに役立ちます。 単一細胞懸濁液を達成するために消化された組織の粉砕し、その後、トリプシン処理中に無菌性および海馬ローブの適切な消化の維持を含め、この方法論を確立する上で2つの重要なステップがあります。初代星状細胞の予防から汚染されたばかり培養プロセス全体を通じて最大の課題の一つです。細菌および/または真菌は、技術を実行しながら、適切なケアが採用されていない場合は無駄な培養細胞をレンダリングすることができ、汚染の2つの一般的なモードです。したがって、実験の成功を確保す...

星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。証拠の成長体は、アストロサイトの役割は、ニューロンのサポートを提供するよりもあることを示しています。実際には、生理的条件下でアストロサイトの役割は、このような、中枢神経系の血流2を規制、開発軸索1の移動を案内するシナプス間質液3のpHホメオスタシスを維持し、血液脳関門に参加するように、非常に複雑になることがあります4とシナプス伝達5。病理学的条件の下では、アストロサイトは、反応性アストログリオーシス（傷害からの距離に対する）における形態、数、位置、地形と呼ばれるプロセスで傷害に応答し、アストロサイトの機能は、異種の方法6,7に変更されることがあります。多分新生児の罹患率と死亡率に貢献する新生児低酸素性虚血性脳症後に見られる星膠症<s&gt; 8まで。 最近の臨床と実験研究は、脳損傷の重症度に比べて男性の新生児は、より深刻な神経学的転帰が得られ、低酸素/虚血（HI）関連脳損傷の影響をより受けやすいこと、セックス依存性であることが表示され、ことを示しています同程度の脳損傷9-11とメス。傷害の局在は妊娠期間と期間と侮辱の重症度に依存するが、海馬は用語新生児HI後にCNSにおいて最も一般的に行なわ地域の一つであり、海馬アストログリオーシスを増加させたアップレギュレーションのによって確認されていますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）新生児HI 7,10,12,13後の3日間。アストロサイトの機能における性差は、脳虚血14,15後の両方の新生児と成人の齧歯類に示しました。また、 インビトロ虚血にオスアストロサイト感受性は増加セル画によって示されました文化16の女性皮質アストロサイトと比較してリットル死。 セックスの違いは、 子宮内開始し、死亡17まで継続します。過去10年間、細胞培養およびin vivoでの研究の実験条件で男女を含むことの重要性は、医学およびNIHの研究所の重点は生理学的および病理学的条件17,18に見られる性差に基本的な知識を求めるようになっています。有性海馬アストロサイトの集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発が新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究は、誘導、酸素/グルコース欠乏（OGD）と再酸素化（REOX）以下のGFAP免疫反応性アストロサイトの役割を評価するために、新生児マウスからの濃縮された性特異的海馬星状細胞培養物を準備する技術を提供するように設計されました細胞培養環境でHI。この技術は、正常酸素および虚血条件下新生児男性および女性における海馬アストロサイトに関連する任意の仮説を試験するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td> アストロサイト培養培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>最終濃度:10%</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td>最終濃度:1%</td></tr><tr><td>L-ロイシンメチルエステル塩酸塩</td><td>Aldrich</td><td>L1002-25G</td><td>最終濃度:5 mM</td></tr><tr><td>Solution for brain tissue digestion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>cellgro</td><td>25-050-CI</td><td>最終濃度:0.25%</td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%(vol / vol)エタノール</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine(PDL)12 mm丸型カバースリップ&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>シグマ</td><td>W3500</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m 滅菌セルストレーナー&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック22363548</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm シャーレ</td><td>BD ファルコン</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ファルコン チューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコン チューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>鉗子、罰金&nbsp;</td><td>デュモン</td><td>2-1032; 2-1033</td><td># 3c; # 5</td></tr><tr><td>鉗子、フラットチップ</td><td>KLS Martin</td><td>12-120-11</td><td></td></tr><tr><td>13 cm 手術用ハサミ</td><td>Aesculap</td><td>BC-140-R</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>A1RSi&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5805000.017</td><td>5804R</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE 4450-1CE</td><td>MaxQ 4450&nbsp;</td></tr><tr><td>抗IBA1</td><td>和光</td><td>019-19741</td><td>ウサギモノクローナル</td></tr><tr><td>抗MAP2</td><td>Σ</td><td>M2320</td><td>マウスモノクローナル</td></tr><tr><td>抗HIF1α</td><td>abcam</td><td>ab179483</td><td>ウサギモノクローナル</td></tr><tr><td>抗S100B</td><td>Σ</td><td>HPA015768</td><td>ウサギポリクローナル</td></tr><tr><td>抗GFAP(カクテル)</td><td>バイオレジェンド</td><td>837602</td><td></td></tr><tr><td>ベクタステインエリートABCキット(ウサギIgG)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6101</td><td>4種類の試薬が含まれています&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス Alexa-Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス海馬アストロサイトにおける性差後<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

低酸素症/虚血（HI）関連脳損傷後のアストログリオーシスは、新生児における罹患率及び死亡率の増加に役割を果たしています。最近の臨床研究では、脳損傷の重症度は、セックスは依存しているように表示されていることを示しており、男性の新生児は、同等の脳損傷で、女性に比べて、 より深刻な神経学的転帰が得られ、HI-関連の脳損傷の影響をより受けやすいこと。有性海馬アストロサイトの高度に濃縮された集団を分離し、維持するための信頼性の高い方法の開発は、新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究では、再酸素化に続くインビトロ虚血、酸素-グルコース欠乏のモデルに供される性別特定海馬星状細胞培養物を作成するための方法を記載します。その後の反応性アストログリオーシスはimmunostaiで調べましたグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）とS100BのためのNing。この方法は、個別に、新生児HI以下の男性と女性の海馬アストロサイトの役割を研究するための有用なツールを提供しています。

生理学的または病態生理学的条件の下で有性アストロサイト機能の役割を理解することは非常にインビトロ条件下でこれらの細胞を培養することによって明らかにされています。有性培養を行うことの重要な態様は、使用前に、マウスの仔の性別を決定することです。我々は遺伝的PCRによって、および視覚的評価（ 図2）16によってマウスの性別を決定します。 PCRを用いセックス決意の方法論はMcCliveとシンクレアから修正を加えて採択された、迅速、簡単でかつ再現性の高い方法23である。 図2Aは 、PCRを使用してセックス決意の代表的な結果を示しています。 PCR産物は2つの代表的なP1男性と女性の尾切れ端から抽出したDNAを用いて作製しました。反応は441 bpおよび女性specifのオス特異的なバンドを生成SRYとMyog遺伝子のための多重プライマー対を含み、それぞれ245塩基対のICバンド。新生児の視覚決意（P 1から3）肉眼...

星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。ここでは、 インビトロ虚血後の男性と女性の新生児の仔にアストロサイト機能の基礎となるメカニズムを研究するために、有性海馬アストロサイト培養プロトコルの実用的な方法を報告しています。

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

本手法の全体的な目的は、新生マウスから性別特異的な濃縮海馬アストロサイト培養物を調製することです。これにより、細胞培養環境で生体内の低酸素性虚血を模倣した酸素・グルコース剥奪および再酸素化後の、アストロサイトの性別特異的な役割を研究するためのツールを提供します。この方法は、発達段階にある雄および雌の脳において、低酸素性虚血後の海馬アストロサイトが果たす性別特異的な役割に関する、重要なメカニズムおよびトランスレーショナルな疑問への回答に寄与します。小さなハサミを用いて皮膚を後方から前方へ正中線に沿って切開し、頭蓋骨を露出させて、新生マウスの頭部から脳を取り出します。首から鼻にかけて、頭蓋骨の正中線を慎重に切開します。滅菌済みの平鉗子を用いて、頭蓋骨を剥離します。弯曲鉗子を用いて脳幹を除去し、残りの脳を解剖皿に移します。曲がったピンセットを使用して、脳を反転させて腹側を上に向け、その後、鋭利で滅菌済みの外科用メスで大脳半球を分離します。平型の曲がったピンセットを用いて大脳半球を剥ぎ取り、膨らんでいる中脳および視床組織を慎重に取り除いて、内側側頭葉にあるタツノオトシゴのような形状の小さな構造物である海馬を露出させます。両側の海馬葉を取り出し、微細ピンセットで牽引して、葉の表面から髄膜および線維芽細胞を慎重に除去して清掃します。単一のマウスから採取した両側の海馬葉を、約5 millilitersのHBSSを満たした2つ目のディッシュに移し、氷上に置きます。鋭利で滅菌済みの外科用メスを用いて、海馬葉を約4回細切にします。1 milliliterの滅菌ピペットを使用して、HBSSと組織を50 milliliterの滅菌コニカルチューブに移し、300 times Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引します。0.25% トリプシンを 3 milliliters 加えて混ぜ合わせ、組織を 37 °C で 20 分間、緩やかに振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、チューブを 300 ×g で 5 分間遠心分離します。遠心分離後、滅菌済みのガラスピペットを用いて上清を慎重に吸引し、あらかじめ加温しておいたアストロサイト播種用培地を10 milliliters添加します。火炎滅菌したガラスピペットを用いて20〜30回トリチュレーションを行います。さらに300 times Gで5分間遠心分離した後、上清を吸引し、アストロサイト播種用培地を2 milliliters添加します。細胞懸濁液を70 micronのメッシュフィルターに通し、新しい50 milliliter円錐チューブに回収します。全量の細胞懸濁液を、3 millilitersのアストロサイト播種用培地を含むコート済み滅菌T-25培養フラスコに加えます。フラスコを5%carbon dioxideインキュベーター内、37 degrees Celsiusで培養します。翌日、光学顕微鏡下でアストロサイトのコンフルエンスの進行を確認し、培地を吸引して、2 millilitersの新鮮なアストロサイト播種用培地と交換します。in vitroで11日目あたりに、培地を吸引した後、2 millilitersの0.25%trypsinを添加して、コンフルエントになったアストロサイトを回収します。フラスコを数回静かに回転させ、滅菌ガラスピペットを用いてtrypsinを吸引します。0.25% trypsinをさらに2 milliliters加え、フラスコを室温で4-5分間静置します。trypsinを除去した後、フラスコを5%CO2インキュベーターに入れ、37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。インキュベーション後、astrocyte plating mediumを5 milliliters加え、フラスコを3～4回叩いてアストロサイト層を剥離させます。細胞懸濁液をフラスコの底で緩やかにピペッティングし、完全に剥離させた後、アストロサイトを15 mLのコニカルチューブに回収します。チューブを300 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1 mLの新鮮なアストロサイト播種用培地を加えます。細胞懸濁液 10 µL をヘモサイトメーターに添加し、10倍対物レンズを備えた倒立位相差顕微鏡を用いて、中央の大きな格子状エリア内の細胞数をカウントします。細胞を、アストロサイト播種用培地 2 mLあたり約 1 × 10⁵ 個になるように希釈します。細胞懸濁液 2 mL を、24ウェル培養プレートのウェル内にあるポリL-リジンコートガラスカバースリップ上にピペッティングします。5%二酸化炭素インキュベーターを用いて37°Cでインキュベートします。酸素およびグルコース剥奪を開始するには、接着アストロサイトを含むカバーガラスから培地を吸引し、1 mLの等張OGD溶液で1回洗浄します。ウェルに0.2 mLのOGD溶液を加え、低酸素インキュベーターに入れます。低酸素状態の最初の30分間、50 rpmに設定したオービタルシェーカーで緩やかに混合します。再酸素化のためには、OGD溶液を2 mLのアストロサイト播種用培地に置換し、5% 二酸化炭素および大気条件下、37 °Cで5時間インキュベートします。この免疫蛍光画像は、マウス初代海馬アストロサイト培養の純度を示しています。アストロサイト培養において、神経細胞樹状突起マーカーであるMAP2を赤色に、ミクログリアマーカーであるIBA1を緑色に免疫染色した。核はDAPIで染色されており、青色に呈している。矢印はミクログリアの混入を示している。正常酸素条件下で培養された海馬アストロサイトの代表的な免疫蛍光画像である。GFAPの免疫反応性が赤色で、HIF1-alphaのラベルが緑色で示されている。同様に、核はDAPIで染色されており、青色に表示される。矢印はHIF1-alphaの発現が低いことを示している。2時間の酸素・グルコース欠乏および5時間の再酸素化後、培養海馬アストロサイトにおいてHIF1-alphaの発現が増加しており、これはHIF1-alphaの核内発現の上昇を示す矢印頭で示されている。雄マウス由来の海馬アストロサイト培養において、酸素・グルコース欠乏および再酸素化に伴い、GFAPおよびS100bの発現が上昇した。S100bおよびGFAPの上昇は、雌マウスから得られたアストロサイトでも認められた。本手順に続き、定量PCR、ウェスタンブロッティング、siRNA、免疫組織化学染色などの他の手法を実施することで、in vitroにおける虚血後の特定の遺伝子およびタンパク質発現における性差などの追加的な疑問を解明することができます。本技術の開発により、神経科学分野の研究者が培養アストロサイトを用いて、海馬における脳卒中の影響と結果を探索するための道が開かれます。

sex-differences-mouse-hippocampal-astrocytes-after-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

固定マウス脳スライスにおける蛍光色素イオントフォレーシスを用いたアストロサイト形態の可視化

虚血性細胞死経路を研究するための性層別ニューロン培養

急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。...

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

虚血性脳損傷の多くの局面を再現することができentorhino海馬器官型切片培養のためのプロトコルは、提示される。神経細胞の変化に加えて、神経脈管構造の変化を研究することによって、このプロトコルは、損傷後の神経組織内のプラスチック製の変化を研究するための汎用性の高いツールです。...

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。...

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

生後に一側内頚動脈閉塞を行った 7 10 CD-1 マウス新生児低酸素性虚血性 (HI) モデルを作成する子犬とこんにちは脳損傷の効果を検討しました。非運営正常なマウスと比較してこれらのマウスの神経行動学的機能を検討した.

新生児低酸素性虚血性脳損傷のマウス モデルにおける神経行動学的評価

本原稿では、海馬動脈と毛細血管をマウス脳から分離する方法と、圧力ミオグラフィー、免疫蛍光、生化学、分子研究のためにそれらを加圧する方法について詳しく説明している。...

機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤

このプロトコールは、マウス脳の自由浮遊組織切片の切片化、染色、および画像化のための方法を記載し、続いて、アストロサイト領域体積およびアストロサイト領域オーバーラップまたはタイリングの分析の詳細な説明を記載する。...

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

プロトコルは、マウスモデルにおける軽度の外傷性脳損傷について説明しています。特に、軽度の正中線閉鎖頭部外傷を誘発するための段階的なプロトコルおよび動物モデルの特徴付けが完全に説明されている。...

マウスにおける軽度外傷性脳損傷の電磁制御クローズドヘッドモデル

このプロトコルは、皮質虚血性脳卒中後のNeurod1のウイルス媒介性異所性発現を説明しています。Neurod1は、(1)脳卒中後の亜急性期(7日間)に野生型マウスにCre-Flex...

虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル

ここでは、新生児マウスをさまざまな酸素濃度の制御された環境で送達することにより、低酸素症を誘発するプロトコルを紹介します。出生時に酸素変動を受けたマウスモデルは、自閉症などの行動表現型変化の誘導に関与するmiRNAの発現を永続的に変化させています。...

低酸素症は、マウスの自閉症スペクトラム障害の非メンデル遺伝に関与するmiRNAレベルを変化させます

学ぶマウス海馬アストロサイトの性差を用いた虚血モデル。新生児マウスから性別を分けてアストロサイトを培養し、酸素・グルコース欠乏と再酸素化による虚血性脳障害の細胞応答を解析する手法です。

マウス海馬アストロサイトにおける性差後

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