Name: loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶロス・ゲイン・オブ・ファンクション操作による着床前マウス胚の内細胞塊分化制御メカニズムの解明法。neogenin受容体の段階特異的役割を同定し、初期細胞運命決定と幹細胞生物学への理解を深めます。

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著者らはまた、製造およびcDNAとのshRNAベクターをネオゲニンための構造を共有するためのジョージア健康科学大学の博士熊のグループを承認したいと思います。この研究は、韓国研究財団によっておよびSahmyook大学からの研究助成金によって賄わ基礎科学研究開発プログラム（2013R1A1A4A01012572）からの助成金によってサポートされていました。

注：動物の飼育や心配事のためのすべての手順はSahmyook大学、ソウル、韓国のIACUCの規則に従って行いました。 1.過排卵、繁殖や卵管の単離<ol><li> 22±3℃、〜60％の湿度、12時間の明/暗サイクル、水と食料を自由摂取：以下の条件の下で、近交系C57BL / 6マウスを維持します。 </li><li>誘導0.1ミリリットル/ヘッドで5 IU妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）の腹腔内注射によって3-5週齢の雌マウスの排卵は0.1ミリリットルで5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の腹腔内注射によって後48時間続きます/頭。 </li><li>直後のhCG注射後、同じケージに一晩でそれらを保つことによって、同じ株の性的に成熟した雄と過剰排卵誘発性の雌を交尾。 </li><li>次の朝、女性の生殖管に嵌合プラグまたは膣栓の存在によって成功した交尾を確認。 </li><li>妊娠中の雌マウスを生け贄に捧げますhCG注射後に頸椎脱臼18-20時間、続いてCO 2中毒によります。 </li><li>皮膚、その後細かいハサミで腹膜層を切断することにより腹腔を開きます。 </li><li>細かい鉗子で子宮角をピックアップし、優しく体腔から子宮、卵管、卵巣、および脂肪パッドを引き離します。 </li><li>卵管と細かいハサミで卵巣の間の領域をカットします。添付子宮の上部の1cm以上を残して、鉗子を再配置し、卵管の近くに子宮を​​切りました。 </li><li>室温でM16培地を含む35ミリメートルペトリ皿に卵管膨大部を転送します。同じ皿にいくつかのマウスから卵管をプール。 </li><li>胚の検索用実体顕微鏡下皿を置きます。 </li></ol> 2. 2-前核の検索と文化（2-PN）胚<ol><li> 、30または32 G皮下注射針の端をカット鈍い先端にそれを挽くし、フラッシング針として使用することができます。 </li><li>つかいますフラッシング針の上に卵管の端をスライドさせる細かい鉗子。静かな場所でそれを保持するために皿の底に対してフラッシング針の先端を押してください。ペトリ皿に2-PN胚を解放するためにM16培地〜0.1ミリリットルで卵管をフラッシュします。 </li><li>滅菌ガラスピペットを用いて、実体顕微鏡下でフラッシュM16媒体から積雲塊を囲むとともに、2-PN胚を回復し、新しいペトリ皿に移します。 </li><li> 5〜10分間、37℃でダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で0.1から0.5パーセントのヒアルロニダーゼの1.0ミリリットルで酵素消化により2-PN胚からの卵丘細胞を解離します。 </li><li>静かにガラスピペットおよび卵丘細胞を物理的に除去してピペッティングすることにより胚をはぎ取ります。 </li><li>胚あたりの新鮮なリン酸緩衝生理食塩水（PBS）30〜50ミリリットルで裸に胚を3回洗浄します。 </li><li> 10 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA、FRACTを補充M16培地中で35mmのプラスチック製ペトリ皿中で胚をインキュベート以下4時間後に通常はマイクロインジェクションが行われるまで加湿インキュベーターで5％CO 2中37℃でイオンV）。 </li></ol> 3.胚逆転写（RT）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR） <ol><li>逆転写酵素、RNaseインヒビター、オリゴdTプライマー、ランダム6mers、のdNTP混合物、および反応バッファーを含む転写酵素プレ混合溶液を逆胚盤胞期までの各段階からの少なくとも10の胚を回収し、5倍の4.0μlのそれらをプールPCRチューブ。 </li><li> 20μlの総体積にRNaseフリーの蒸留H 2 Oを加え、200 W.で30秒間プール胚を超音波処理を95℃で5分間インキュベートし、続いて1時間42℃で直ちにRT反応を開始します。 </li><li>生成されたcDNA溶液のそれぞれ5.0μlのために、ネオゲニンのためのプライマーを用いて通常のPCR増幅を行い、Cdx2の、Sox2の、Tead4、Nanogの、のOct3 / 4、またはβアクチンの表に示す（プライマー配列</stronグラム&gt; 1。 PCRは、95℃で15秒のインキュベーションを40サイクル、（ 表1に示されている）アニーリング温度で30秒間、および72℃で30秒から成ります。 </li><li>別個のPCR産物の電気泳動による2％アガロースゲル上でエチジウムブロマイドで染色した後、UV光下でゲルを視覚化します。 </li><li> βアクチンレベルに対する標的遺伝子の発現を正規化します。 </li></ol>胚の4免疫細胞化学<ol><li>簡単な洗浄により、0.01％BSAを含むPBSで3回続いて室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドを用いて、各段階から胚を修正しました。 </li><li>室温で10分間、0.1％のTween 20および0.1％トリトンX-100を含むPBS 1.0 ml中に10の胚をインキュベートすることによって透過処理細胞膜。 </li><li> PBSの1.0ミリリットルで透過化​​胚を培養する非特異的結合ブロックするには、室温で30分間、10％正常ヤギ血清を補充しました。 </li><li>ブロックされた胚のウィットをインキュベート時間ウサギ抗ネオゲニン抗体を1：4℃で一晩、0.1％BSAを含むPBS中で100倍希釈。 </li><li> PBSの滴で30秒間それぞれについて3回洗浄した後、1でアレクサ488結合ヤギ抗ウサギIgGまたはアレクサ568結合ヤギ抗ウサギIgGのいずれかで胚をインキュベートする：PBS / BSA溶液中で500希釈を4℃で一晩。 </li><li>アクチンフィラメントを可視化するために、室温で1時間、PBS中1μg/ mlのファロイジンで胚をインキュベートします。 </li><li>室温で5分間に1μg/ mlのDAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）を含む5 mlのPBSを添加することにより核を染色します。 </li><li>洗浄は、PBSで3回簡単に胚。 </li><li>ガラススライドに胚を移し、鉱物油の滴でそれらをカバーしています。 </li><li>適切な波長の励起との共焦点顕微鏡で1,000倍の倍率で画像を撮影します。 </li></ol>ネオゲニン-RFPおよびネオゲニン-siRNAのGFPプラスミドの5準備<ol><li>サブネオゲニンフラグ-RFPで得られたベクターを含有する赤色蛍光タンパク質（RFP）へのクローンをコードするcDNAマウスネオゲニン、。 </li><li> （ 図1参照）のpcDNA-EmGFP-MIR-ネオゲニン、その結果、ベクターを含有エメラルドグリーン蛍光タンパク質（EmGFP）にネオゲニン標的小ヘアピンRNAのサブクローニング。 </li><li>ネオゲニンフラグ-RFPとのpcDNA-EmGFP-のmiR-ネオゲニンプラスミドの両方を増幅し、従来の方法でそれらを浄化します。 </li><li>無菌のTris-EDTA（TE）緩衝液中のプラスミドに〜1.0μgの/ mlの最終濃度を調整します。 </li></ol> 2-PN胚へのプラスミドの6マイクロインジェクション<ol><li>新鮮なM16培地で、簡単に、一度裸に2-PN胚を洗ってください。 </li><li>前核の観察を可能にするためにテーブルトップ遠心機1,000×gで10分間、2-PN胚を遠心。 </li><li> additi、5％CO 2中37℃で鉱物油の下胚あたりのM16培地の20〜30μlに微小液滴で胚をインキュベートonal 1〜2時間。 </li><li>メカニカルプラーと、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（IDは= 0.94ミリメートルOD = 1.2ミリメートル）を引いて、注入ピペットと保持ピペットを製造しています。 </li><li>鈍ヒントとmicrogrinderとmicroforgerを使用して、&lt;500μmの先端の長さと1〜2μmの先端内径の研磨開口部を持つように注入ピペットを製作。 </li><li>彼らが20μmと100μmの外径の内径と鈍ヒントや研磨の開口部を有するようにピペットを保持して製作してください。 </li><li> 1.0μgの/μlのでプラスミド溶液の十分な量の負荷注入ピペット（&gt; 200 NL）。 </li><li>顕微注入する〜電動式マイクロマニピュレータに取り付けられたマイクロインジェクターを用いて、前核の1つにそれぞれ2-PN胚のためのプラスミド溶液の10 PL;このプロセスの間に、保持ピペットで負圧を適用することによって所定の位置に胚を保ちます。 </li><li>マイクロインジェクション後、リットル用の新鮮なM16培地で2-PN胚を3回洗浄1分毎の時間よりESS。 </li><li>培養培地の蒸発を防ぐためにミネラルオイル滴で覆われたプラスチック培養皿に新鮮なM16培地の滴中で2-PN胚。 </li><li> 200Xの倍率で微分干渉コントラスト（DIC）倒立顕微鏡下で24時間の間隔で胚を観察します。 </li></ol>

<ol><li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。

現在のプロトコルでは、我々は、マウスの胚発生の初期に細胞分化におけるネオゲニンの役割を探求する2-PNのマウス胚に、cDNAまたはshRNAのいずれかで、遺伝物質のマイクロインジェクションの新規な方法を示しています。着床前胚の遺伝子改変は、例えばのための基礎となる分子メカニズムに関する重要な情報を暴くための強力な技術は、最初の細胞系譜の決意です。遺伝子改変は、遺伝子機能を確認するための最も一般的に使用される方法の一つです。外来遺伝物質のための2-PNの胚および2-PN胚へのcDNAおよびshRNAのマイクロインジェクションの可能性の比較的大きなreceptibilityでは、この胚操作技術は、真性はもちろんのこと、胚に最小限の物理的破壊で実現することができますこの遺伝子操作に関連した相補性。 細胞質の注入が容易になり、あまり有害であることを考慮すると、核注入よりも生存するが、それにもかかわらず、核注入に関連した外来DNAのより高い発現に、強調されるべきである1改善が核内にマイクロインジェクション前に前核を配置するために遠心分離を使用することです。最も技術的に洗練された要求の厳しいス...

着床前胚発生は、1細胞期から桑実胚および胚盤胞に、いくつかの別個の段階に分けることができます。多くの証拠は、極性および位置合図は栄養外胚葉（TE）および内部細胞塊（ICM）に初期の細胞運命の決意に役割を果たすことを示唆しています。しかしながら、それらはセルラ信号に導入されているかの手がかりの性質、および生理学的コンテキストとは、そのような信号は、知られていない細胞系譜の分化を開始することが可能です。これらの分化した細胞は、その後胎盤1-3の胚適切な形成と成長のために必要な特徴的な構造と機能を取るために始めて、専門を受けます。 着床前胚は、siRNAまたは標的cDNAのような修飾された遺伝物質の直接注射による操作に特に適しているので、特定の標的分子を研究するために利用することができます。その遺伝的成長の理解があります脊椎動物の胚の分析は、胚発生4の我々の理解を進めるために重要です。 gain-または機能喪失型遺伝子のを達成するためのタイムリーな文脈での胚への野生型遺伝子または変異形の正確な導入が大幅に発達調節される遺伝子の研究を容易にしました。 loss-がと機能獲得型遺伝物質の微量注入を介して、個々の早期非哺乳動物および哺乳動物の胚には、その大きなサイズと大きな受容5の比較的単純です。マイクロインジェクションは、典型的には、非ウイルスベクターを使用して実行されます。特定の利点は、ウイルスベクターおよびトランスジーン上に非ウイルスベクターを使用することの容易さからとられています。マウス胚の急速なloss-がまたは機能獲得型の発現系は、私たちは解剖し、脊椎動物の発生学6,7における遺伝子機能を理解することを可能にするように開発されました。 胚の蛍光標識が大きくMICRの選択を容易にしますoinjectedまたは遺伝的に胚を操作し、同時に、間接的に蛍光強度8に基づいて、マイクロインジェクションsiRNAまたはcDNAの発現レベルを定量化する手段を付与します。この標識、蛍光タンパク質のcDNAを達成するために、GFPまたはRFPは、別々に融合構築物またはいずれかと同時注入されます。 GFPまたはRFPの蛍光強度は、loss-がを保証または機能獲得なされたものに対するsiRNAまたは外来DNAの発現の程度を明らかにする。 ここで、我々は、私たちは、着床前のマウス胚における初期の細胞分化に重要な細胞外の手がかりを中継受容体としてネオゲニン同定することを可能にしたloss-が、ゲインオブファンクション技術のためのマイクロマニピュレーションプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>M16ミディアム、</td><td>Gibco BRL(グランドアイランド、NY)</td><td>M7292 LOT#11A832</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清、&nbsp;</td><td>ダコ(グロストラップ、デンマーク)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, Holland</td><td>G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>Mineral</td><td>oil Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピンと妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン&nbsp;</td><td>(Intervet, Holland)(</td><td>invitrogen , 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&reg;III 逆転写酵素</td><td>lifetechnologies</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>PCR pre mixture</td><td>&nbsp;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td><td>GenDEPOT , A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (molecular grade)</td><td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td><td>Affymetrix USA</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 標識抗ウサギ抗体</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 555 Phalloidin</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&;Dシステム</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>すべてのプラスミドコンストラクト&nbsp;</td><td>ジョージア健康科学大学(ジョージア州アグスタ)のWen Cheng Xiong教授。</td><td></td><td>現在の研究は、&nbspによって親切に提供されました。</td></tr><tr><td>ネオン&reg;&nbsp;トランスフェクションシステム</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>stereo microscrope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Micromainpulation system with Nikon</td><td></td><td>Nikon Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td>Micro Injector</td><td>Nikon Narishige</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>Holder</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige IM 16</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Nikon Narishige</td><td>成重 MF-900</td><td></td></tr><tr><td>グラインダー</td><td>成重</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td>プーラー</td><td>サッター インストラムネット社</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&reg; 384-Well Thermal Cycler&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

遺伝子のサイレンシングと過剰発現の技術は、胚発生に関与する遺伝子の同定に役立ちます。着床前胚における直接的な標的遺伝子改変は、例えば、栄養外胚葉(TE)と内部細胞塊(ICM)への細胞分化に関与する遺伝子の根底にあるメカニズムを研究する手段を提供します。ここでは、着床前マウス胚における初期細胞運命決定のための真正受容体としてのネオゲニンの役割を調べるプロトコルについて説明します。まず、ネオゲニンcDNAとshRNAをマイクロインジェクションすることにより、ネオゲニン機能の獲得と喪失を生み出すために使用された実験的操作について説明します。このアプローチの有効性は、赤色蛍光タンパク質(RFP)または緑色蛍光タンパク質(GFP)のペアワイズ発現レベルとネオゲニン発現の免疫細胞化学的定量との間に強い相関関係があることによって確認されました。第二に、着床前マウス胚におけるネオゲニンの過剰発現は正常なICMの発達につながる一方で、ネオゲニンのノックダウンはICMの異常発生を引き起こすことから、ネオゲニンは細胞外の合図を中継して割球を早期の細胞運命に駆り立てる受容体である可能性が示唆されています。この詳細なプロトコルが、新規の胚発生段階特異的受容体の機能を調査することに成功したことを考えると、胚形成中の他の段階特異的遺伝子の探索と同定に役立つ可能性があると提案します。

我々は、早ければ2細胞期でとして登場すると永続的な初期の桑実胚までは、後期桑実胚と胚盤胞段階（ 図2A）で欠損となって、ネオゲニンが一過着床前マウス胚の初期発生段階で発現していることを発見しました。また、ネオゲニンの空間分布は、主に細胞外に制限しました。 RT-PCR分析の結果は、4細胞期でピークに達するが、完全に16細胞期に欠く以降（ 図2B）、ネオゲニン発現の早期および一過性の性質と一致しました。対照的に、F-アクチンは、一過性と偏発現パターンを明らかにしませんでした。 私たちは、次のロスネオゲニン（ネオゲニンを標的とするshRNAを保有するネオゲニンレベルがネオゲニンのcDNAベクター（ネオゲニンゲイン）またはベクターのいずれかのマイクロインジェクションによって操作することができるかどうかを調べ2-PNの接合体への）。視覚的にネオゲニン損失、RFPおよびGFPからネオゲニン利得は...

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

このプロトコルの全体的な目的は、機能喪失および機能獲得操作を用いて、着床前マウス胚の内細胞塊の分化を制御するステージ特異的な分子を特定することです。この手法は、基礎発生生物学だけでなく、幹細胞生物学、動物科学、そして動物クローニングなどの生殖バイオテクノロジーにおける初期細胞運命の決定という重要な問いへの解答に寄与します。本技術の主な目的は、ステージ特異的な受容体およびリガンドを用いて、胚発生中の胚性幹細胞特異的因子のみの発現を増強することにあります。このプロトコルは、複数の研究室との共同研究により開発されました。そのため、プロセスの実演は共同研究者のSang Jin Lee教授と、その大学院生のYong Il Cho氏が行います。最後の投与から18～20時間後に、二酸化炭素中毒およびそれに続く頚椎脱臼により、妊娠した雌を安楽死させます。次に、背面を開き、微細剪刀で内層を切断します。微細ピンセットを用いて子宮角を見つけて掴み、子宮、輸卵管、卵巣、および脂肪体とともに、慎重に体腔から引き出します。続いて、微細剪刀で輸卵管と卵巣の間の領域を切断します。次に、ピンセットの位置を調整し、子宮の卵管付近を切断します。この際、子宮上部を少なくとも1 cm残すようにしてください。その後、卵管膨大部を、室温で35 mmペトリ皿上に用意した、ミネラルオイルで覆われたM16培地ドロップへと移します。数匹のマウスから採取した卵管を同じ皿にまとめます。テキストプロトコルに記載されている通り、1 CCシリンジ針を準備した後、微細ピンセットを使用して卵管の端を保持し、挿入します。次に、メディアドロップ相で緩やかに穿刺し、累積細胞塊を絞り出します。実体顕微鏡下で、滅菌済みのガラスピペットを用いて、周囲の累積細胞塊とともに2-PN胚を回収し、新しいペトリ皿に移します。次に、組織を1 mLのヒアルロニダーゼ溶液に浸し、卵丘細胞を分散させます。続いて、ディッシュを37 °Cで5～10分間インキュベートします。次のステップは、胚の除卵丘です。ガラスピペットを使用して、バス溶液を緩やかに流し、周囲の胚からキュムルス細胞を分離させます。次に、除細胞された胚を、胚1個あたり30〜50 mLの新鮮なPBSで洗浄します。この洗浄操作を3回繰り返します。次に、胚をBSA添加M16を含む35 mmプラスチックディッシュに移し、マイクロインジェクションを行うまで、加湿インキュベーター内で最大4時間保持します。マイクロインジェクションの前に、除皮した2-PN胚を1 mLの新鮮なM16で軽く洗浄します。その後、溶液ごと胚を遠心チューブに移し、1,000 Gで10分間遠心分離します。次に、各胚を20〜30 µLのM16培地を入れた培養皿に移します。これにより前核が可視化されます。培地を薄いミネラルオイルの層で覆い、胚を37 °C、5% CO2条件下で1〜2時間インキュベートします。その間に、メカニカルプルヤーを用いて、ホウケイ酸ガラスキャピラリチューブから注入ピペットと保持ピペットを作製します。次に、マイクログラインダーとマイクロフォージャーを使用して、先端を鈍らせた注入ピペットを製作し、開口部を2 µmの幅に研磨します。チップの長さは500 µm未満にする必要があります。同様に、先端を鈍くし、内径20 µm、外径100 µmになるように開口部を研磨して、ホールディングピペットを作製します。次に、注入用ピペットに、濃度1 µg DNA/µLのプラスミド溶液を200 nL以上充填します。続いて、注入用ピペットを電動マイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、インジェクターを約10 picolitersのパルス注入に設定します。マイクロインジェクションを行うため、ホールディングピペットの陰圧を用いて胚を固定します。その後、注入用ピペットの先端を進め、前核のひとつにある細胞膜の直近に配置します。次に、細胞膜を貫通させ、前核までさらに押し込み、10 picoliterの注入を行います。マイクロインジェクション後、注入した胚を回収し、新鮮なM16培地で3回洗浄します。各洗浄時間は1分未満で構いません。次に、M16培地が蒸発するのを防ぐためにミネラルオイルを1滴滴下し、各胚をプラスチック培養皿上のM16培地1滴の上に配置して、胚の培養を行います。24時間ごとに、488 nmまたは555 nmのDIC光学系を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、200倍の倍率で胚を観察します。Neogeninは、着床前発生の初期段階で一過性に発現します。これは早ければ2細胞期に現れ、初期桑実胚期まで持続します。その発現は主に細胞の外側に空間的に限定されています。Neogeninの発現レベルは、2-PN受精卵にneogenin cDNAベクターまたはneogeninに対するショートヘアピンRNAを組み込んだベクターをマイクロインジェクションすることで操作されました。指標としてRFPとGFPを共発現させた。得られたneogeninの発現レベルを、免疫蛍光染色および免疫ブロット法により確認した。neogenin欠損胚およびneogenin過剰発現胚のいずれにおいても、肉眼的な形態学的差異は認められず、また、胚盤胞期に至るまでの発生過程に違いは見られなかった。しかしながら、Oct 3および4陽性のICM細胞数で評価したところ、neogenin欠損胚ではICMの発達が抑制されていました。また、neogenin過剰発現胚では、胚盤胞あたりのOct 3および4陽性ICM細胞数がより多く認められました。この観察結果は、rtPCR分析によってさらに確認されました。neogenin過剰発現胚では、Oct3、Oct4、SOX2、およびNanogの発現が劇的に増加した一方で、Cdx2およびTead4の発現変化は無視できる程度であった。習熟すれば、本プロトコルのこのマイクロインジェクション部分は約1時間で完了できる。本プロトコルを実施する際は、胚へのダメージを最小限に抑えるため、2-PN胚の分離、マイクロインジェクション、および胚の培養が最適化されていることに留意すること。この手順法を補完するように、薬剤研究などの試験を行うことで、シグナル伝達経路などの長年の疑問を解明することができます。

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。...

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。...

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マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。...

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人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

初期マウス胚におけるマイクロRNAのプロファイリング手法について述べます。このプロトコルは、低細胞入力と小さなRNA濃縮の課題を克服します。このアッセイは、初期マウス胚の異なる細胞系統におけるmiRNA発現の経時変化を分析するために使用することができる。...

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

この記事は、半クローン胚の構築のための精子の代わりにパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の使用を実証することを目的としています。...

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Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

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変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

学ぶロス・ゲイン・オブ・ファンクション操作による着床前マウス胚の内細胞塊分化制御メカニズムの解明法。neogenin受容体の段階特異的役割を同定し、初期細胞運命決定と幹細胞生物学への理解を深めます。

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

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