loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

このプロトコルの全体的な目標は、機能喪失および機能獲得操作を使用して、着床前のマウス胚の内部細胞質量分化を制御するステージ特異的分子を特定することです。この方法は、基本的な発生生物学だけでなく、幹細胞生物学、動物科学、および動物クローニングなどの生殖バイオテクノロジーにおける初期の細胞運命解放に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な目的は、病期特異的な受容体、および胚発生中に胚性幹細胞特異的因子のみの発現を増強するために使用するリガンドが存在することである。

このプロトコルは、複数の研究所と協力して開発されました。そこで、このプロセスを実演するのは、私の共同研究者であるSang Jin Lee教授と彼の大学院生であるYong Il Choです。最後の注射から18〜20時間後、妊娠中の女性を二酸化炭素中毒とそれに続く子宮頸部脱臼によって犠牲にします。

次に、裏側を開き、細いハサミで内層を切り抜きます。細い鉗子を使用して子宮角を見つけて拾い上げ、子宮、卵管、卵巣、脂肪パッドとともに、子宮角を体腔からそっと引き出します。次に、細いハサミを使用して卵管と卵巣の間の領域を切り取ります。

次に、鉗子の位置を変え、卵管の近くで子宮を切断し、子宮の上部の少なくとも1センチメートルを取り付けたままにします。次に、卵管膨大部を、室温で35ミリメートルのペトリ皿上の鉱油で覆われたM16滴のメディアに移します。同じ皿に数匹のマウスの卵管をプールします。

テキストプロトコルに示されているように、1つのCCシリンジ針を準備した後、細い鉗子を使用して卵管の端を保持し、入力します。次に、メディアドロップフェーズで積雲の質量を静かに穿刺して絞り出します。実体顕微鏡下で、滅菌ガラスピペットを使用して、2-PN胚と周囲の卵丘塊を回収し、それらを新しいペトリ皿に移します。

次に、組織を1ミリリットルのヒアルロニダーゼ溶液に浸して、卵丘細胞を解離します。次に、皿を摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。次のステップは、胚を切除することです。

ガラスピペットを使用して、浴液を静かに流し、周囲の胚から卵丘細胞を放出します。次に、むき出しの胚を胚ごとに30〜50ミリリットルの新鮮なPBSで洗います。この洗浄を3回行います。

次に、胚をM16とBSAを併用した35mmのプラスチック皿に移し、マイクロインジェクションの前に最大4時間加湿インキュベーターに保管します。マイクロインジェクションの前に、露出した2-PN胚を1ミリリットルの新鮮なM16で短時間洗浄します。次に、溶液中の胚を遠心分離チューブに移し、1, 000Gで10分間スピンダウンします。

次に、各胚を20〜30マイクロリットルのM16培地を含む培養皿に移します。これにより、前核が見えるようになります。培地を鉱油の薄層で覆い、胚を摂氏37度で5%二酸化炭素に1〜2時間インキュベートします。

その間、機械式プーラーを使用して、ホウ素ガラスキャピラリーチューブからインジェクションピペットと保持ピペットを準備します。次に、マイクログラインダーとマイクロフォージャーを使用して、先端が鈍いインジェクションピペットを製作し、2ミクロン幅の開口部に研磨します。先端の長さは500ミクロン未満にする必要があります。

同様に、保持ピペットは、先端が鈍く、開口部を内径20ミクロン、外径100ミクロンに研磨して製造します。次に、インジェクションピペットに少なくとも200ナノリットルのプラスミド溶液を、1マイクロリットルあたり1マイクログラムのDNAの濃度でロードします。次に、インジェクションピペットを電動マイクロマニピュレーターに取り付けます。

次に、インジェクターを約10ピコリットルのパルスbul-ih-sesに設定します。マイクロインジェクションの場合は、保持ピペットからの負圧を使用して胚を固定します。次に、注入ピペットの先端を前進させ、前核の1つのすぐ上に細胞膜に隣接して配置します。

次に、細胞膜を槍で刺し、さらに前核に押し込み、10ピコリットルを注入します。マイクロインジェクション後、注入した胚を採取し、新鮮なM16培地で3回洗浄します。各洗濯の時間は1分未満です。

次に、M16培地を一滴の鉱物油で覆って蒸発を防ぎ、各胚をM16培地の滴のプラスチック培養皿に置いて胚の培養を進めます。24時間ごとに、488ナノメートルまたは555ナノメートルのDIC光学系を備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡(200倍)を使用して胚を観察します。ネオゲニンは、着床前期の初期発生段階で一過性に発現します。

それは早くも2細胞期に現れ、初期の桑実胊董藻葬体期まで続きます。その発現は、主に空間的に細胞の外側に限定されています。ネオゲニンの発現レベルは、2-PN接合子にネオゲニンcDNAベクター、またはネオゲニンに対する短いヘアピンRNAを持つベクターをマイクロインジェクションすることによって操作されました。

RFPとGFPは指標として共に表現されました。得られたネオゲニン発現レベルは、免疫蛍光法と免疫ブロッティングの両方によって確認されました。ネオゲニンの喪失とネオゲニン獲得のいずれの胚にも、大きな形態学的違いはなく、胚盤胞の段階までは異なる発達を遂げませんでした。

しかし、ICMの発達は、10月の3および4つの陽性ICM細胞で測定されるように、ネオゲニン喪失胚ではそれほど顕著ではありませんでした。また、ネオゲニン獲得胚では、胚盤胞あたり10月3日および4個の陽性ICM細胞が多かった。この観察結果は、rtPCR分析によってさらに確認されました。

ネオゲニン獲得胚では、Oct 3およびOct 4、SOX2、Nanogの発現が劇的に増加しましたが、Cdx2およびTead4の発現変化は無視できる程度でした。一度習得すると、このプロトコルのマイクロインジェクション部分は約1時間で完了することができます。このプロトコルを試行する間、2-PN胚は冷凍庫に最適化された分離マイクロインジェクションであり、損傷を最小限に抑えるために胚を培養していることに留意してください。

薬物研究など、この手続き的方法を補完して、シグナル伝達経路などに関する古くからの質問に答えることができます。