Name: ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶラット皮質ニューロンにおけるF-アクチン涙点の定量化法。免疫細胞化学染色と蛍光顕微鏡を用いてシナプス可塑性と樹状突起ネットワークの完全性を評価する。神経毒性薬物や神経保護薬の効果解析に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、NIHの助成金DA013137、DA031604、およびHD043680によって資金提供されました。部分的な支援は、生物医学行動科学におけるNIH T32トレーニング助成金によって提供されました。

全ての動物プロトコルを見直し、サウスカロライナ大学の動物実験委員会（保証番号：A3049-01）によって承認されました。 1.低密度胚性神経文化<ol><li> 初代皮質神経細胞培養のための準備 <ol><li>ソリューション： <ol><li> 10 mlのホウ酸緩衝液中のポリ-L-リジン5mgを溶解することによりポリ-L-リシンストック溶液を調製します。 </li><li> 49ミリリットルホウ酸緩衝液中で1ミリリットルポリ-L-リジンストックを希釈して使用液を調製します。 </li><li> 395ミリリットルのdH 2 Oで開始し、その後、全ての成分（ホウ砂の1.24グラムのホウ酸+ 1.9グラム）を加えることによりホウ酸緩衝液、pH 8.4を準備します。 1MのNaOHにより8.4にpHを調整します。 400ミリリットルに調整し、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。 </li><li> 445ミリリットルのdH 2 Oで始まるとすべての他の成分（50ミリリットル10X HBSS証券+ 1.2グラムHEPES）を追加することで、HBSS溶液、pHが7.2を準備します。 1NのHCl、BRIにより7.2にpHを調整しますNGに500ミリリットルとは、ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでろ過します。 </li><li> 10％ウシ胎児血清を含むDMEM / F12：メッキ培地を準備します。ボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでフィルタリングします。 </li><li>完全増殖培地を準備します50ミリリットルNeurobasal培地に、サプリメントを追加する（500μlのグルタマックス（100X）+ 500μlのグルコース抗生物質 - 抗真菌溶液（100Xの+ 1ミリリットルのB-27（50X）+500μlの）+100μlの7.5％炭酸水素ナトリウムはボンネットの下に0.2μmのナイロン膜フィルターでフィルタリングします。 </li></ol></li><li>文化の前に二日： <ol><li>ポリ-L-リジンの2ミリリットルワーキング溶液でコート12 35ミリメートルのガラスボトムディッシュを、フードのO / Nの下におきます。 </li></ol></li><li>文化の一日前： <ol><li>皿から空のコーティング剤とのddH 2 Oですすぎ料理はフードの下で時間乾燥することができます。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（全溶液の10％）でメッキ培地（DMEM / F12を準備します。ピペット2ミリリットル培地に各皿、および37°Cの 、5％CO 2でO / Nインキュベートします。 注：培養する場合には、プラスチック培養皿を回避することが重要です。 （直立顕微鏡用）（倒立顕微鏡用）ガラスボトムディッシュの使用またはカバーガラスは、シャープでクリアな画像が得られます。プラスチックボトムディッシュに比べて、ガラスボトムディッシュは、蛍光顕微鏡検査の際に、不要な色合いやまぶしさを避けることができます。 </li></ol></li></ol></li><li> 細胞培養プロトコル： <ol><li> HBSSバッファー（100〜150ミリリットル）を、冷蔵置く100ミリメートルペトリ皿、鉗子、はさみ、50ミリリットルチューブ、およびフードでUV光の下で15 mlチューブ。 </li><li>培養室の外でフードの下、5％セボフルランの致死吸入で妊娠ラットを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノール、10トン胎盤を露出するようにハサミを使用して腹部cavity.Openの途中で尾から子宮をカットアップしながら、鉗子を使用して、下腹部の皮膚に滅菌します。 </li><li> 8-10 E18の胎児を削除します。プラHBSS溶液を含むペトリ皿中のCe 8-10胎児を。 </li><li>鉗子で胎児の頭の後ろを持ち、その後、身体から頭部を切断するはさみを使用しています。 HBSS 5-7ミリリットルで満たされた別のペトリ皿に入れてください。フードに皿を転送します。 </li><li>冷HBSSで2つの追加の100ミリメートルのペトリ皿を埋めます。 </li><li>ピールさておき頭蓋骨は、そしてHBSSで満たされた新しいペトリ皿に脳をスクープ。 </li><li>それに冷HBSSで新しいペトリ皿に脳を転送し、脳から鋭い湾曲鉗子、別々の小脳および脳幹を使用してください。 </li><li>湾曲した鉗子で半球を分離、確保するためにピンセットを使用してください。髄膜を削除します。マークされた15ミリリットルの遠心管に前頭皮質および転送の部分を分離します。 </li><li>新鮮な2ミリリットルHBSSで15ミリリットルチューブを記入し、各15ミリリットルチューブに20μlのトリプシンEDTA（0.5％トリプシンおよび5.3 mMのEDTAで10倍濃縮混合物を。）を追加します。 </li><li> RTで10〜15分間インキュベートします。ゆっくり、数分おきにチューブを旋回セトリングことはできません。 </li><li> Afター10-15分は、古いHBSSを削除し、新しいHBSSで二回リンスするためにガラスピペットを使用しています。 </li><li> （2ミリリットルHBSS中1mg / mlの、2mgのトリプシンインヒビター）トリプシン阻害剤に浸し、よく混ぜ、それは5分放置します。新鮮なHBSSで二回洗浄します。 </li><li>均質になるまで非常にゆっくりと減少し、先端径較正ピペット及び滅菌チップを用いて再度bubbles.Triturateを回避するように非常にゆっくりとゴム球、磨砕脳片で10~15回ガラスピペットを使用して。 </li><li>転送は、事前に準備コーティングした培養皿（50細胞/ mm2の）に所望の密度で細胞を解離しました。 37°Cの 、5％CO 2でO / Nインキュベートします。 </li><li> 24時間後に、新たに作られた完全増殖無血清Neurobasal培地を含むDMEM / F12培地を交換してください。 </li><li>実験前の少なくとも12から14日間、5％CO 2/95％室内空気の加湿インキュベーター中ですべての回で細胞を維持します。新鮮なNeurobasal培地は、古い培地の約50％を交換しておき5-6日細胞を補います。 </li></ol></li></ol> 2.蛍光標識および免疫細胞化学注：初代皮質細胞培養物の免疫蛍光標識を1 mlと作業容積を有するガラス底面35 mmの細胞培養皿で行いました。 <ol><li>リン酸緩衝生理食塩水のpHが7.4（PBS）で2回ガラスボトムディッシュを洗ってください。 </li><li> RTで15分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。 </li><li> PBSで細胞を2回洗浄し、5分間、PBS中の0.1％トリトンX-100で透過性。 </li><li> F-アクチン特異的な染色で、室温で20分間細胞を処理するため、のAlexaFluor 488ファロイジン（1時40分、1ミリリットルPBS中ファロイジン25μlの）。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄し、1〜2時間、室温で10％正常ヤギ血清でブロックします。 </li><li> 2％正常ヤギ血清を含むPBSで4 O℃でO / Nインキュベートする：ニワトリポリクローナル抗MAP2抗体（2,500 1）希釈</li><li>インキュベーション後、PBSで2回すすぎます。 </li><li>二次抗体（AlexaのRを希釈ED 594結合ヤギ抗ニワトリIgG抗体（1：500）2％正常ヤギ血清で、室温で2時間インキュベートします。 </li><li> PBSですすぎ、ヘキスト染料を10μl/皿を追加します。 </li><li>室温で3分間インキュベートし、PBSで二回洗浄します。 注：ステップ3（F-アクチン涙点カウント）のための標識された細胞は、準備が整いました。 </li><li>封入剤として退色防止試薬100μlの細胞サンプルを維持し、長期保存のため、暗所で4°Cのでおきます。 注：ファロイジンは退色防止封入試薬で保存することができる1週間と蛍光まで暗所で4℃でPBS中で比較的安定しています。ファロイジンを長期間にわたって保管して外に拡散を開始することができるので、最適な画像が染色後1-3日から取得されます。 </li></ol> 3. F-アクチン斑点カウント<ol><li>蛍光顕微鏡をオンにして、20倍の対物レンズに切り替えます。オープン顕微鏡ソフトウェア、および1280×960ピクセルの画像サイズでプログラムを設定し、0.11倍ズームで7ミクロン/ピクセル画像の解像度。 </li><li>赤、緑（495nmで）/（613 nm）の蛍光チャネルの下で共同標識F-アクチン/ MAP2ニューロンの画像を取得します。 </li><li> 5グリーン（F-アクチン）/レッド（MAP2）免疫標識/ブルー（ヘキスト）明確に定義された樹状アーバーと個々のニューロンの蛍光画像を選択してください。 </li><li>連続MAP2免疫蛍光と二次樹枝状のセグメント（長さの範囲25から75ミクロン）でF-アクチン豊富な構造を特定します。 </li><li>水平レベルに画像の選択した領域を回転させます。新しいイメージとしてコピーして貼り付けます。 </li><li>各皿のための一貫性の調整を使用して、画像の背景を引きます。 </li><li>明るい緑色のF-アクチン涙点を数え、訓練を受けた独立した観察者によって手動で選択された樹状セグメントの長さをトレースします。スプレッドシートファイルにデータをエクスポートします。 </li><li> MAP2の長さ（L）総F-アクチン標識された涙点（N）を割ることで密度を計算する樹状突起を標識しました。 F-交流の数などのデータを表現しますデンドライトの10ミクロンあたり錫涙点 注：涙点の樹状シャフト内染色の平均強度よりも少なくとも50％のピーク強度とF-アクチンの蛍光（サ ​​イズ≤1.5μm）をそれぞれ選択した樹状セグメントに含まれていました。 </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

どの著者も宣言すべき利益相反を持っていません。

このプロトコルでは、我々は、私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で培養ラット皮質ニューロンを記述する。次に、我々は、樹状変化を検出するファロイジンとMAP2染色を使用します。その後、我々はF-アクチン斑点の変化を定量化するために特別なソフトウェアを使用していました。 F-アクチン斑点の変化を決定するために、個々の神経細胞の全体の神経回路網が明確に表示されている必要があり、これは、単一ニューロンから適切な二次樹枝状のセグメントを選択することができます。低密度めっきは、個々のニューロンを可視化するための両方、ならびにグリア細胞の存在を最小限にするために重要です。アストロサイトはまた、F-アクチンを含み、ニューロンマーカーなしで、F-アクチン陽性の涙点の分析を混乱させる可能性があります。低密度培養物およびNeurobasal培地の使用は、細胞培養物中で星状細胞の増殖を減少させるのに有用です。しかし、Fアクチンのタンパク質であることを警告与えニューロンに特異的ではない、などMAP2などの特定の神経細胞のタンパク質マー...

この研究の主な目的は、ニューロンの樹状突起ネットワークのシナプス完全性の測定（推定）の信頼性の高い方法を開発することです。ここでは、ファロイジン染色および特殊な（NIS-要素）ソフトウェアを使用して、その後の分析と樹状突起の免疫細胞化学（ICC）の検出の組み合わせを用いて、ラット初代培養神経細胞におけるF-アクチン涙点の定量化について説明します。 標識ファロトキシンは、大小両方のフィラメント（F-アクチン）に対して同様の親和性を有するが、いくつかのアクチン抗体1とは異なり、単量体の球状アクチン（G-アクチン）に結合しません。ファロイジンの非特異的結合は、このように細胞イメージングの間に最小限の背景を提供し、ごくわずかです。ファロイジンは、典型的には、ファロイジンによるF-アクチンのはるかに強い標識化を可能にする蛍光顕微鏡用の細胞タンパク質を標識するために使用される抗体よりもはるかに小さいです。このように、神経細胞におけるF-アクチンの局在の詳細な画像をすることができます標識されたファロイジンを使用することによって得られます。 神経細胞の樹状突起のファロイジン（F-アクチン）染色は、成熟した棘、非とげシナプス2と未熟棘を含む樹枝状構造の多様性を表す離散的「ホットスポット」や明るい「斑点」を生成します。未熟棘薄い糸状仮足及びパッチの形態のいくつかの形態を含み、そしてspinogenesis 3の開始を表すことができます。未熟棘と非とげ状のパッチがPSD95 4を欠いています 。のみならず、棘におけるその後の変化だけでなく、追加の樹枝状構造へのF-アクチンの鉛の生産の変化は、このようにsynaptodendritic整合性5-7を調査するための重要なツールファロイジンを作ります。一般的には、ファロイジン陽性（F-アクチン）涙点の数は、アクティブなシナプス（興奮性および抑制）、アクチンダイナミクスとシナプスの安定性8のバランスを反映しています。 特定のトンを研究することは重要であるが、シナプスのYPES（ すなわち 、興奮棘）、治療の標的が未知であるとき、最初の樹枝状構造体の種々の一般的な整合性を推定する必要があります。 F-アクチンは、抑制性シナプスを含む樹状突起棘および他の構造の主要な構成要素であるので、F-アクチン涙点の変更された数は、シナプス変性症を示すことができます。このシナプス変性症は、より具体的な変化についてさらに調査することができます。複数のシナプスのタイプ/構造を検出するための当社の定量方法は、様々な実験処置後の樹状シナプスの変化（増減）の全体​​的な推定値が得られます。

<table><tbody><tr><td>35 mm ガラス底皿 No. 1.5 カバーガラス</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>ホウ砂</td><td>シグマ</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>シグマ</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>ニューロベース ミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬ソリューション</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー25080</td><td></td></tr>バン<tr><td>ナスはさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>アイリス鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#7鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>世界の精密機器</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>VWR631-0137</td><td></td><td></td></tr>ア<tr><td>レクサフルーア488ファロイジン</td><td>ライフテクノロジーA12379</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常な馬の血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ26050-070</td><td></td></tr>チキン<tr><td>ポリクローナル抗MAP2</td><td>アブカム</td><td>Ab92434</td><td></td></tr>ア<tr><td>レクサレッド594共役ヤギ抗チキンIgG</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズA11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue 生細胞染色 ReadyProbes 試薬 Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements ソフトウェアパッケージ</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E 倒立蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;m Nalgene ナイロン メンブレン フィルター</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（f-アクチン）涙点の定量化

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

（F-アクチン）繊維状アクチンタンパク質はspinogenesis、シナプス可塑性、およびシナプスの安定性に大きな役割を果たしています。樹状F-アクチン豊富な構造の変化は、シナプスの完全性と接続性の変化を示唆しています。ここでは、初代ラット皮質ニューロン、F-アクチン斑点のためのファロイジン染色、およびその後の定量化手法を培養するための詳細なプロトコルを提供します。まず、E18ラット胚の前頭皮質は、その後、低密度の細胞培養物中に少なくとも12〜14日間、in vitroで増殖させた神経細胞を解離します。実験的治療に続いて、皮質ニューロンがのAlexaFluor 488ファロイジンで染色され、微小管結合タンパク質2（樹状F-アクチン斑点標識する）（MAP2を、神経細胞や樹状突起の整合性を検証するために）。最後に、特別なソフトウェアがランダムに選択された神経細胞の樹状突起を分析し、定量化するために使用されます。 F-アクチン豊富な構造は、二次樹枝状の枝に識別されます（長さの範囲25-75＆＃181; m）を連続MAP2免疫蛍光を持ちます。ここで紹介するプロトコルは、実験処理に続いて、樹状シナプス構造の変化を調査するための有用な方法となります。

私たちは、個々の神経細胞の樹状突起を識別することを可能にする35ミリメートルのガラスボトムディッシュで低密度で存在する方法で、私たち第1の培養ラット皮質ニューロン、。 図1では 、微分干渉コントラスト（DIC）画像は、日4、6、10、14、21、in vitroで 27に胎児ラット皮質ニューロンの開発における形態学的変化を示しています。樹状突起の長さと数は、培養ラット初代神経細胞の成熟に伴って増加することに注意してください。ニューロンはわずか14日間熟成した後、実験に使用されています。 樹状突起とシナプスの変化を検出するために、我々は樹状突起のMAP2抗体検出とファロイジンFアクチンの標識を兼ね備えています。 F-アクチンのファロイジン標識は（20-30分）非常に急速であるので、視覚的にICCの抗体標識（ 図2に進む前にsynaptodendriticネットワークの整...

糸状アクチン(F-アクチン)は、スピノジェネシス、シナプス可塑性、およびシナプス安定性において重要な役割を果たします。したがって、F-アクチンpunctaの定量化は、シナプス構造の完全性を研究するための有用なツールです。このプロトコルは、低密度の初代皮質ニューロン培養物でファロイジンで標識されたF-アクチンプンクタを定量化する手順を説明しています。

ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

本「培養ニューロンにおけるフィラメント状アクチンパンクタの定量化」の全般的な目的は、シナプス構造の完全性と認知性を研究するための有用な手法を紹介することです。本手法は、スピノジェネシス（スパイン形成）、シナプス可塑性、およびシナプス安定性に関する神経科学分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、F-actinパンクタの同定および定量化に続く、一次ニューロン培養の詳細なプロトコルを提供することにあります。達成目標が不明な場合は、ラット脳底構造の全般的な完全性を推定する必要があります。我々は、コカインなどの乱用薬物や、tatおよびJP 120のようなHIV毒性タンパク質によって誘発されるニューロン損傷を研究していた際に、初めてこの手法を考案しました。培養セットアップの2日前、12個の35 millimeterガラス底ディッシュに、2 millilitersのPoly-L lysine調製液でコーティングを行います。そして、無菌状態を維持するため、ディッシュをフード内で一晩保存します。翌日、コーティング剤を除去し、ディッシュを二回蒸留水で洗浄します。フード内で1時間放置してディッシュを乾燥させます。その後、各ディッシュに2 mLの播種用培地を分注します。その後、ディッシュを37°C、5% CO₂で一晩インキュベートします。培養当日、採取した脳を冷えたHBSSを含むペトリ皿に移します。次に、ピンセットで脳を固定し、曲がった鉗子を用いて脳半球を分離し、髄膜を除去します。前頭皮質を分離し、断片を滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移します。2 milliliterの新鮮なHBSSと20 microliterのtrypsin EDTAをチューブに加え、神経組織を室温で10～15分間インキュベートします。その際、数分おきに緩やかに撹拌してください。インキュベーション終了後、ガラスピペットを用いて古いHBSSをすべて吸引します。そして、新鮮なHBSSで皮質を2回洗浄します。2回目の洗浄後、組織をトリプシン阻害剤に浸します。よく混ぜ合わせ、室温で5分間静置します。その後、新鮮なHBSSで組織を2回洗浄します。次に、ゴム球を付けたガラスピペットを用いて、脳組織の断片を10〜15回、非常にゆっくりとトリチュレーション（破砕）します。次に、口径を細めた滅菌チップを装着した校正済みピペットを用いて、組織スラリーを非常にゆっくりと再度トリチュレーション（撹拌）します。溶液が均質になったら、あらかじめコーティングした培養皿に細胞を適切な密度で播種し、細胞培養インキュベーター内で一晩インキュベートします。24時間後、播種用培地を、新たに調製した完全成長血清不含ナロー基礎培地に交換します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、少なくとも12〜14日間培養します。個々のニューロンを可視化するためには、低密度で播種することが重要です。また、細胞培養内でのアストロサイトの増殖を最小限に抑えるためには、ニューロン基礎培地が不可欠です。免疫細胞化学染色のために細胞を標識するには、まずガラスボトム細胞培養ディッシュをPBSで2回洗浄します。次に、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で15分間細胞を固定します。その後、PBSで2回洗浄します。次に、0.1% Triton X 100含有PBSで5分間細胞を透過処理し、室温でF-actin特異的染色剤を用いて標識します。20分後、細胞をPBSで2回洗浄し、10%正常ヤギ血清で細胞表面の非特異的染まりをブロッキングします。インキュベーション後、4°Cで一晩、チキンポリクローナルanti-map two抗体を用いて細胞を標識します。翌朝、細胞をPBSで2回洗浄し、適切な二次抗体でラベルします。室温で2時間後、細胞を再度PBSで洗浄し、10 µLのhuxsを用いて室温で3分間ラベルします。その後、細胞を最後にPBSで2回洗浄し、100 µLの抗退色剤で保存します。染色から3日以内に、蛍光顕微鏡の電源を入れ、20 X 対物レンズを選択します。次に、顕微鏡ソフトウェアで、画像ピクセルサイズを1600 × 1200に、1ピクセルあたり0.17 micronの画像解像度を1 X ズームに設定します。細胞が入ったディッシュを顕微鏡ステージに載せます。緑および赤の蛍光チャンネルで、F-actinとMap2の共染色を施したニューロンの画像を取得します。すべての画像を取得した後、緑、赤、青の各チャンネルにおいて、樹状突起の分枝構造が明確に定義されている個々のニューロンの画像を5枚選択します。そして、Map2免疫蛍光染色を用いて、二次樹状突起セグメントにおけるF-actin富裕構造を特定します。選択した画像領域を水平方向に反転させます。次に、その領域をコピーして新しい画像として貼り付けます。その後、画像の背景蛍光を減算し、ソフトウェアを用いて明るい緑色のF-actin punctaの数をカウントします。訓練を受けた独立した観察者が、選択した樹状突起セグメントの長さを測定します。その後、パンクタ数と樹状突起セグメント長のデータをスプレッドシートファイルにエクスポートしてください。観察者は、各選択セグメントにおいて、樹状突起シャフトの平均染色強度より少なくとも50%高いピンク色蛍光強度を持つF-actin postureパンクタを含めるようにしてください。最後に、数式に従って密度を算出し、樹状突起10 µmあたりのF-actin puncta数としてデータを表します。ここでは、in vitroでの培養4日から27日目のラット胎児皮質ニューロンにおいて観察された形態的変化を、微分干渉コントラスト（DIC）画像で示しています。培養されたラット一次ニューロンが成熟するにつれて、樹状突起の長さと数が増加することに注目してください。F-actinのファロイジン標識は非常に迅速であるため、免疫細胞化学的な抗体標識に進む前に、シナプス-樹状突起ネットワークの完全性を視覚的に推定することが可能です。Map2は無傷の樹状突起を染色し、F-actinの点状構造がアストロサイトなどの他の細胞ではなく、神経細胞の樹状突起上に位置していることを確認させます。高解像度画像では、phiフィロポディア、スパイン突起、およびF-actinパッチを含むF-actinに富んだ構造を観察することができます。HIV-1 Tatが誘導するシナプスおよび樹状突起の損傷を評価した本実験において、Map2染色により、HIV-1 Tat処理後のラット皮質ニューロンでは樹状突起の分枝が減少し、F-actinが減少していることが明らかになりました。実際、F-actinの点状構造（puncta）は、実験的処置に応じて増加または減少します。例えば、本実験において培養ニューロンを非競合的NMDA受容体拮抗薬であるメマンチンで処理した際、F-actin陽性の点状構造の密度に有意な増加が認められました。対照的に、メタンフェタミンとHIV1 tatの併用処理により、F-actinの点状構造（puncta）の有意な消失が認められました。共焦点顕微鏡でラベル化したF-actin Map2ニューロンの高解像度画像を取得した後、訓練を受けた2名の観察者が、点状構造の密度の解析のために2次樹状突起のセグメントを選択してください。この手法の開発により、神経科学研究分野の研究者に道が開かれました。急性シナプトパチーのモニタリングだけでなく、シナプス回復および実験的な神経修復プロセスの研究にも利用可能です。このビデオを視聴することで、神経樹状突起ネットワークのシナプス完全性を測定するための信頼性の高い手法を構築する方法について、十分に理解することができるでしょう。

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。...

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

透過処理神経成長円錐におけるローダミン-アクチンとF -アクチンばら両端にラベルを付ける

このビデオは、顕微鏡検査のためにラット皮質ニューロンを蛍光染色する手順を示しています。F-アクチンと樹状タンパク質を標的とし、構造的完全性を解析し、神経細胞の機能と健康を研究するために重要なF-アクチン密度を計算します。...

ラット皮質ニューロンにおける糸状アクチンプンクタの定量化

我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。...

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に...

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

提示し、培養するため変更されたロール チューブ法をここでは、フォトエッチング coverslips...

密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法

神経化学的および行動異常の根本にある可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎の形態変化の可能性を評価するために重要な錐体ニューロンを標識し、分析するプロトコルを提示する。...

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした...

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。...

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。...

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

学ぶラット皮質ニューロンにおけるF-アクチン涙点の定量化法。免疫細胞化学染色と蛍光顕微鏡を用いてシナプス可塑性と樹状突起ネットワークの完全性を評価する。神経毒性薬物や神経保護薬の効果解析に有用です。

ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

さらに動画を探す