ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

この培養ニューロンにおける糸状アクチンプンタの定量化の全体的な目標は、シナプス構造の完全性と認知性を研究するための有用な方法を導入することです。この方法は、スピノジェニシス、シナプス可塑性、およびシナプス安定性に関する神経科学分野の重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、F-アクチン点の同定と定量に続いて、初代ニューロン培養の詳細なプロトコルを提供することです。

達成目標が不明な場合、ラティア基礎構造の一般的な完全性を推定する必要があります。私たちは最初にこの方法のアイデアを持っていたのは、コカインのような乱用薬物やHIVの有毒タンパク質、tatやJP 120のようなニューロンの損傷を研究していたときに、培養コート12、35ミリメートルのガラス底皿を設定する2日前に、Poly-Lリジンの作業溶液の2ミリリットル。また、無菌状態を維持するために、フードに一晩保存してください。

翌日、コーティング剤を捨て、皿を二重蒸留水ですすいでください。フードの下で皿を1時間乾かします。次に、2ミリリットルのメッキ培地を各皿に移します。

そして、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩料理をインキュベートします。培養の日のある日、採取した脳を冷たいHBSSの入ったシャーレに入れます。次に、ピンセットで脳を固定し、湾曲した鉗子を使用して半球を分離し、髄膜を取り除きます。

前頭皮質を分離し、片片を滅菌済みの15ミリリットル遠心分離管に移します。2ミリリットルの新鮮なHBSSと20マイクロリットルのトリプシンEDTAをチューブに加え、神経組織を室温で10〜15分間インキュベートします。数分ごとに穏やかに渦を巻いています。

インキュベーションの最後に、ガラスピペットを使用して古いHBSSをすべて吸引します。そして、皮質を新鮮なHBSSで2回すすぎます。2回目の洗浄後、組織をトリプシン阻害剤に浸します。

よく混ぜ合わせ、サンプルを室温で5分間放置します。次に、新しいHBSSでティッシュを2回洗います。次に、ゴム球付きのガラスピペットを使用して、脳の断片を非常にゆっくりと10〜15回回転させます。

次に、直径を小さくした滅菌チップを備えた校正済みピペットを使用して、組織スラリーを再度非常にゆっくりと粉砕します。溶液が均一になったら、プレコートした培養皿に細胞を適切な密度でプレートし、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。24時間後、プレーティング培地を新たに調製した完全増殖血清を含まない狭い基礎培地と交換します。

そして、細胞を細胞培養インキュベーターに少なくとも12〜14日間戻します。低密度めっきは、個々のニューロンを可視化するために重要です。また、ニューロン基底培地は、細胞培養物内のアストロサイスの穿孔を最小限に抑えるために重要です。

免疫細胞化学のために細胞を標識するには、まずガラス底の細胞培養皿をPBSで2回洗浄します。次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。続いてPBSウォッシュを2回行います。

次に、PBS中の0.1% Triton X 100で細胞を5分間透過し、室温でF-アクチン特異的染色液で標識します。20分後、PBSで細胞を2回すすぎ、10%正常ヤギ血清で非特異的な細胞表面の染色をブロックします。インキュベーションの終了時に、一晩で細胞を摂氏4度に、チキンポリクローナル抗map 2抗体で標識します。

翌朝、細胞をPBSで2回すすぎ、適切な二次抗体で標識します。室温で2時間後、細胞を再びPBSですすぎ、室温で3分間10マイクロリットルのハックスで標識します。次に、細胞をPBSで最後に2回洗浄し、100マイクロリットルの退色防止試薬で保存します。

この染色から3日以内に、蛍光顕微鏡の電源を入れ、20 X対物レンズを選択します。次に、顕微鏡ソフトウェアで、ピクセル画像サイズを1600 x 1200に設定し、0.17ミクロン/ピクセルの画像解像度を1倍ズームに設定します。細胞の皿を顕微鏡ステージに移します。

そして、緑色と赤色の蛍光チャネルの下にあるco標識F-actinマップ2ニューロンの画像を取得します。すべての画像を取得したら、明確に定義された樹状突起を持つ緑、赤、青のチャネル内の個々のニューロンの5つの画像を選択します。また、連続マップ2の免疫蛍光を使用して、2次樹状突起セグメントのF-アクチンリッチ構造を同定します。

画像の選択した領域を水平方向に回転します。そして、領域をコピーして新しい画像として貼り付けます。次に、画像の背景蛍光を差し引き、ソフトウェアを使用して明るい緑色のF-actin punctaの数をカウントします。

学習済みの独立した観測者を使用して、選択した樹状突起セグメントの長さを測定します。次に、点数と樹状突起セグメントの長さデータをスプレッドシート ファイルにエクスポートします。観察者には、選択した各セグメントの樹状突起シャフトの染色強度を平均50%以上高いピンク色の蛍光強度を持つF-アクチン姿勢点が含まれていることを確認してください。

最後に、式に従って密度を計算し、データを樹状突起の10ミクロンあたりのF-アクチン点の数として表します。ここでは、差動干渉コントラスト画像は、in vitroで4日目から27日目にラット胎児皮質ニューロンの発達に観察された形態学的変化を示しています。培養ラットの初代ニューロンが成熟するにつれて、樹状突起の長さと数が増加することに注意してください。

F-アクチンのファロイジン標識は非常に迅速であるため、免疫細胞化学的抗体標識に進む前に、シナプト樹状ネットワークの完全性を視覚的に推定することができます。Map2は無傷の樹状突起を染色し、F-アクチン点がニューロン樹状突起上に位置し、アストロサイトなどの他の細胞に局在していないことを確認します。高解像度画像では、ファイフィロポディア、スパイン突起、Fアクチンパッチを含むF-アクチンリッチな構造が観察されます。

HIV 1 tatが誘発するシナプト樹状突起損傷を評価するためのこの実験では、Map2染色により、HIV 1 tat治療後のラット皮質ニューロンの樹状突起枝の減少とF-アクチンの減少が明らかになりました。実際、F-アクチン点は、実験的治療に応答して増加または減少します。例えば、この実験では、培養ニューロンに非競合的なNMDA受容体拮抗薬メマンチンを治療したところ、F-アクチン陽性のプンクタは密度の有意な増加を経験しました。

対照的に、メタンフェタミンとHIV1tatの組み合わせによる治療では、F-アクチンプンクタの大幅な損失がもたらされました。石炭標識F-actin Map2ニューロンの高解像度画像を取得した後、2人の訓練を受けた観察者に2番目の順序樹状突起のセグメントを選択させ、涙点密度を分析させることを忘れないでください。その開発後、この技術は神経科学研究の分野の研究者への道を開きました。

シナプス障害のモニタリングだけでなく、シナプスの回復や実験的な神経修復プロセスの研究にも使用されます。このビデオを見れば、神経樹状ネットワークのシナプス完全性を測定する信頼性の高い方法を開発する方法について十分に理解できるはずです。