ラット皮質ニューロンにおける繊維状アクチン（F-アクチン）涙点の定量化

本「培養ニューロンにおけるフィラメント状アクチンパンクタの定量化」の全般的な目的は、シナプス構造の完全性と認知性を研究するための有用な手法を紹介することです。本手法は、スピノジェネシス（スパイン形成）、シナプス可塑性、およびシナプス安定性に関する神経科学分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、F-actinパンクタの同定および定量化に続く、一次ニューロン培養の詳細なプロトコルを提供することにあります。

達成目標が不明な場合は、ラット脳底構造の全般的な完全性を推定する必要があります。我々は、コカインなどの乱用薬物や、tatおよびJP 120のようなHIV毒性タンパク質によって誘発されるニューロン損傷を研究していた際に、初めてこの手法を考案しました。培養セットアップの2日前、12個の35 millimeterガラス底ディッシュに、2 millilitersのPoly-L lysine調製液でコーティングを行います。そして、無菌状態を維持するため、ディッシュをフード内で一晩保存します。

翌日、コーティング剤を除去し、ディッシュを二回蒸留水で洗浄します。フード内で1時間放置してディッシュを乾燥させます。その後、各ディッシュに2 mLの播種用培地を分注します。

その後、ディッシュを37°C、5% CO₂で一晩インキュベートします。培養当日、採取した脳を冷えたHBSSを含むペトリ皿に移します。次に、ピンセットで脳を固定し、曲がった鉗子を用いて脳半球を分離し、髄膜を除去します。

前頭皮質を分離し、断片を滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移します。2 milliliterの新鮮なHBSSと20 microliterのtrypsin EDTAをチューブに加え、神経組織を室温で10～15分間インキュベートします。その際、数分おきに緩やかに撹拌してください。

インキュベーション終了後、ガラスピペットを用いて古いHBSSをすべて吸引します。そして、新鮮なHBSSで皮質を2回洗浄します。2回目の洗浄後、組織をトリプシン阻害剤に浸します。

よく混ぜ合わせ、室温で5分間静置します。その後、新鮮なHBSSで組織を2回洗浄します。次に、ゴム球を付けたガラスピペットを用いて、脳組織の断片を10〜15回、非常にゆっくりとトリチュレーション（破砕）します。

次に、口径を細めた滅菌チップを装着した校正済みピペットを用いて、組織スラリーを非常にゆっくりと再度トリチュレーション（撹拌）します。溶液が均質になったら、あらかじめコーティングした培養皿に細胞を適切な密度で播種し、細胞培養インキュベーター内で一晩インキュベートします。24時間後、播種用培地を、新たに調製した完全成長血清不含ナロー基礎培地に交換します。

その後、細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、少なくとも12〜14日間培養します。個々のニューロンを可視化するためには、低密度で播種することが重要です。また、細胞培養内でのアストロサイトの増殖を最小限に抑えるためには、ニューロン基礎培地が不可欠です。

免疫細胞化学染色のために細胞を標識するには、まずガラスボトム細胞培養ディッシュをPBSで2回洗浄します。次に、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で15分間細胞を固定します。その後、PBSで2回洗浄します。

次に、0.1% Triton X 100含有PBSで5分間細胞を透過処理し、室温でF-actin特異的染色剤を用いて標識します。20分後、細胞をPBSで2回洗浄し、10%正常ヤギ血清で細胞表面の非特異的染まりをブロッキングします。インキュベーション後、4°Cで一晩、チキンポリクローナルanti-map two抗体を用いて細胞を標識します。

翌朝、細胞をPBSで2回洗浄し、適切な二次抗体でラベルします。室温で2時間後、細胞を再度PBSで洗浄し、10 µLのhuxsを用いて室温で3分間ラベルします。その後、細胞を最後にPBSで2回洗浄し、100 µLの抗退色剤で保存します。

染色から3日以内に、蛍光顕微鏡の電源を入れ、20 X 対物レンズを選択します。次に、顕微鏡ソフトウェアで、画像ピクセルサイズを1600 × 1200に、1ピクセルあたり0.17 micronの画像解像度を1 X ズームに設定します。細胞が入ったディッシュを顕微鏡ステージに載せます。

緑および赤の蛍光チャンネルで、F-actinとMap2の共染色を施したニューロンの画像を取得します。すべての画像を取得した後、緑、赤、青の各チャンネルにおいて、樹状突起の分枝構造が明確に定義されている個々のニューロンの画像を5枚選択します。そして、Map2免疫蛍光染色を用いて、二次樹状突起セグメントにおけるF-actin富裕構造を特定します。

選択した画像領域を水平方向に反転させます。次に、その領域をコピーして新しい画像として貼り付けます。その後、画像の背景蛍光を減算し、ソフトウェアを用いて明るい緑色のF-actin punctaの数をカウントします。

訓練を受けた独立した観察者が、選択した樹状突起セグメントの長さを測定します。その後、パンクタ数と樹状突起セグメント長のデータをスプレッドシートファイルにエクスポートしてください。観察者は、各選択セグメントにおいて、樹状突起シャフトの平均染色強度より少なくとも50%高いピンク色蛍光強度を持つF-actin postureパンクタを含めるようにしてください。

最後に、数式に従って密度を算出し、樹状突起10 µmあたりのF-actin puncta数としてデータを表します。ここでは、in vitroでの培養4日から27日目のラット胎児皮質ニューロンにおいて観察された形態的変化を、微分干渉コントラスト（DIC）画像で示しています。培養されたラット一次ニューロンが成熟するにつれて、樹状突起の長さと数が増加することに注目してください。

F-actinのファロイジン標識は非常に迅速であるため、免疫細胞化学的な抗体標識に進む前に、シナプス-樹状突起ネットワークの完全性を視覚的に推定することが可能です。Map2は無傷の樹状突起を染色し、F-actinの点状構造がアストロサイトなどの他の細胞ではなく、神経細胞の樹状突起上に位置していることを確認させます。高解像度画像では、phiフィロポディア、スパイン突起、およびF-actinパッチを含むF-actinに富んだ構造を観察することができます。

HIV-1 Tatが誘導するシナプスおよび樹状突起の損傷を評価した本実験において、Map2染色により、HIV-1 Tat処理後のラット皮質ニューロンでは樹状突起の分枝が減少し、F-actinが減少していることが明らかになりました。実際、F-actinの点状構造（puncta）は、実験的処置に応じて増加または減少します。例えば、本実験において培養ニューロンを非競合的NMDA受容体拮抗薬であるメマンチンで処理した際、F-actin陽性の点状構造の密度に有意な増加が認められました。

対照的に、メタンフェタミンとHIV1 tatの併用処理により、F-actinの点状構造（puncta）の有意な消失が認められました。共焦点顕微鏡でラベル化したF-actin Map2ニューロンの高解像度画像を取得した後、訓練を受けた2名の観察者が、点状構造の密度の解析のために2次樹状突起のセグメントを選択してください。この手法の開発により、神経科学研究分野の研究者に道が開かれました。

急性シナプトパチーのモニタリングだけでなく、シナプス回復および実験的な神経修復プロセスの研究にも利用可能です。このビデオを視聴することで、神経樹状突起ネットワークのシナプス完全性を測定するための信頼性の高い手法を構築する方法について、十分に理解することができるでしょう。