生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで
2016年1月8日
ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。
生物発光イメージングの全体的な目標は、活性の代理である生体内の機能性カルシウム一過性を、より長期間、および脳深部構造でイメージングすることです。この方法は、睡眠中のハエの脳の基礎活動がどのように見えるかなど、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、レーザーを使用した励起を必要としないことです。
これにより、従来のカルシウムイメージングと比較して、組織のより深いところまで一過性のカルシウムを、光退色や毒性なしに長期間イメージングすることができます。この方法は、ショウジョウバエの脳基礎活動に関する洞察を得ることができ、マウスなどの他のモデル生物にも使用できます。まず、目的のショウジョウバエメラノガスターラインと、付属のテキストプロトコルに記載されている実験溶液を準備します。
次に、単一のショウジョウバエを氷の上のガラスバイアルに2分間移すことにより、氷麻酔をかけます。次に、フライを冷やしたペトリ皿に移し、一対の鉗子を使用して、先端が約35度の角度になるようにトリミングされた1000マイクロリットルのピペットチップ内にフライをそっと置きます。ブラシを使用して、頭が先端の端を完全に超え、背側領域が部分的に露出するように、各フライをそっと押して位置合わせします。
次に、準備した歯科用接着剤をヘッドからピペットの先端に塗布します。頭頂部を避けるように細心の注意を払ってください。ヘッドを正しい位置に固定することは、解剖とイメージングを成功させるために不可欠であるため、ヘッドの接着は非常に重要です。
さらに、接着が不十分な場合、リンガー溶液の漏れやイメージング前のサンプルの死につながります。次に、フライを取り付けたピペットチップを録音チャンバーの穴に通し、軽く押して所定の位置に固定します。次に、準備したシリコン接着剤を使用して、漏れを防ぐために、チャンバーの平らな面をピペットチップと接触する場所に固定します。
プロフュージョンチャネル、短辺、およびチャンバーの背面まで伸びるタップを取り付けます。次に、フライのあるチャンバーを顕微鏡の下に置き、蛍光灯をオンにします。次に、1ミリリットルのリンガー溶液をチャンバーにピペットで入れます。
細い外科用ナイフを使用して、ハエの後頭部から両側の前部まで平行に切開します。次に、目の端に沿って切り込み、前の切開部を接続するアンテナの上に垂直な切開を行います。後頭部で最終的な切開を行い、次に細くて鋭い鉗子を使用してキューティクルを取り除きます。
露出した呼吸器組織をそっとつかみ、脳と蛍光を発するキノコの体がはっきりと視覚化されるまで取り除きます。次に、超鋭利な鉗子を使用して、脳を覆っている神経上皮組織を慎重につかんでつまんで取り除き、セレンテラジンの浸透を可能にします。ピペットを使用して、組織を1ミリリットルのリンガー溶液で2回洗浄して、解剖から残った破片を取り除き、サンプルを暗いボックスに入れます。
次に、5マイクロモルのベンジル-セレンテラジンを含む1ミリリットルのリンガー溶液をチャンバーにピペットで移します。ボックスを閉じ、サンプルを室温で最低2時間インキュベートします。まず、コンピューターの顕微鏡の電源を入れます。
また、カメラをマイナス80°Cに冷却します。次に、排水システムを設定し、環境制御を摂氏20度に調整します。次に、フォトンイメージャーを開き、新しいフォルダーを作成して、最初の記録に名前を付けます。
次に、塩化カリウム、ニコチン、リンガー溶液をそれぞれのリザーバーに追加して、増殖システムを設定します。各溶液が毎分2ミリリットルで排出されるように流量を調整します。次に、サンプルを顕微鏡下のマウントに置き、倍率を5倍に調整します。
次に、穿刺を通してプロフュージョンチューブをチャネルに挿入します。顕微鏡を蛍光モードに設定し、キノコの体を中心に合わせます。キノコ本体にピントが合ったら、倍率を20倍に変更します。
画像の中央に再度配置し、ピントを調整します。次に、排水装置を排水プールの上に置き、先端が排水プールのすぐ上に来るように、排水シャントの高さを調整します。次に、サンプルをリンガー溶液で30秒間洗い流し、適切なドレナージを確認します。
最後に、シールドを引き下げて、装置を外部光から遮断します。フォトンイメージャープログラムの自動化システムを使用して、ピントを微調整し、キノコ体の参照蛍光画像を撮影します。フォトン速度を目的の記録速度(50ミリ秒ごとに1つの画像から1秒に1つ、またはそれ以上)に調整します。
次に、フォトンモードを選択し、シャッターを開きます。次に、ログエントリに遺伝子型、性別、年齢、サンプル番号を入力します。がく、細胞体、および内側葉上の関心領域ボックスの位置を調整するには、ボックスをクリックし、制御を保持しながら所定の位置にドラッグします。
次に、ベースライン値を約 5 分から 10 分間記録します。次に、スイッチを入れてニコチンの流れを開始します。同時に、Enterキーを押して、ニコチンの流れが始まったことを示すメモを追加します。
1 分後にフローを停止し、フローが停止したことを示す別のメモをログに記録します。次に、サンプルをリンガー溶液で5分間洗浄します。サンプルが回復するまで、洗浄をオフにし、タイマーをさらに5分間セットし、塩化カリウムの流れを開始する準備をします。
開始する準備ができたら、塩化カリウムの流れを開始し、サンプルログに「100ミリモルの塩化カリウム開始」を入力します。1分後、流れを止め、塩化カリウムを「シャットオフ」とサンプルログに入れます。次に、サンプルをリンガー溶液で1分間洗浄し、顕微鏡を蛍光モードに切り替えます。
最終的な蛍光画像を撮影し、リンガー溶液をオフにしてサンプルを取り出します。解析プログラムで、最初のファイルを開き、[表示コントロール]タブを選択して、[ROI]をクリックします。次に、コントロールを押したまま、関心のある領域を選択します。
次に、ROIのサイズ、向き、形状を調整して、GFPで照らされたがくと細胞体、および内側葉を囲みます。関心のある領域をすべて追加したら、ムービー」タブを選択してフォトンビデオを再生します。必要に応じて、2 番目の幅と 2 番目のステップを調整します。
次に、必要に応じて ROI の配置を再調整して、ビデオのアクティブ領域内に留まるようにします。GFP蛍光、ニコチン応答、および塩化カリウム応答の代表的なスクリーンショットをいくつか選択してください。次に、スクリーンショットを切り抜き、代表的な画像をプレゼンテーションスライドに貼り付けて、後で分析および比較します。
2番目の幅と2番目のステップの両方を秒単位の録音速度に調整します。また、トップパネルの灰色のマーカーを括弧で囲まれた領域、刺激開始前、および応答終了直後に移動して、解析の長さを選択します。次に、再生中に「ビューを一時停止」を選択し、巻き戻しボタンを押してビデオの再生を最初にリセットし、次に再生ボタンを押します。
次に、タブカウントレートチャートを選択します」単位を調整し、関心のある領域の色や必要に応じて線の色も調整します。分析が終了したら、カウント率データのエクスポートを選択します。次に、萼と細胞体の組み合わせた記録、および両側の内側葉領域からの記録を選択し、それらの画像を応答画像とともにスライドに貼り付けます。
キノコの体を刺激する最も簡単な方法の1つは、イオノトロピックニコチン性アセチルコリン受容体の活性化です。ここに示されている25マイクロモルのニコチンに対する典型的な反応は、萼と細胞体の両方、および内側葉の迅速な活性化から始まり、カルシウムに結合して発光する融合GFP-イクオリンコンストラクトを使用します。一般に、萼および細胞体における応答は、応答の逐次パネルに示されているように、葉よりも長く持続し、より大きな生物発光応答を示す。
ニコチン性活性化に対する生物発光応答の経時的な記録例は、このグラフで説明されており、萼と細胞体を含む関心領域の光子の数が黒でグラフ化され、内側葉領域内の光子の数が赤で示されています。このグラフから、応答の長さ、応答中のピーク光子値、および各曲線の下の総面積をすべて決定できます。習得すると、準備段階はハエの数にもよりますが、インキュベーションのわずか2時間前で完了します。
さらに、各録音は、適切に実行されれば、わずか20分で完了することができます。この手順を試みる際には、サンプル間の再現性を確保するために、フライストックを適切に老化させ、保管することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、構造物の活動が特定の動作にどのような影響を与えるかなど、追加の質問に答えるために、さらに行動テストを実行できます。
この技術の開発により、神経生物学の研究者は、ショウジョウバエの脳の長期的な神経活動を探求する道が開かれました。このビデオを見れば、ハエの脳内での生物発光イメージング用のサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。ニコチンは健康に害を及ぼす可能性があることを忘れないでください。
この手順から溶液を準備したり、クリーンアップしたりするときは、手袋などの予防措置を講じる必要があります。
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概要
本研究では、in vivoでの機能的カルシウム一過性イメージングのための新しい生物発光イメージング技術を紹介します。この手法は、Ca2+に結合して光を放出するGFP-aequorin構築物を利用しており、レーザー励起を必要とせずに脳深部構造の長期的なイメージングを可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経生物学
- カルシウムイメージング
- 生物発光イメージング
背景
- カルシウム・トランジェントは、神経活動の指標となります。
- 従来のカルシウムイメージング技術は、光退色や毒性を引き起こす可能性があります。
- 従来の手法では、脳深部構造のイメージングは困難です。
- 脳の基底状態の活動を理解することは、神経生物学的研究において極めて重要です。
研究の目的
- カルシウム過渡現象の長期イメージング手法を開発すること。
- 脳深部領域でのイメージングを可能にすること。
- 睡眠中のショウジョウバエの脳における基底活動に関する知見を提供すること。
使用した手法
- GFP-aequorin融合構築物の利用。
- イメージング用のDrosophila melanogaster系統の調製。
- プロトコルに記載されている実験用溶液。
- レーザー励起を用いないin vivoイメージング。
主要な結果
- Drosophilaにおけるカルシウム過渡応答の長期的なイメージングに成功。
- 光退色させることなく、脳の深部構造へのアクセスが可能。
- ショウジョウバエ脳の基底活動に関する知見。
- マウスなどの他のモデル生物への応用の可能性。
結論
- 生物発光イメージング技術は、古典的な手法に比べて大きな利点があります。
- この手法により、神経生物学的なプロセスの理解を深めることができます。
- 今後の研究では、この技術をさまざまなモデル生物に活用することが可能です。
よくある質問
産業上の重要性
GFP-aequorinを用いた生物発光カルシウムイメージングにより、レーザー励起を必要とせずに生体内での深部組織における長期的な機能イメージングが可能となり、従来のカルシウムイメージングにおける光退色や毒性という主要な制限が解消されます。この手法は、複雑な神経回路におけるニューロン活動の持続的なモニタリングを可能にし、神経薬理学やターゲットバリデーションに関連する脳の基底状態および刺激状態の指標を提供します。本手法は、長期間にわたるカルシウムダイナミクスの再現性のある定量的な読み取りを可能にすることで、前臨床モデルにおける予測の信頼性を高め、初期創薬におけるメカニズム的なリスク軽減を促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬研究およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：薬理学的刺激に応答した神経活性化の直接的な指標としてカルシウム一過性変化を測定することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：遺伝的に定義された神経細胞集団における細胞内カルシウムフラックスの高時間分解能での持続的イメージングを通じて、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 予測的価値：時間経過に伴う内向きのカルシウム一過性変化とストア放出カルシウムシグナルの両方を捉えることで、ターゲットエンゲージメントおよびパスウェイ調節への信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 標的部位でGFP-aequorinを発現させ、安定したトランスジェニック生物学的システム（例：ショウジョウバエ、マウス）を構築することで、一貫性のある再現可能なカルシウムフラックス測定を可能にします。
- 定量的出力： フォトカウントに基づく読み出しを提供し、ニコチンや塩化カリウムなどのアゴニスト誘発反応のキネティック解析を可能にすることで、用量反応曲線やEC50の決定をサポートします。
- 拡張性： パーフュージョンシステムや自動光子イメージングプラットフォームとの互換性があり、複数の遺伝子型および条件下での標準化された化合物スクリーニングが可能です。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：カルシウムシグナリングが認知機能や神経精神疾患に関与している学習および記憶回路（例：ショウジョウバエのキノコ体）の研究を促進します。
- トランスレーショナルな連続性：ベースラインの活性から薬理学的負荷および回復までの縦断的なイメージングを可能にし、前臨床パイプラインにおけるリスク調整済みの推進決定をサポートします。
- メカニズムのリスク低減：化合物の曝露を、無傷の神経組織におけるリアルタイムで定量可能なカルシウムダイナミクスに結びつけることで、標的メカニズムの曖昧さを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット結合後の機能的な読み出しとして初期探索ワークフローに統合されるものであり、神経ターゲット修飾のリアルタイムかつ活性ベースの検証を提供することで、生化学的アッセイと表現型スクリーニングを橋渡しします。
- 探索生物学：特定の脳領域における神経調節物質（例：ニコチン）に対するカルシウム応答をイメージングすることで、仮説検証および経路の解明をサポートし、シナプスシグナル伝達に関与するターゲットのリスク低減を可能にします。
- スクリーニング：光子計数による再現性の高い定量的なカルシウムフラックスデータを提供し、実験群間での化合物の有効性および作用持続時間の比較を可能にします。
- アナリティクス：カウントレート曲線および曲線下面積（AUC）指標を生成し、条件間での応答強度、キネティクス、および回復の比較を可能にすることで、構造活性相関（SAR）解析をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチ：行動出力に関与する保存された回路（例：キノコ体）でのイメージングを可能にすることで、哺乳類モデルへの適用可能性を含めた前臨床段階での連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：縦断的研究のための再利用可能なイメージングプラットフォームを構築し、モデル調製の繰り返しの必要性を減らし、プロジェクト間での標準化をサポートします。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 光毒性や退色によるアーティファクトの影響を排除し、カルシウム介在性の神経活動を直接観察することを可能にすることで、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を提供します。
- 運用的価値： 遺伝子コード型レポーターと制御された灌流システムを用いることで、再現性と標準化を確保し、回数間およびラボ間の変動を最小限に抑えます。
- 戦略的価値： 持続的で高解像度な機能データを提供し、予期せぬ神経ネットワーク効果による後期的ドロップアウトを削減することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 定量的なカルシウム応答プロファイルに基づいた化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にし、リード最適化における資本効率を向上させます。
実施上の検討事項
- トランスジェニック系統の作製および検証のため、遺伝学的なモデルシステム（例：ショウジョウバエのGAL4/UAS）および分子生物学の専門知識が必要です。
- 冷却カメラ（-80°C）、フォトンイメージャー、および溶液交換のための灌流システムを含む、光子検出インフラストラクチャに依存します。
- サンプル間の比較可能性を確保するため、セレンテラジン負荷、インキュベーション時間、およびベースライン記録プロトコルの標準化が必要です。
- 血液脳関門の透過性やコファクターの送達方法が異なるため、種をまたいでこの手法を適用する場合（例：マウスとショウジョウバエの比較）は、調整を検討する必要があります。
- 実用上の制限として、光子検出中の暗室条件の必要性と、光に敏感で調製直後の使用が求められるセレンテラジンの慎重な取り扱いが挙げられます。
