Name: 生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぶGFPエクオリンを用いた生体内バイオルミネセンスカルシウムイメージング法。Drosophila melanogasterの深部脳構造における長期間の神経活動可視化が可能で、従来法の光漂白や毒性を回避し、睡眠中の脳活動解析に有用です。

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>jove_content<私たちは、米国のSciences WaresのE. Karplus氏に、彼の貴重で有用な助けとアドバイスに感謝しています。この技術の開発と改善に貢献してくださった E. Carbognin、A. Avet-Rochex、M. Murmu、P. Pavot、D. Minocci、G. Vinatier、および J. Stinnakre に感謝します。また、pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BPラインを提供してくれたB.ファイファーとG.ルービン、ジャネリアファーム、H.H.M.I.、アッシュバーン、USAにも感謝します。本研究は、米国ワシントンのフランス大使館シャトーブリアン・フェローシップからA. Lark氏に、全米科学財団(IOS 1352882)から北本隆之氏に、フランスのANRs(ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011)、Conseil Régional Ile-de France (NeRF and DIM), IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS, (2009)の支援を受けて行われました。 そしてCNRSによって、フランスはJRマーティンに。

試料の調製<ol><li>ソリューションの作成と設定<ol><li>標準の食品媒体に24℃ですべてのキイロショウジョウバエのラインを維持します。ハエの標準化されたサイズと重量を生成するために、バイアルに低密度でそれらを維持し、背面。 <ol><li>バイアル中の10人の男性と10処女雌を追加し、それらを交尾させ、新鮮なバイアルに2日おきにそれらを転送します。ハエが孵化するために起動したときに続いて10日後に、毎日ハエを収穫。ハエの年齢の正確な記録を維持し、良好な状態で保管してください。 </li><li> 3日目に、女性から男性を分離し、女性に1バイアル当たり20ハエを保ちます。 4、5日齢でハエを記録します。 </li></ol></li><li>以下の濃度でリンゲル液を準備します。130のNaCl、5mMのKCl、2のMgCl 2、2mMのCaCl 2を、5 mMのHEPES、および36mMのスクロースと正確に7.3に溶液のpHを調整します。 25μの灌流溶液を調製します;リンゲル液中のMニコチン及び100mMのKCl。 </li><li>斜めに（先端の端から約35°）をカミソリの刃の形状チップを使用し、先端から1½センチを超えて過剰の塩基を除去：1,000μlのピペットチップを準備します。 </li><li>インキュベーション中にサンプルを保存するための箱（23センチメートルX 17センチメートルX 8.5センチメートル）を準備します。置き2のスポンジ（12×8 cmでcmで×3 cm）を、それらの準備が完了するようにサンプルを配置するために小型の装置ラックの下に[サンプル乾燥を防ぐために、ボトムに水で飽和させました。 </li><li>これらは、GFP-エクオリンの発現を駆動するために、UAS-GFP-エクオリンとのGal4ラインのコピーの少なくとも1コピーを含むように、ハエのサンプルを準備します。 OK107のGal4ライン（主にキノコ体のライン駆動式）がこの製剤にUAS-GFP-エクオリンと交配されます。 注：ボックスの内側には防水でなければならず、外側はインキュベーション中にセレンテラジンの劣化を防止するために、ボックスに入るの光を遮断しなければなりません。 </li></ol></li><li>予備校サンプルのaration <ol><li>氷をガラスバイアルに移すことによって、ショウジョウバエを麻酔し、ピペットチップ内に位置決めするために冷却したペトリ皿に移動される前に、2分間氷上に保ちます。解剖顕微鏡下で氷の上で100ミリリットルのペトリ皿に少し湿らせたろ紙上にピペットチップを準備します。 </li><li>静かに鉗子場所にピペットチップの内側に飛びます。 </li><li>そっと押して、頭が先端の端を越え、完全であり、背部が部分的に先端整形（ 図2B）の間に除去部により露出するようにフライを揃えるブラシを使用しました。 </li><li>歯科接着剤の二つの成分の小さい（約3〜4μL）部分を結合します。ピペットチップのエッジにと周りにダウン前面と背面の頭と首の周りに慎重に接着剤を適用します - 頭の冠を回避することができます。 2分間の接着剤が乾燥してみましょう。 </li><li>記録チャンバー（ 図2D）とGENの穴に接着されたフライのある場所ピペットチップTLYの場所に固定するために押します。 </li><li>シリコン接着剤（約3〜4マイクロリットル）の2つのコンポーネントが結合します。室とピペットチップは、リンゲル液の漏れを防止するために会う縁に沿って室内の平らな面に接着剤を適用します。 2分間の接着剤が乾燥してみましょう。 </li></ol></li><li>解剖<ol><li>灌流チャネルを介してテープを貼って、短辺及び室の背面に拡張します。 </li><li>蛍光灯の顕微鏡ターンの下で解剖台のフライと室を置きます。ピペット室へのリンゲル液の1ミリリットル。 </li><li>キューティクルを除去するために、細かい手術用メスを使用してください。触角の領域に頭の後ろから並列の切開を行います。その後、前の切開部を接続するアンテナ上の垂直切開を行い、目の縁に沿って切断。頭の後ろのそれへの最終的な切開を平行にしてください。キューティクル（ 図2C）を除去するために細かい鋭いピンセットを使用してください。 </li><li>静かに把握する細かい鋭いピンセットを使用してください脳と[蛍光]キノコ体が明確に可視化されるまで離れて露出した呼吸組織をクリアdは。 </li><li>慎重に把握し、セレンテラジンの浸透を可能にするために脳を覆っている神経上皮組織を挟ま超鋭いピンセットを使用してください。 注：またはパパインneuroepithelia 9を透過するために使用することができます。 </li><li>ピペットを用いて、解剖から任意の破片を除去し、暗箱内のサンプルを配置するためにリンゲル溶液で2回洗い流します。 </li><li>ピペットでチャンバー内に5μMベンジルセレンテラジンを含むリンゲル液の1ミリリットル。ボックスを閉じて、2時間の最小室温でセレンテラジンとのインキュベーションを可能にします。 </li></ol></li></ol> 2.イメージング<ol><li>セットアップ<ol><li>システムの記録を開始：25℃に顕微鏡、コンピュータ、カメラや排水システムの電源をオンにし、設定室内環境制御。 </li><li>コンピュータで開い計測およびオートメーションエクスプローラプログラム。クリック ＆＃8220;デバイスとインタフェース」、その後をダブルクリックし、「NIモーションデバイス」との最後に右クリックし、「PCI-7334」を選択し &quot;&quot;デバイスを初期化。 </li><li>フォトンイメージャを開きます。新しいフォルダを作成し、最初の記録ファイルに名前を付けます。システムが機能するためにカメラを-80℃に到達しなければなりません。 </li><li>灌流システムのセットアップ - のKClを追加し、ニコチン、および貯水池にリンゲル液をインクルードし、各溶液を2 ml /分で放電ように調整。実験を開始する前リンゲル液で洗います。 </li></ol></li><li>サンプルを準備します<ol><li>場所イメージングは​​5倍の倍率で顕微鏡下でマウント上にブロック皿をマウントし、穿刺を通してチャンネルに灌流チューブを挿入します。 </li><li>その後、蛍光モードに顕微鏡を設定し、中心と焦点にキノコ体（MBS）をもたらします。 20Xおよび再中心と焦点を調整します。 </li><li>先端があるように排水プールの上に位置排水装置は、ちょうどabov排水シャントの高さを調整Eのプール、十分な排水を確保するために30秒間リンゲル液を実行します。 </li><li>光から装置を密封するためにシールドをプルダウン。光子イメージャに自動化システムを使用して、フォーカスの微調整を行い、MBの参照蛍光画像を取ります。 </li></ol></li><li>レコーディング<ol><li> （1秒以上まで50ミリ秒から）所望の記録速度に光子の速度を調整します。フォトンモードとオープンシャッターを選択します。レコード遺伝子型、性別、年齢、およびログエントリのサンプル数。 ROIボックスをクリックし、コントロールを押しながらドラッグすることで、がくと細胞体（CCB）と内側ローブの上に位置ROIボックスを調整します。 </li><li>約5〜10分間の録音のベースライン（希望として）。 </li><li> 1分間のニコチンを適用します。ログに開始/停止に注意してください。 5分間リンゲル液で洗浄します。 </li><li>回復のために5分待ってから、塩化カリウムログエントリとタイマーを準備します。 </li><li> 1分間のKClを適用します。ログに開始/停止に注意してください。 1分間のリンゲル液で洗います。 </li><li>スイッチ蛍光モードに、最終的な蛍光画像を取り、リンゲル液をオフにします。 </li><li>押し、「停止」。ダイアログボックスには、システムを遮断するように依頼します。記録を継続するために「いいえ」を選択します。 </li><li>オープンシールド、灌流チューブを取り外し、5倍に排水システム、スイッチレンズ対物レンズを移動させます。段階からサンプル/記録皿を取り出し、水で2回レンズをすすぐと拭いて20Xレンズをきれいに。 </li><li>次の記録を開始するために、プログラムウィンドウの上部にある白い再生ボタンを押します。 </li></ol></li></ol> 3.分析とビデオの作成<ol><li>光子値を抽出<ol><li>光子解析プログラム（例えば、フォトンビューア）を開き、最初のサンプルのスプレッドシートファイルを開きます。 </li><li>表示制御]タブを選択します。コントロールを押しながら地域をクリックすることでROIを選択します。 GFP照らさCCBと内側ローブを包含するように関心領域の大きさ、向きや形状を調整します。 </li><li>さらに追加アルROI「投資収益率の定義」をクリックし、クリックして新しいROIを作成するために、画面上でドラッグすることもできます。 </li><li>光子動画を再生するには「ムービー」タブを選択します。必要に応じて、「秒幅」と「秒のステップ」を調整してください。 ROIの配置は、必要に応じて再調整します。 </li><li> GFP蛍光、ニコチン応答とのKCl応答の代表的なスクリーンショットを選択します。後で分析や比較のためのプレゼンテーションのスライドに作物スクリーンショットとペーストイメージ。 </li><li> 「秒幅」と秒単位で記録速度を「秒ステップ」の両方を調整します。刺激開始前だけ応答終了後ブラケット領域にトップパネルの灰色のマーカーを移動させることにより、分析の長さを選択します。 </li><li>押して &quot;&lt;&lt; REW」を押して「PLAY&gt;」を「再生しながら景色を一時停止」を選択します。 「レートチャートをカウント」し、必要に応じてユニットを調整し、線の色は、ROIの色に合わせて、タブを選択します。 </li><li>分析が完了すると、押して「エクスポート速度データ」を参照して下さい。組み合わせ録音のCCBと各側面からの関心の中葉領域のスクリーンショットを選択します。応答画像をスライドに作物スクリーンショットとペーストイメージ。このスライドは、後に最終的な分析に使用されます。 </li></ol></li><li>例分析：詳述抽出光子データの分析のための一つの方法<ol><li> 「料金の輸出をカウント」フォルダ内のスプレッドシートファイルを開きます。 </li><li>細胞を時間と分で時間を表示するには、最初の列ラベルの時間を再フォーマットします。 </li><li>サンプルに対応するスライドを参照。時間の列と2つの代表的なのROIを除くすべての値を削除します。 </li><li>ニコチン刺激開始時刻を決定する - 主にログエントリファイルで使用可能な起動またはハイライト値の前に追加のデータを削除するフォルダ - 。 </li><li> CCBと中葉とマーク/ハイライトの両方のための最高/ピーク値を検索します。 </li><li>両方の応答の開始および終了時間を決定します以下からの時間のポイントを使用して推定値を作成することにより、CCBと内側ローブは、スライド上の応答をグラフ化し、これらの点に近接した値の変化により、実際の値を選択するには、対応します。 CCBと内側ローブの両方で、これらの点の間の領域を強調表示します。また、9マクロを使用します。 </li><li>新しいスプレッドシートの上に1つの実験グループのすべてのサンプルを結合します。 </li><li>行の値を決定することによりピークに位置合わせし、各CCBピーク値のためのものです。そのサンプルデータはに再コピーする必要がありますおおよその行の値を決定するために、最も高い行値から低い値を引きます。すべてのピーク値が合っていることを確認します。 </li><li>二回シートをコピーし、内側ローブ列のみCCBまたは内側ローブ値のページを作成CCBの列のいずれかを削除します。 </li><li>すべてのCCB応答が終了した後にデータを削除します。総光子、応答長（持続時間）、ピーク振幅をラベル4つの行を作成し、応答待ち時間。再び原稿の下にこれをコピーして貼り付けます。 </li><li>応答の間に合計光子を決定するために、SUM関数を使用してください。応答の長さを決定するために、COUNT関数を使用してください。ピーク振幅値を決定するために、最も高い値のセルをコピーしてリンクします。 COUNT関数を使用してください - 応答レイテンシを決定するために - ニコチンの灌流の開始からの応答の開始に選択します。 </li><li>コピー値リンク機能を使用して、秒でスピードを記録することによって、（ピーク振幅を除くすべて）を掛けます。 </li><li>そう（例： 図5B、C、D）必要に応じて、バー/ボックスのグラフは、そのような総光子、ピーク振幅、および応答長として計算されたパラメータのために作成することができます。 </li><li>生データ光子応答後の欄に、平均関数を用いて、各時点での生データポイントを平均。時点における平均光子値のそれぞれについて、平均値の標準誤差（SEM）を決定する列を持つ場合、所望の追跡。 </li><li>平均応答プロフィールを構築するために、平均列を使用CCBのサンプルグループの電子[グラフ]。これはx軸の値のような時間を指定するカラムとy軸として、平均光子値の列を選択し、最終的に散布グラフ作成ツールを選択することができません。 </li><li>内側ローブからのデータをこの解析手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>ビデオ用の画像を作成します<ol><li>オープン光子ビューア。 </li><li>表示制御]タブを選択します。 、選択削除、および/またはそれを最小限にするための制御を保持しながら、ROIをクリックします。 </li><li> 「秒幅」とは、各フレームの内容を決定するために、所望のように（蓄積時間）を変更します。 </li><li>各フレームのオーバーラップを定義するには、「秒ステップ」を変更します。 </li><li>押して &quot;&lt;&lt; REW」、次に「演奏中にエクスポート・ビュー」を「PLAY&gt;」を選択します。ビデオ用の画像は、.PNGファイルのシリーズとして「ビューの輸出」フォルダにエクスポートされます。 </li></ol></li><li>ビデオを作るために、仮想ダブを使用して：ビデオcのための1つの方法は詳細reation <ol><li>画像を含むビューをエクスポートしたフォルダに「resultats」という名前の新しいフォルダを作成します。 </li><li>画像のフォルダにスクリプト（renommer.VBS）を持参してください。 </li><li> renommer.VBSをダブルクリックして実行します。 </li><li>画像は自動的に数値的に名前を変更し、「resultats」フォルダにコピーされます。 </li><li> VirtualDub.exeを開きます。 </li><li>オープンビデオファイルを選択します - （後続の画像は自動的にロードされます）最初の画像を選択します。 </li><li>動画を選択 - 選択フレームレート、必要に応じて調整します。 </li><li>選択圧縮半径にCinepakコーデックを選択 - ビデオを選択します。 </li><li>ファイルでは、ビデオが自動的に作成されたAVIとして保存]を選択します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

必要に応じて、ここで紹介する最近開発された生物発光ベースのGFP-エクオリンアプローチは、Cabrero らに報告されているように腎臓星状細胞などの細胞の他の種類で、異なる神経細胞におけるCa 2+ -活性のインビボで機能的記録で可能にする、など。 2013年5。 修正、トラブルシューティング、追加のコンポーネント、および重要なステップ ショウジョウバエ畜産 GFP-エクオリン導入遺伝子（pG5A）4は、3つの独立した形質転換株6を作成するためのpUASTベクターに挿入しました。すべての行は、その生物発光について試験した、すべてがin vivoでのCa 2+ -活性<...

脳とその離散構造内の活動の基本的なパターニングおよび機能は、長い神経科学の分野内の強烈な研究分野となっています。おそらく、この問題に対処するために使用される最も初期の成功のアプローチのいくつかは、電気的活動の変化の直接的な生理学的測定した - への追加機能を持ってきた（活性のためのプロキシとして）電圧、pHまたはカルシウム濃度の変化のライブイメージングを可能にするが、代替の方法は、神経活動1の研究。イメージング技術は、減少侵襲性および全脳構造内のアクティビティを監視する能力などの利点の広い配列を運びます。また果物ショウジョウバエを飛ぶなど、扱いやすい遺伝学と動物では、そのようなカメレオン、GCaMPs、その他1と遺伝的にコードされたカルシウム指標の開発は、研究者は、単一ニューロン、ニューロン集団と脳全体を監視することができました構造。 GCaMPs（GFPはカルモジュリンに融合）またはFRET（CFPとYFPがカルモジュリンに融合された）を使用して、より伝統的な蛍光カルシウムイメージング法は、良好な空間と時間分解能を提供する有用な技術であることが証明されているが、光励起の基本プロセスは、実験的に、いくつかの制約がengendersアプリケーション。光による励起、自家蛍光、光退色、及び光毒性の性質上避けられない結果的に画像化することができる構造の深さ、記録の期間だけでなく、記録のリアルタイムの継続を制限する、製造されています。つまり、録音は、多くの場合、これらの望ましくない副作用を回避するために、断続的に実行する必要があります。 なぜなら、これらの課題の、カルシウムイメージングのさらなる代替的な方法が開発されています。最も有望な方法の一つは、カルシウムが結合した後、酵素反応によって生成される光に依存している生物発光イメージングです。 Bioluminescenトンイメージングは​​、光励起を必要とせず、その結果、従来のカルシウムイメージングと同じ問題が発生しません。生物発光レポーターイクオリン- オワンクラゲから分離し、λ（、GFPはまたisolated-たのと同じクラゲは、その3 EFハンド構造を経由して、カルシウムを結合し、その補因子セレンテラジンの酸化と青色光の放出をもたらす、構造変化を起こします= 469 nm）の2,3。エクオリンは、それが非常に少ないバックグラウンドノイズを生成し、細胞内カルシウム緩衝系4と干渉しないため、カルシウムトランジェントを監視することが理想的カルシウム（K dを = 10μM）に対して非常に低い親和性を有します。エクオリンは、以前にアフリカツメガエルの卵5の神経誘導の過程をモニターするために使用されてきたが生成された光は、ニューロンの活動のリアルタイムイメージングのために使用するにはあまりに暗いです。この課題、フィリップのBr＆に対処するための努力の中で＃251;てみましょうと、パスツール研究所の同僚はクラゲ4内の天然の状態を模倣する、GFPおよびエクオリン遺伝子を融合遺伝子構築物を作成しました。この融合遺伝子産物は、GFPに非放射エネルギーを転送セレンテラジンの酸化につながる構造変化を起こし、エクオリンの3 EFハンド構造を介して再びカルシウムをバインドします。代わりに、エクオリンからの青色光のGFPからの緑色光（λ= 509 nm）でのリリースでは、このエネルギー移動の結果、。 GFPとエクオリンの融合はまた、単独の4イクオリンよりも19〜65倍明るい融合タンパク質の生産の光を助けるより大きなタンパク質の安定性を付与します。脳内の生物発光のアプローチを使用すると、連続記録の期間および記録することができる脳内の構造体の数の点では両方のカルシウムイメージングの現在の実験のアプリケーションを拡張します。大まか前作の文脈では、両方のグローバルと大きいことを意味します脳の地域化「活性」の様々な（カルシウム過渡応答のプロキシを介して）監視することができます。さらに重要な活動は容易に脳における基底関数の完全な理解の追求に役立つリアルタイムかつ継続的に、より長くのために監視することができます。 ここ数年では、私たちの研究室などがバイナリ発現系の制御下でGFP-エクオリン（GAL4 / UAS-GFP-エクオリン）5,6を発現するトランスジェニックハエを開発しました。私たちは、このような香り7,8と同様に、直接ニコチンアプリケーション9によりアセチルコリン受容体刺激後のキノコ体中のCa 2+ -活性を調節する細胞成分を研究などの自然の刺激によって生産活動を記録するために、GFP-エクオリン生物発光を使用しています。また、我々はまた、長期のような以前に対処することができていない実験的な質問の数に対処するために、GFP-エクオリンを使用していました自発的カルシウムトランジェントと深い脳構造の視覚化10の撮像 。最近では、我々は、投射ニューロン（PNS）で、哺乳類のATP受容体P2X 2 11陽イオンチャネルを発現することがGAL4 / UASシステムを使用し、キノコ体（MB247-のLexA中のGFP-エクオリンを表現するのLexAシステムを使用していました13XLexAop2-IVS-G5A-BP）（B.ファイファー、Janeliaファーム、米国）の礼儀。これは、私たちは、このような匂い刺激に対する応答として、より自然条件を模倣し、今度はキノコ体（PNSの下流の標的）を活性化ATPの適用により手形債権を活性化することができました。全体的にこのP2X 2を組み合わせた技術およびGFP-エクオリンは、実験の可能性を拡張します。広義には、活動の基礎パターニングを変更することができますどのように異なる刺激と摂動についての新しい研究を開始し、より良い脳の活動のパターンを理解する機会を提供しています。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1023911000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>prolabo</td><td>26 764.298</td><td>normapur</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>prolabo</td><td>25 108.295</td><td>normapur</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>ニコチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>アデノシン 5&prime;-三リン酸二ナトリウム塩水和</td></tr><tr><td>物 ベンジル-セレンテラジン</td><td>Prolume, ナノライト&nbsp;</td><td>猫#301セレンテラジンh</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.prolume.com/ 歯科用接着剤</td><td>3M ESPE&trade;</td><td>46954</td><td>Protemp IV</td></tr><tr><td>シリコン接着剤</td><td>3M ESPE&trade;</td><td>36958</td><td>エクスプレス2レギュラーボディクイック</td></tr><tr><td>テープ</td><td>3Mスコッチ</td><td>122s</td><td>3Mスコッチマジックテープ</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>4868</td><td>100-1,000 &micro;l Univesal ピペットチップ</td></tr><tr><td>チャンバーとホルダー (ステージ)</td><td></td><td></td><td>手作り</td></tr><tr><td>インキュベーションボックス</td><td></td><td></td><td>手作り</td></tr><tr><td>鉗子 (No. 5)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td>マイクロ解剖鉗子</td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>マイクロ解剖鉗子</td></tr><tr><td>接着剤アプリケーター&nbsp;</td><td></td><td></td><td>手作り&nbsp;</td></tr><tr><td>ナイフ</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td>5 mm 深さ 15°;</td></tr><tr><td>EM-CCDカメラを刺す&nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td>iXon(-80°Cに冷却;C)</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse-E800</td></tr><tr><td>液浸対物レンズ</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X Fluor .5w</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>蛍光 Leica MZ Fl III</td><td></td><td>ライカ 解剖スコープと蛍光灯</td></tr><tr><td>タイト ダークボックス</td><td>Science Wares</td><td></td><td>カスタムメイド Science Wares</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ&nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>Minipuls 2</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>厚さによって異なります</td><td>タイゴン R3603、サンゴバン</td></tr><tr><td>灌流システム</td><td>ワーナー</td><td>64-0135 &nbsp;(VC-66CS)</td><td>灌流バルブ制御システム、コンプリート、ピンチバルブ付き、6チャンネル</td></tr><tr><td>灌流レギュレータ</td><td>Leventon</td><td>201108</td><td>Dosi-flow 3</td></tr><tr><td>測定および自動化エクスプローラ</td><td>Sciences Wares &ナショナルインスツルメンツ</td><td>N/A</td><td>フォト</td></tr><tr><td>ンイメージャ http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 ソフトウェア&nbsp;</td><td>サイエンスウェア &ナショナルインスツルメンツ</td><td>N/A</td><td>フォト</td></tr><tr><td>ンビューア</td><td>Science Wares & http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 ソフトウェアNational Instuments</td><td>N/A</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>ソフトウェア https://www.microsoft.com</td></tr><tr><td>バーチャルダブ</td><td>オープンアクセス&nbsp;</td><td>N/A</td><td>ソフトウェア</td></tr> <tr><td>http://virtualdub.sourceforge.net/ UAS-GA2</td><td>Martin et al., 2007, Ref. 1&nbsp;</td><td>N/A</td><td>No stocks {現在}公開されています&nbsp;</td></tr><tr><td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&nbsp;&nbsp;</td><td>B.ファイファー、ジャネリアファーム、アッシュバーンUSA。</td><td>(STOCK #1117340)</td><td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td></tr><tr><td>P2X2</td><td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&nbsp;</td><td>N/A</td><td>No stocks {現在}公開されています&nbsp;</td></tr><tr><td>OK107</td><td>ブルーミントン ストックセンター</td><td>854</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td></tr></tbody></table>

生物発光カルシウムインジケーター、gfpエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

in vivoイメージングにおける機能は、脳細胞や興味の構造の機能と生理学を研究するための強力なアプローチとなっています。最近、生物発光レポーターGFP-エクオリン（GA）を用いて、-imaging の Ca 2+新しい方法が開発されました。その補因子セレンテラジンを添加した - - 光子コレクタを介して監視することができ、明るい光を発するこの新しい技術は、カルシウムと結合することができる分子を産生する、GFPおよびエクオリン遺伝子の融合に依存しています。 GFP-エクオリン遺伝子を有するトランスジェニック系統は、マウスやショウジョウバエの両方のために生成されている。 ショウジョウバエでは、GFP-エクオリン遺伝子は、脳内の標的発現とイメージングを可能にするGAL4 / UASバイナリ発現系の制御下に置かれています。この方法は、その後に検出することが可能であることが示されている両方のCa 2+内側に-transientsとCa 2+が内部店から-released。最も重要なことは、連続記録でより長い期間を可能にする脳内の大きい深さでのイメージング、および（8.3ミリ秒まで）高時間分解能での記録。ここでは、キノコ体の中にハエの脳内の学習と記憶の中心構造をの Ca 2+ -活性を記録し、分析するために生物発光イメージングを使用するための基本的な方法を提示します。

エクオリンへのGFPの融合は、私たちは顕微鏡（ 図3A、4A、6A、6E）に蛍光モードでGFPの励起されて前の生物発光イメージングに興味のある私たちの地域を可視化することができます。キノコ体を刺激する最も簡単な方法の一つは、イオンチャネル型ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化によるものです。アセチルコリンは、この受容体の内因性リガンドであるが、我々はニコチンがキノコ体でより再現性の応答を生成することを見出しました。それらは、特にニコチン性アセチルコリン受容体を発現し、したがって、ニコチンを使用することによって、我々は、脳の他の場所で表さムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化を回避することができるので、これは一部にはあります。また、ニコチンは、アセチルコリンよりも安定であるため、より良く、より信頼性の高い刺激制御を可能にします。典型的な応答は、萼、細胞体（CCB）と内側ローブ（ML）の両方の高速起動を開始します （図4を参照してくださいラベルされた画像のためのA）。一般的にCCB応答が長く続くと、応答（ 図3C-H）<...

ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

生物発光イメージングの全体的な目標は、活性の代理である生体内の機能性カルシウム一過性を、より長期間、および脳深部構造でイメージングすることです。この方法は、睡眠中のハエの脳の基礎活動がどのように見えるかなど、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、レーザーを使用した励起を必要としないことです。これにより、従来のカルシウムイメージングと比較して、組織のより深いところまで一過性のカルシウムを、光退色や毒性なしに長期間イメージングすることができます。この方法は、ショウジョウバエの脳基礎活動に関する洞察を得ることができ、マウスなどの他のモデル生物にも使用できます。まず、目的のショウジョウバエメラノガスターラインと、付属のテキストプロトコルに記載されている実験溶液を準備します。次に、単一のショウジョウバエを氷の上のガラスバイアルに2分間移すことにより、氷麻酔をかけます。次に、フライを冷やしたペトリ皿に移し、一対の鉗子を使用して、先端が約35度の角度になるようにトリミングされた1000マイクロリットルのピペットチップ内にフライをそっと置きます。ブラシを使用して、頭が先端の端を完全に超え、背側領域が部分的に露出するように、各フライをそっと押して位置合わせします。次に、準備した歯科用接着剤をヘッドからピペットの先端に塗布します。頭頂部を避けるように細心の注意を払ってください。ヘッドを正しい位置に固定することは、解剖とイメージングを成功させるために不可欠であるため、ヘッドの接着は非常に重要です。さらに、接着が不十分な場合、リンガー溶液の漏れやイメージング前のサンプルの死につながります。次に、フライを取り付けたピペットチップを録音チャンバーの穴に通し、軽く押して所定の位置に固定します。次に、準備したシリコン接着剤を使用して、漏れを防ぐために、チャンバーの平らな面をピペットチップと接触する場所に固定します。プロフュージョンチャネル、短辺、およびチャンバーの背面まで伸びるタップを取り付けます。次に、フライのあるチャンバーを顕微鏡の下に置き、蛍光灯をオンにします。次に、1ミリリットルのリンガー溶液をチャンバーにピペットで入れます。細い外科用ナイフを使用して、ハエの後頭部から両側の前部まで平行に切開します。次に、目の端に沿って切り込み、前の切開部を接続するアンテナの上に垂直な切開を行います。後頭部で最終的な切開を行い、次に細くて鋭い鉗子を使用してキューティクルを取り除きます。露出した呼吸器組織をそっとつかみ、脳と蛍光を発するキノコの体がはっきりと視覚化されるまで取り除きます。次に、超鋭利な鉗子を使用して、脳を覆っている神経上皮組織を慎重につかんでつまんで取り除き、セレンテラジンの浸透を可能にします。ピペットを使用して、組織を1ミリリットルのリンガー溶液で2回洗浄して、解剖から残った破片を取り除き、サンプルを暗いボックスに入れます。次に、5マイクロモルのベンジル-セレンテラジンを含む1ミリリットルのリンガー溶液をチャンバーにピペットで移します。ボックスを閉じ、サンプルを室温で最低2時間インキュベートします。まず、コンピューターの顕微鏡の電源を入れます。また、カメラをマイナス80°Cに冷却します。次に、排水システムを設定し、環境制御を摂氏20度に調整します。次に、フォトンイメージャーを開き、新しいフォルダーを作成して、最初の記録に名前を付けます。次に、塩化カリウム、ニコチン、リンガー溶液をそれぞれのリザーバーに追加して、増殖システムを設定します。各溶液が毎分2ミリリットルで排出されるように流量を調整します。次に、サンプルを顕微鏡下のマウントに置き、倍率を5倍に調整します。次に、穿刺を通してプロフュージョンチューブをチャネルに挿入します。顕微鏡を蛍光モードに設定し、キノコの体を中心に合わせます。キノコ本体にピントが合ったら、倍率を20倍に変更します。画像の中央に再度配置し、ピントを調整します。次に、排水装置を排水プールの上に置き、先端が排水プールのすぐ上に来るように、排水シャントの高さを調整します。次に、サンプルをリンガー溶液で30秒間洗い流し、適切なドレナージを確認します。最後に、シールドを引き下げて、装置を外部光から遮断します。フォトンイメージャープログラムの自動化システムを使用して、ピントを微調整し、キノコ体の参照蛍光画像を撮影します。フォトン速度を目的の記録速度(50ミリ秒ごとに1つの画像から1秒に1つ、またはそれ以上)に調整します。次に、フォトンモードを選択し、シャッターを開きます。次に、ログエントリに遺伝子型、性別、年齢、サンプル番号を入力します。がく、細胞体、および内側葉上の関心領域ボックスの位置を調整するには、ボックスをクリックし、制御を保持しながら所定の位置にドラッグします。次に、ベースライン値を約 5 分から 10 分間記録します。次に、スイッチを入れてニコチンの流れを開始します。同時に、Enterキーを押して、ニコチンの流れが始まったことを示すメモを追加します。1 分後にフローを停止し、フローが停止したことを示す別のメモをログに記録します。次に、サンプルをリンガー溶液で5分間洗浄します。サンプルが回復するまで、洗浄をオフにし、タイマーをさらに5分間セットし、塩化カリウムの流れを開始する準備をします。開始する準備ができたら、塩化カリウムの流れを開始し、サンプルログに「100ミリモルの塩化カリウム開始」を入力します。1分後、流れを止め、塩化カリウムを「シャットオフ」とサンプルログに入れます。次に、サンプルをリンガー溶液で1分間洗浄し、顕微鏡を蛍光モードに切り替えます。最終的な蛍光画像を撮影し、リンガー溶液をオフにしてサンプルを取り出します。解析プログラムで、最初のファイルを開き、[表示コントロール]タブを選択して、[ROI]をクリックします。次に、コントロールを押したまま、関心のある領域を選択します。次に、ROIのサイズ、向き、形状を調整して、GFPで照らされたがくと細胞体、および内側葉を囲みます。関心のある領域をすべて追加したら、ムービー」タブを選択してフォトンビデオを再生します。必要に応じて、2 番目の幅と 2 番目のステップを調整します。次に、必要に応じて ROI の配置を再調整して、ビデオのアクティブ領域内に留まるようにします。GFP蛍光、ニコチン応答、および塩化カリウム応答の代表的なスクリーンショットをいくつか選択してください。次に、スクリーンショットを切り抜き、代表的な画像をプレゼンテーションスライドに貼り付けて、後で分析および比較します。2番目の幅と2番目のステップの両方を秒単位の録音速度に調整します。また、トップパネルの灰色のマーカーを括弧で囲まれた領域、刺激開始前、および応答終了直後に移動して、解析の長さを選択します。次に、再生中に「ビューを一時停止」を選択し、巻き戻しボタンを押してビデオの再生を最初にリセットし、次に再生ボタンを押します。次に、タブカウントレートチャートを選択します」単位を調整し、関心のある領域の色や必要に応じて線の色も調整します。分析が終了したら、カウント率データのエクスポートを選択します。次に、萼と細胞体の組み合わせた記録、および両側の内側葉領域からの記録を選択し、それらの画像を応答画像とともにスライドに貼り付けます。キノコの体を刺激する最も簡単な方法の1つは、イオノトロピックニコチン性アセチルコリン受容体の活性化です。ここに示されている25マイクロモルのニコチンに対する典型的な反応は、萼と細胞体の両方、および内側葉の迅速な活性化から始まり、カルシウムに結合して発光する融合GFP-イクオリンコンストラクトを使用します。一般に、萼および細胞体における応答は、応答の逐次パネルに示されているように、葉よりも長く持続し、より大きな生物発光応答を示す。ニコチン性活性化に対する生物発光応答の経時的な記録例は、このグラフで説明されており、萼と細胞体を含む関心領域の光子の数が黒でグラフ化され、内側葉領域内の光子の数が赤で示されています。このグラフから、応答の長さ、応答中のピーク光子値、および各曲線の下の総面積をすべて決定できます。習得すると、準備段階はハエの数にもよりますが、インキュベーションのわずか2時間前で完了します。さらに、各録音は、適切に実行されれば、わずか20分で完了することができます。この手順を試みる際には、サンプル間の再現性を確保するために、フライストックを適切に老化させ、保管することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、構造物の活動が特定の動作にどのような影響を与えるかなど、追加の質問に答えるために、さらに行動テストを実行できます。この技術の開発により、神経生物学の研究者は、ショウジョウバエの脳の長期的な神経活動を探求する道が開かれました。このビデオを見れば、ハエの脳内での生物発光イメージング用のサンプル調製方法について十分に理解できるはずです。ニコチンは健康に害を及ぼす可能性があることを忘れないでください。この手順から溶液を準備したり、クリーンアップしたりするときは、手袋などの予防措置を講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

神経回路網の開発の自発的な活動は、カルシウム感受性インジケータ染料のAM...

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このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/53705/in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent'&gt;ラーク、A. R.、 et. al., 生物発光カルシウム指標GFP-aequorinに基づく生体内機能脳イメージングアプローチ。 J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、緑色蛍光タンパク質-イクオリン生物発光を使用したカルシウムダイナミクスのリアルタイムイメージングを示しています。 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエの脳構造におけるカルシウム過渡現象の研究のための生物発光イメージング

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Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

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細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

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Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

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Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

このプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリー記録の実装と実行方法、カルシウムに依存しないアーティファクトの修正方法、およびデュアルカラーフォトメトリイメージングに関する重要な考慮事項について詳しく説明します。...

自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー

このプロトコルは、麻酔薬を使用したマウスの近くの血管から脳を包み込む周囲細胞からの蛍光カルシウム画像と血流データを取得して分析するステップを提示する。これらの技術は、壁画細胞生理学の研究に有用であり、任意の細胞型のカルシウム過渡症を調査するために適応することができる。...

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筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

ここでは、共焦点顕微鏡を用いて、GCaMPカルシウム指標を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの脳領域における神経活動を調べるための詳細なプロトコルを紹介します。...

インビボ 部分的に拘束されたゼブラフィッシュ幼魚における感覚刺激により誘発される神経活動の共焦点蛍光イメージング

学ぶGFPエクオリンを用いた生体内バイオルミネセンスカルシウムイメージング法。Drosophila melanogasterの深部脳構造における長期間の神経活動可視化が可能で、従来法の光漂白や毒性を回避し、睡眠中の脳活動解析に有用です。

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

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