サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

この手順の全体的な目標は、液体真空界面での分析用システムと飛行時間型二次イオン質量分析を使用して、水溶液中に吸着したタンパク質膜を特徴づけることです。この方法は、生体分子と生体界面に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、固体表面での吸着タンパク質の特性評価などです。

この技術の主な利点は、生体分子を液体環境内でその場で開始し、分子マッピングと組み合わせて開始できることです。この方法は、固液界面の生体分子に関する洞察を得ることができますが、単一のがん細胞、薬物相互作用、バイオフィルムの付着の研究など、他のシステムにも適用できます。5ミリリットルの注射器に、70%エタノール溶液を2ミリリットル引き出します。

シリンジをSALVIデバイスの入口端に接続し、10分間かけて1ミリリットルの液体をゆっくりと注入します。注入の最後に、シリンジを取り外し、ポリエーテル-エーテル-ケトンユニオンを使用してSALVIの入口と出口を接続します。SALVIマイクロチャネルを70%エタノール溶液で満たし、室温で4時間保持します。

次に、2 番目のシリンジに滅菌脱イオン水を入れます。それをSALVIの入口に接続し、脱イオン水を10分間かけてゆっくりと装置に注入します。シリンジを取り外し、デバイスの入口と出口を再接続します。

タンパク質膜を固定化するためには、まず2ミリリットルのフィブロネクチン溶液を注射器に引き込みます。シリンジをSALVIデバイスの入口に接続し、10分間かけて1ミリリットルの液体をゆっくりと注入します。次に、シリンジを取り外し、インレットとアウトレットを再度接続します。

セットアップを清潔な培養皿で室温で12時間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルの滅菌脱イオン水を10分間ゆっくりと注入し、入口を出口に再接続します。まず、ToF-SIMSステージを平らで清潔な面に置きます。

シリコンウェーハと窒化ケイ素膜を上に向けて、SALVIデバイスをステージに置きます。4つの金属クランプピースを使用してSALVIデバイスをステージに固定し、デバイスの角を固定している金属ピースを4本のネジで金属プレートにねじ込みます。次に、マイクロ流体チャネルに接続されたPFTEチューブをゆっくりと巻き上げます。

4つの金属片と4つのネジを使用して、硬い部分を押さえます。分析中に一次イオンビームに干渉しないように、デバイスがステージ上のオープンスペースに配置されていることを確認してください。次に、ファラデーカップをネジでステージに取り付けます。

次に、ToF-SIMSロードロックドアを開き、ステージを荷台に水平にセットしてからドアを閉めます。真空ポンプをオンにし、ロードロックチャンバーを約10からマイナス6ミリバールまでポンプダウンさせます。その後、約30分後、真空度が安定したら、SALVI装置をメインチャンバーに移します。

ToF-SIMSの一次イオンビームと分析装置を調整し、メーカー推奨のプロトコルに従って約400ナノメートルの空間分解能を獲得します。次に、光学顕微鏡を使用してマイクロ流体チャネルを見つけます。光学像の中心を基準として使用し、二次イオン像の中心と一致するように位置合わせします。

このステップを視覚的に示せることは、サンプルが通常の固体サンプルよりも厚く、チャンネルの最適な焦点を見つけるための設定を調整するのが難しいため、習得が難しいため、非常に重要です。各測定の前に、1キロ電子ボルトの酸素ビームを使用して窒化ケイ素ウィンドウを約15秒間スキャンし、表面の汚染を除去します。また、電子フラッドガンを使用して、すべての測定中に表面の帯電を補償します。

次に、データ取得を開始する前に、ポジティブモードまたはネガティブモードを選択します。すべての測定で、25キロ電子ボルトのビスマス3プラスを一次イオンビームとして使用します。深さプロファイリングでは、直径約2マイクロメートルの丸い領域で一次イオンビームを32ピクセル×32ピクセルの解像度でスキャンします。

窒化ケイ素膜を貫通するのに必要な時間を最小限に抑えるには、パルス幅の長い一次イオンビームを使用します。窒化ケイ素膜をパンチスルーした後、同じ電流を約200秒間保持して、2次元画像再構成に十分なデータを取得します。データ収集では、パルス幅を80ナノ秒に縮小して、より優れた質量分解能でスペクトルを取得します。

この取得をさらに約 200 秒間続けます。SALVIマイクロ流体界面を使用して、一次イオンビームは水和したフィブロネクチン膜に直接照射できます。ToF-SIMSの質量分析データには、いくつかの水クラスターとアミノ酸断片が示されています。

これは、水和タンパク質分子の周囲および内部の水分子の特性の直接的な証拠を提供します。ここでは、水和フィブロネクチン膜と脱イオン水の深さプロファイル時系列を見ることができます。選択された第2イオンの強度は、窒化ケイ素膜が打ち抜かれる前は無視できます。

窒化ケイ素膜が打ち抜かれると、二次イオンの強度は大幅に増加します。ショートパルス幅プロセスは、画像およびスペクトル再構成のためのより優れた質量分解能のデータを取得するために使用されます。水和したフィブロネクチンフィルムと脱イオン水からの2D画像は、サンプルから選択された二次イオンの数を表しています。

画像が明るいほど、二次イオンの数が多くなります。これらの直感的な画像により、異なるサンプル間で選択した二次イオンを明確に比較できるため、データ解析に役立ちます。この手順を試みる際には、マイクロリアクターを真空チャンバーに設置する前に漏れがない必要があることを覚えておくことが重要です。

この技術は、生物学やバイオインターフェースの分野の研究者が、タンパク質の吸着、バイオフィルムの付着、表面集合単分子膜、その他多くの現象を探求する道を開きました。このビデオを見れば、SALVIと液体ToF-SIMSを使用したさまざまな液体サンプルの研究方法について十分に理解できるはずです。