Name: 新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、線虫（Caenorhabditis elegans） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶCaenorhabditis elegansの胚伸長における形態形成欠損のモニタリング方法。タイムラプス顕微鏡を用いて早期・後期伸長を制御する遺伝子を同定し、前後軸での形態形成過程を解析する技術を解説します。

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この作業は、カナダの自然科学工学研究評議会（NSERC）およびカナダイノベーション財団からの助成金によって支援されました。博士Paul Mains氏(カルガリー大学、カルガリー、カナダ)のlet-502(sb118ts)株に感謝します。一部の系統は、NIH研究インフラストラクチャープログラム局(P40 OD010440)が資金提供するCaenorhabditis Genetics Centerによって提供されました。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、胚性の伸びの初期および後期段階を特徴づけるために新たなメトリックを説明しました。 セクション1では、重要なステップは、パッド上の細菌の潜在的な存在です。胚は気密パッドと画像取得時のカバーガラスの間に封入されています。スライドを密閉する2時間以上持続取得中に動物の乾燥を避けるために必要とされます。我々の知る限りでは、スライドとカバーガラスの間にアガロースパッドを取り付けるために使用されるシーラーのいずれも通気性はありません。細菌（または胚）大量のパッド上に存在する場合その結果、それらは、それらの早期の死をもたらす、数時間後に酸素を奪われてもよいです。非伸長胚に比べて長さが3倍である胚に対応 - - 3倍の胚有するもの胚はtheiに移動を停止しますので、興味のある胚と一緒に記録することは、潜在的な低酸素状態の良い指標になります酸素の非存在下で卵殻をrは。形態学的測定は、低酸素状態にか死ん胚で行われるべきではありません。 タイムラプスイメージングを使用する別の重要なステップは、胚の発達が生じる温度です。感熱性...

その短いライフサイクル：ほぼ50年間、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）が開発、神経生物学、進化、宿主-病原体相互作用などで重要な問題を研究するための強力なモデルとしての地位を確立して1開発の研究では、このモデルの強さはです3日;これらの動物は、遺伝的に改変することができる容易さ。ほとんどが子宮外で生きている動物とその開発における細胞の変位と形態の観察を可能にするその透明。線虫の発達段階は、成人期に続いて、胚形成および4幼虫期（L4へL1）を伴います。胚発生時には、表皮の形態形成は、細胞が、彼らは彼らの接合部を再編成し、それらの個々の形態だけでなく、機能性上皮内での相対的位置を変更する方法を、グループとして移動する方法上皮のより良い理解を可能にする能力についてかなりの注目を集めました。表皮の形態形成は4段階に分かれています。背側表皮細胞の再編成からなる背インターカレーションは、皮下組織と呼ばれます。このように、上皮細胞単層における胚を包む腹側正中線に向かって腹側皮下細胞の遊走になる腹側筐体;初期および後期の伸び虫様幼虫に豆の形胚を変換します。以下の形態形成、胚のハッチとL1幼虫は、その直接の環境で利用可能な細菌を使用して供給し始めます。 胚性の伸びは、したがって、胚発生の後期です。これは、その長手方向軸に沿って胚の伸長と横直径の減少から成ります。これは、皮下細胞の形状の劇的な変更を伴います。伸びが初期および後期段階に分割されています。体壁の筋肉がワットで1.75倍の段階で、収縮開始時に初期の段階ではコンマ段階で開始し、終了しますILD型（wt）胚-非伸長胚と比較して、長さの1.75倍である胚に対応します。その段階で生じる形態形成のプロセスは、主に胚2の前後軸に沿ってその伸びを駆動皮下細胞の先端極に位置するフィラメント状アクチン束（FBS）の収縮によって駆動されます。政府短期の収縮は3キナーゼLET-502 / ROCK、MRCK-1とPAK-1 5によるミオシン軽鎖のリン酸化による制御です。体壁の筋肉が機能するようになると契約を起動したときに、伸びの後期相は、開始されます。これは、背側と腹側の皮下細胞に体壁の筋肉からメカノシグナリングを含み、動物が3を孵化たときに終了します。 伸び欠陥は、一般的に胚のように死んで動物の割合（胚致死性; EMB）を特徴とし、L1幼虫（幼虫逮捕表現型として、その発症を阻止するもの、左心室a）および重量よりも大幅に短くなる。発育停止の段階の同定は、死んだ胚の顕微鏡観察を必要とし、幼虫3-6を逮捕しました 。 最近、このようないくつかのCdc42 / RacのレギュレータとエフェクターPIX-1などの遺伝子、及びPAK-1は、両方の初期および後期伸び3,7の間に形態形成のプロセスを制御することが示されました。また、最近、形態形成のプロセスは早期に伸び、3〜7の間の胚の前後軸に沿って異なることを示しました。これらの知見は、特に初期の伸びの間にそれらの前後軸に沿った胚の形態の特徴付けを可能にする初期または後期の伸長段階およびその他のメトリックをターゲットに新たな評価指標の開発の動機。 これらの新規な方法は、それらの幅ならびに開始時および初期の伸長の終了時に、胚の長さを測定することからなる、彼広告や尾。7 2つのプロトコルはまた、L1ステージ7で同期、新たに孵化した幼虫の長さを測定するために開発されました。 幼虫、成虫および培養培地中に存在する細菌を処理することによって溶解させながら、胚の卵殻は、アルカリ性の次亜塩素酸処理に対してそれらを保護します。この処理は、次に、よく供給成人8の大部分を含む非同期集団から胚を精製するために使用されます。食事制限は、新たに孵化した幼虫を同期させるために使用されます。これらの幼虫の長さを測定し、次いで伸長欠陥を検出するために使用されます。孵化幼虫は、非完全に伸長した胚は、給紙時に「通常の長さ」に回復することができますが、食品の非存在下での逮捕時に彼らの小型化を維持するため、この測定は、培養プレート上で逮捕幼虫の測定よりも好ましいです。 ここでは、ルの測定を可能にする詳細なプロトコルを提示しますタイムラプスDIC顕微鏡と画像解析（プロトコル1）を使用して、胚だけでなく、自分の頭と尾の幅を長くするngth。我々はまた、画像解析（プロトコル2）およびフローサイトメトリー（プロトコル3）を使用して同期幼虫の長さを測定するための詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>寒天&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (塩化カルシウム)</td><td>バイオベーシック株式会社</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液&nbsp;</td><td>ユニオン バイオメトリカ</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>高蛍光制御粒子</td><td>ユニオン バイオメトリカ</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (リン酸カリウム、二塩基性)</td><td>バイオベーシック株式会社</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (リン酸カリウム、一塩基性)</td><td>バイオベーシック</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4(硫酸マグネシウム)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(リン酸ナトリウム、二塩基性)</td><td>バイオベーシック株式会社</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl(塩化ナトリウム)</td><td>バイオベーシック(株)</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>ペベオデッサンガム45&nbsp;ml</td><td>p&eacute;b&eacute;o</td><td>アート/クラフトストア</td><td>PDG033000</td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>バイオショップ</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>シースバッファー</td><td>ユニオン バイオメトリクス</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPASバイオソート</td><td>ユニオン バイオメトリクス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

胚発生中の形態形成プロセスの変化を制御するシグナル伝達経路を解剖するには、堅牢で感度の高い指標が必要です。線虫Caenorhabditis elegansの胚の伸長は、その縦軸に沿った胚の伸長からなる後期発生段階です。この発生段階は、皮下細胞とその下にある体壁の筋肉との間の細胞間コミュニケーションによって制御されています。これらのシグナル伝達メカニズムは、細胞骨格と細胞間接合部をリモデリングすることにより、皮下細胞の形態を制御します。幼虫期の胚致死率と発生停止の測定、皮下細胞と筋肉細胞の細胞骨格と細胞間接着構造の変化は、これらのシグナル伝達経路を解剖するために25年以上にわたって使用されてきた古典的な表現型です。最近の研究では、早期または後期の伸長を特に対象とし、胚の前後軸に沿った形態形成欠損を特徴付ける新しい指標の開発が必要でした。ここでは、伸長する胚の長さと幅、および同期した幼虫の長さを正確に測定できる詳細なプロトコルを提供します。これらの方法は、伸長を制御する遺伝子を同定し、これらの遺伝子がこの段階の初期段階と後期の両方を制御し、胚の前後軸に沿って均等に必要とされるかどうかを評価するための有用なツールを構成します。

頭部、Tail-およびヘッド/テール幅比は、堅牢なメトリックです。 ここで説明するプロトコルは成功し、RhoのGTPアーゼPIX-1のレギュレーターおよびエフェクターの機能を特徴づけるPAK-1とlet-502を早期に伸び7時にす ​​るために使用されている。グアニン交換因子のそれぞれがpix-1とPAK-1コード（GEF）とのRac / Cdc42のGTPアーゼのための特異的なエフェクターとlet-502 RHO-1 7...

ここでは、線虫Caenorhabditis elegansの胚性伸長の初期および後期に発生する形態形成欠陥を監視するために特別に設計されたプロトコルについて詳しく説明します。最終的に、これらのプロトコルは、これらの相を調節する遺伝子を特定し、胚の前後軸に沿ったそれらの異なる要件を特徴付けるように設計されています。

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

一連の実験の目的は、線虫Caenorhabditis elegansの胚伸長期の初期および後期における発生上の欠陥を特定することです。この手法を用いることで、発生遺伝学分野における重要な問いに答えることができます。これにより、胚伸長と呼ばれるCaenorhabditis elegansの胚発生の後期段階を制御する遺伝子の特性評価が可能になります。これらの一連の手法の主な利点は、伸長の初期または後期段階を制御する遺伝子、および胚の前方または後方における形態形成プロセスを制御する遺伝子を特定できることです。本手順については、当研究室の元学生であるOlivier Rocheleau-Leclairと共に実演します。この手順では、Zスタックの時間経過顕微鏡観察のために、DICレンズ、プリズム、およびビデオキャプチャシステムが必要です。まず、スライドに固定したサンプルを観察位置に合わせます。準備の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。低倍率から開始し、形態形成前の段階にある胚を特定します。次に、オイルを1滴滴下し、より高倍率の対物レンズを使用します。ここで、記録を行う胚の最上点と最下点を特定し、Zスタックのパラメータを設定します。タイムラプス撮影は2分間隔に設定してください。画像の取得間は、必ずライトシャッターを閉じてください。初期伸長イベントの捕捉に必要な時間は、胚のステージによって1時間から8時間まで変動します。次に、画像取得プログラムを実行し、結果を保存します。次に、Fiji ImageJソフトウェアを使用して解析を行います。画像を読み込んだら、Hyperstack表示モードを選択してください。そこで、ルックアップテーブルのオートモードを適用し、明るさとコントラストを調整します。次に、「Analyze Set Measurements」に進み、パラメータを設定します。各胚について、胚の中心点の指標として適した咽頭に焦点を合わせるよう、Zスケールバーを設定してください。次に、特定の胚について、初期伸長期の開始時点に合わせてタイムスケールバーを調整します。この時間を記録してください。次に、Analyze Measureツールを使用して、正中線に沿って尾の先端から口まで線を書き、胚の長さを算出します。この長さを記録してください。次に、タイムポイントを初期伸長イベントの終了時に合わせ、再度長の測定を行います。これらの値を用いて、初期伸長の所要時間および初期伸長中の長さの増加量を算出します。幅の変化についても、直線ツールを用いて頭部の中心線に沿って線を引くことで測定可能です。ここは、一貫した測定を行うのに適した部位です。尾部の正中線でも同様に測定し、任意の時点における頭尾比を算出して、幅の変化をスコア付けします。本プロトコルのためには、大粒子フローに対応したフローサイトメーターを準備する必要があります。このような装置は、実質的に線虫ソーターとして機能します。起動前に、レーザーブロック、コンプレッサー、線虫ソーター、およびソフトウェアを立ち上げてください。ソフトウェアで「Start」を押し、「Argon Laser Control」を確認します。Runモードを選択し、レーザーの出力を10 milliwatts近くまでウォームアップさせた後、Doneを選択します。圧力が平衡状態になるまで、少なくとも15分間待ちます。次に、サンプルを調製します。まず、同期化した野生型L1を10 µL、時計皿に分注し、顕微鏡下で死卵の割合を推定します。推定値が20%を超える場合は、そのサンプルを使用しないでください。M9溶液中の同期化したL1約700 µLを15 mLチューブに移し、プロピジウムイオダイドを最終濃度10 µg/mLとなるように添加します。室温で30分間染色します。次に、システムを準備します。シースおよびサンプルのフローコントローラーを使用して、流量をそれぞれ5.1と5.51に調整することが不可欠です。圧力が安定したら、「Pressure Okay」ボックスをクリックします。次に、「Acquire」コマンドを使用し、チューブを指で軽く弾いて、サンプルカップと分析室の間のチャネルから気泡を除去します。これにより、最終的に「Acquisition Window」に気泡がないことが表示されます。これは実験においても極めて重要です。次に、蛍光測定およびTOF測定のパラメータを設定します。TOF、EXT、Green、Yellow、Redのスケールを256に設定してください。次に、記載通りにゲインを設定します。続いて、PMTコントロールをGreenとYellowはともに700に、Redは900に設定します。これで、ワームソーターのキャリブレーションを行います。汎用高蛍光コントロール粒子を20 millilitersサンプルカップに分注し、ソーターにセットします。ソフトウェアのToolsからRun Control Particlesを選択し、Acquireをクリックします。得られた変動係数が11以上であり、平均値が21±6であることを確認してください。そうでない場合は、「Clean」ボタンをクリックするか、フローチャネルをフリッキングして、チューブを洗浄してください。次に、「Tools」でコマンドのチェックを外して、「Control Particles」モードを終了します。プロピジウムヨードによる線虫の30分間の染色の後、染色した線虫に10 millilitersのM9を加え、混合します。室温で少なくとも15分間インキュベートします。次に、希釈液を5 mL取り、15 mLのM9が入ったサンプルカップに加えます。この希釈液をウォームソーターで解析します。「Acquire」ボタンを押し、流速を確認してください。良好なフロー（1秒あたり15〜25個の物体）を得るために、線虫の濃度を調整する必要があるかもしれません。物体の適切な濃度が達成されたら、最終濃度が溶液中で約0.5〜1xのコントロール粒子になるように、コントロール粒子をテストに添加します。次に、GatingメニューのGating Parameterを「TOF versus Green」に調整します。次に、ソーティングパラメータをTOF対Redに調整します。これにより、コントロール粒子を死細胞および生細胞から分級します。ここで、Acquireをクリックして実験を開始します。約10,000個のオブジェクト（動物数にして約8,000匹に相当）を解析します。その後、実験を停止し、「Store」をクリックして解析用のテキストファイルとしてデータを保存します。頭幅測定の堅牢性を検証するため、1.2倍期にある12個の野生型胚に対して、独立して5回の測定を行いました。Brown-Forsythe検定を適用した結果、データ間に分散の差は認められませんでした。頭幅測定における再現性とバッチ効果については、3日間にわたって4D DICイメージングを用いて検証しました。これら3つの測定群において、分散やバッチ効果は認められませんでした。野生型および変異体背景における停止した幼虫の長さを評価するために、記載された両方のプロトコルが用いられました。画像解析により、長さをマイクロメートル単位で絶対測定しました。本実験において、変異体は野生型よりも小型でした。フローサイトメトリーによる長さの測定でも同様の結果が得られました。しかし、これらの測定結果ははるかに頑健でした。したがって、この手法を用いることで、変異個体群におけるよりわずかな影響を明らかにできると考えられます。この手順を行う際は、解析する系統間で公正な比較を確実にするため、実験を通じて一定の流速を維持することが重要です。この手法を習得すれば、装置の初期校正を含めても、1日あたり18〜24の条件または変異系統の幼虫長の測定と特性解析が可能になります。本手順に従うことで、下皮細胞の形態を研究することができます。そのため、蛍光マーカーと共焦点顕微鏡を用いて、同定された遺伝子の分子機能を特性解析することができます。プロピジウムヨードは極めて危険である可能性があるため、本手順の実施中は、常に手袋や保護メガネの着用などの予防措置を講じてください。

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