細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

このグラジエントひずみチップの全体的な目標は、一連のひずみ条件下での細胞の挙動を調査するために、3Dハイドロゲル上に非連続的なグラジエント静的ひずみを生成するためのシンプルなアプローチを提供することです。この方法は、幹細胞の分化の刺激や人工組織器官の発達のための細胞アライメントの制御など、バイオエンジニアリング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞の挙動を比較するために、同じ微小環境下で細胞層とハイドロゲルにさまざまな菌株を適用できることです。

方法の視覚的なデモンストレーションは、高い細胞変動性を確保するために実験の基礎として光が3〜4時間で完了する必要があるため、チップ調製手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。10グラムのゼラチン粉末を計量し、100ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を入れたガラスフラスコに加えます。マグネティックスターバーをフラスコに入れ、フラスコを攪拌ホットプレートに置きます。

フラスコをアルミホイルで覆い、水分の蒸発を防ぎます。ホットプレートの温度を50〜60度に設定し、スターラーを100RPMで1時間設定してゼラチン粉末を溶解します。ゼラチンが溶解した後、ピペットを使用して8ミリリットルの無水メタクリル酸を非常にゆっくりと加えます。

摂氏60度で3時間反応させます。次に、予熱したDPBSをフラスコに加え、最終容量500ミリリットルにします。溶液を15分間よく混合して反応を止めます。

その間、透析膜を数本の25ミリメートルの長さのチューブに切断します。それらを脱イオン水に15分間浸します。そして、透析チューブの一端を閉じるために結び目を作ります。

適量のポリマー溶液を透析チューブに装填し、もう一方の端を閉じます。次に、充填したチューブを脱イオン水を入れた5リットルのプラスチックビーカーに1週間入れます。脱イオン水は1日2回更新し、透析中は溶液を摂氏40〜50度に維持します。

透析後、チューブから溶液を500ミリリットルのガラス瓶に集めます。約450〜500ミリリットルの溶液を500ミリリットルのフィルターカップに注ぎます。そして、真空を適用して、溶液をフィルター膜に強制的に通過させ、滅菌します。

次に、滅菌したポリマーを数本の50ミリリットルの滅菌チューブに移します。滅菌したポリマーを50ミリリットルの滅菌チューブ数本に移し、マイナス80°Cの冷凍庫で3〜5日間保存します。マイナス80°Cのポリマーを凍結乾燥機で1週間凍結乾燥させてGelMAを形成し、マイナス80°Cの冷凍庫で保存します。

チップ製造のためには、まずポリメタクリレートまたはPMMAを調製し、テキストプロトコルに記載されているように再生および成形する。次に、30グラムのPTMSエラストマーと3グラムのPTMS硬化剤を適切に混合して、PTMSカバーとPTMSプラグを準備します。真空チャンバー内で混合物を1時間脱気します。

混合物の1.8〜2グラムをPTMSカバー用のPMMA型に鋳造します。また、PTMS プラグの PMMA 金型の各キャビティを充填するために適切な量を使用します。さらに、10グラムの未硬化PTMS混合物をブランクの10センチメートルのプラスチックプレートにキャストします。

これらの金型を真空チャンバーに入れて30分間脱気します。PTMSを摂氏80度で2時間硬化させます。金型で硬化したPTMSを冷却した後、PTMSカバーとPTMSプラグをPMMA金型から取り外します。

次に、PTMSカバーの流路の端に直径約3ミリメートルの2つの穴を開けます。10cmのプラスチック板から成形したPTMSシートを、1cm×1cmの立方体に多数カットします。そして、各PTMSキューブに3ミリメートルの穴を開けます。

PTMSカバーの開口部に1cm×1cmの未硬化のPTMSキューブを2つ接着して、中程度のリザーバーとして機能し、勾配円形のヒドロゲルパターンの硬化プロセスを支援します。その後、摂氏80度で1時間硬化させます。次に、PTMSカバーと2つのPTMSリザーバーをTMSPMAコーティングスライドに接着します。

これを行うには、PTMSカバーの接着面とTMSPMAコーティングスライドを酸素プラズマ装置の下で90秒間酸素プラズマ処理します。PTMSカバーとTMSPMAスライドのプラズマ処理面に接触させ、それらを密接に押し付けて、シリコン酸素シリコンボンドの形成を通じて永久結合します。フォトマスクは、決められたレイアウトを透明フィルムに印刷して印刷します。

次に、印刷したフォトマスクを25ミリメートル×37.5ミリメートルのサイズにカットします。25ミリグラムの凍結乾燥GelMAを0.3ミリリットルの温めた細胞培養培地に秤量し、1.5ミリリットルの黒色微量遠心チューブに入れます。GelMAが培地に溶解するまで、微量遠心チューブを実験室の攪拌機ホットプレートに置きます。

微量遠心チューブ内の1ミリリットルのDPBSに50ミリグラムの光開始剤を加えます。そして、それを摂氏80度のオーブンに15分間、または光開始剤が溶解するまで置きます。25マイクロリットルの10%光開始剤をマイクロ遠心チューブに加えます。

よく混ぜるために数回ピペットで動かします。次に、自動セルカウンターを使用して300万個のNIH3T3細胞をカウントします。懸濁液を200Gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞を175マイクロリットルの細胞培養培地に再懸濁します。

細胞溶液を微量遠心チューブに加えて、5%GelMA、0.5%光開始剤、およびミリリットルあたり約600万個の3T3細胞のプレポリマー細胞溶液が得られます。100マイクロリットルの細胞プレポリマーを100マイクロリットルのマイクロシリンジに混合ロードした後。フォトマスクの一部を滅菌したグラジエントストレインチップの下部スライドに手動で位置合わせします。

そして、その間に少量の脱イオン水を使用して位置を固定するだけです。プレポリマーセル溶液を充填した100マイクロリットルのマイクロシリンジをチップの入口に接続します。次に、マイクロシリンジを使用して50マイクロリットルのプレポリマーセル溶液を流路に入れ、PTMSプラグを使用して出口を塞ぎます。

さらに40マイクロリットルの溶液を注入して、円形PTMSメンブレンに凸状の膨らみを作ります。フォトマスク、マイクロシリンジ、PTMSプラグを装着したチップをUVランプの下に移動します。そして、それを30〜45秒間さらして、流体チャンバー内の同心円状のヒドロゲルを架橋します。

架橋後、PTMSプラグとマイクロシリンジを取り外して液圧を解放します。予熱したDPBSを充填した1ミリリットルのシリンジを使用して、入口から出口まで洗い流して架橋されていない樹脂を3回洗い流します。次に、流路に約100マイクロリットルの細胞培養培地を充填します。

チップを滅菌した培養皿に入れ、摂氏37度の二酸化炭素5%雰囲気で1週間培養します。毎日ミディアムをリフレッシュしてください。対照群として4時間のインキュベーション後の0日目に3つのチップの画像を撮影します。

そして、3日目に3チップを実験セットとして、20倍の対物レンズを持つ顕微鏡を使用。ソフトウェアを使用して、ライン1からライン12までの各ハイドロゲルのライン幅を測定し、圧縮汚れを計算します。ここに示されているのは、0マイクロリットルと40マイクロリットルのオーバーインジェクション、UV架橋および4時間のインキュベーション後のハイドロゲルパターンの代表的な結果です。

非オーバーインジェクションコントロールの3Dハイドロゲルの線幅は、予想通り均一に見えます。しかし、40マイクロリットル以上の注入によるハイドロゲルパターンは、ハイドロゲルの勾配線幅をライン1からライン12に減少させます。3日間のインキュベーション後、ハイドロゲル内の細胞は異なる方向に伸びます。

ライン1の細胞は、ハイドロゲル伸長の刺激により半径方向に沿って整列します。それどころか、12行目の細胞は、形状の手がかりが細胞の整列を支配するヒドロゲル形状に沿って整列します。行 7 には、行 1 と行 12 の 2 つの細胞配置の手がかりが互いにバランスをとる特定の細胞配置はありません。

3Dハイドロゲル上のグラジエントひずみの微小環境を測定すると、適切に実行されれば、グラジエントひずみチップによって2時間で測定できます。この手順を試みる際には、細胞プレポリマー溶液をロードする前にグラジエント株チップを滅菌することを忘れないようにすることが重要です。また、チップを細胞培養インキュベーターに入れる前に、チップの表面を75%エタノールで完全に拭いてください。

このビデオを見た後、さまざまなひずみインペリアル下での細胞の挙動を調査するための勾配ひずみチップを生成する方法について非常によく理解しているはずです。