Name: 細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学ぶ、ひずみ勾配チップを用いて細胞を含んだハイドロゲルに静的ひずみを与え、細胞配向と行動を調べる方法。組織工学における幹細胞分化と人工組織開発の研究に応用できる。

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このプロジェクトで、大学院学生研究留学プログラム (NSC-101-2917-I-007-010); をサポートされていた生体医用工学プログラム (NSC-101-2221-E-007-032-MY3);国立ナノテクノロジー プログラム (NSC-101-2120-M-007-001-) は、中華民国、台湾の国立科学評議会。著者は、ハイドロゲルとセル封止技術を共有するため教授アリ Khademhosseini、Unal-Gulden Camci、タントラ文献に見ポールとハーバード大学医学部で Ronglih 遼を感謝したいです。

1. GelMA合成
<ol>
	<li>ゼラチン粉末10 gを秤量し、100 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を入れたガラスフラスコに加えます。マグネティックスターバーをフラスコに入れ、フラスコを攪拌ホットプレートに置きます。</li>
	<li>フラスコをアルミホイルで覆い、水分の蒸発を防ぎます。ホットプレートの温度を50〜60°Cに設定し、スターラーを100rpmで1時間設定して、ゼラチン粉末をよく溶解します。</li>
	<li>ゼラチンが溶解した後、ピペットを使用して8mLの無水メタクリル酸を非常にゆっくりと(1秒に1滴)加えます。60°Cで3時間反応させます。</li>
	<li>予熱したDPBS(40°C)をフラスコに最終容量500 mLまで加え、この混合物を15分間よく含ませて反応を停止させます。</li>
	<li>その間、透析膜(カットオフ分子量14kDa)を25cmの長さのチューブに数本カットします。それらを脱イオン(DI)水に15分間浸し、透析チューブの一方の端を閉じるための結び目を作ります。</li>
	<li>適量(30〜60mL)のポリマー溶液を透析チューブにロードし、もう一方の端を閉じます。それらをDI水を入れた5-Lプラスチックビーカーに1週間置きます。DI水を1日2回更新し、透析プロセス中は溶液を40〜50°Cに維持します。</li>
	<li>チューブから溶液を500mLのガラス瓶に集めます。500 mLのフィルターカップ(細孔径0.22 μm)に~450 - 500 mLの溶液を注ぎ、フィルターカップに真空を当てて溶液をフィルター膜に通して滅菌します。</li>
	<li>滅菌したポリマーを数本の50mL滅菌チューブに移し、-80°Cの冷凍庫で3〜5日間保存します。</li>
	<li>凍結乾燥機を使用して-80°Cポリマーを1週間凍結乾燥し、GelMAを形成します。GelMAは-80°Cの冷凍庫で保存してください。</li>
</ol>
2. 3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)修飾
<ol>
	<li> 市販のスライドガラスを2つの小片(25 mm x 37.5 mm)に切断し、0.5 M NaOH溶液に4時間浸漬し、スライドを大量のDI水で洗浄します。</li>
	<li>スライドを95%エタノールの入ったガラス容器内のラックに置き、超音波装置を使用して43kHzで15分間洗浄します。</li>
	<li>スライドガラスを99.5%エタノール中の5%TMSPMAに1時間浸します。</li>
	<li>スライドを95%エタノールで洗浄し、スライドを風乾し、TMSPMAコーティングを80°Cのオーブンで2時間アニールします。</li>
</ol>
3. チップ製造
<ol>
	<li>厚さ 2 mm のポリメタクリレート (PMMA) プレート 1 枚と 0.3 mm のポリメチルメタクリレート (PMMA) プレートを 1 枚取り、PMMA 表面の片側に両面テープを貼り、片側のライナーをはがします。厚さ2mmのPMMAプレート2枚と、両面テープを巻かずに1mm厚のプレート1枚を残します。</li>
	<li>両面テープを使わずに厚さ2mmのPMMAプレートを42mm×30mmにレーザーカットして底板を製作します。厚さ2mmのPMMAプレートを両面テープでカットし、外形寸法42mm×30mm、内寸37.5mm×25mmの境界枠を作ります。</li>
	<li>厚さ0.3mmのPMMAプレートを両面テープでレーザーカットし、円の反対側に幅2mm、長さ8mmの流路が2つある12mmの中央円にレーザーカットします(図1a)。</li>
	<li>PDMSカバーを鋳造するためのPMMAモールドを準備するには、ステップ3.2-3.3のPMMAコンポーネントの3つ（図1b）)を両面テープで組み立てます。</li>
	<li>厚さ2 mmのPMMAプレートと両面テープをレーザーカットして、8.5 mm x 8.5 mmの中空長方形を3 x 3配列にした5 cm x 5 cmのピースにレーザーカットします。さらに5 cm x 5 cmのピースを、4 mmの中空円を3 x 3配列でカットします。厚さ1mmのPMMAプレートを両面テープなしでレーザーカットし、5cm×5cmのPMMAボトムプレートにレーザーカットします。</li>
	<li>ステップ 3.5 (図 1c) の 3 つの部品を両面テープを使用して組み立て、PDMS プラグを鋳造するための PMMA 型を準備します。</li>
	<li>PDMSエラストマー30gとPDMS硬化剤3gを適切に混合して、PDMSカバーとPDMSプラグを準備し、真空チャンバー内で1時間脱気します。</li>
	<li>1.8〜2.0 gの混合物をPDMSカバー用のPMMA型に鋳造し、適切な量を使用してPDMSプラグ用のPMMA型の各キャビティを充填します。未硬化のPDMS混合物10 gをブランクの10 cmプラスチックプレートにキャストします。これらの金型を真空チャンバーに入れて30分間脱気します。</li>
	<li>PDMSを80°Cで2時間硬化させます。金型上で硬化したPDMSを冷却した後、PDMSカバーとPDMSプラグをPMMA金型から取り外します。</li>
	<li>PDMSカバーの流路の端に直径約3mmの2つの穴を開けます。</li>
	<li>10cmのプラスチックプレートから成形したPDMSシートを1cm×1cmの立方体に多数カットし、各PDMSキューブに3mmの穴を開けます。未硬化の1 cm x 1 cmのPDMSキューブを2つPDMSカバーの開口部に接着し(中程度のリザーバーとして機能し、グラジエント円形ヒドロゲルパターンの硬化プロセスを支援するため)、80°Cで1時間硬化させます。</li>
	<li>酸素プラズママシン(30 W RF電力(ハイモード)および600 mTorr圧縮空気)または高周波電子コロナ発生器(115 V、50/60 Hz、0.35 A)の下でPDMSカバーと2つのPDMSリザーバーをTMSPMAコーティングスライドに接着し、90秒間のO2プラズマ処理を行います。</li>
	<li>PDMSカバーのプラズマ処理表面とTMSPMAスライドを接触させ、Si-O-Si結合の形成を通じて永久結合するためにそれらを密接に押し付けます><。
	注:チップを80°Cのオーブンに1時間置くと、接着強度がさらに向上します。</li>
	<li>冷却後、チップを95%エタノールに15分間浸し、風乾します。その後、チップをUV照射で1時間滅菌し、アルミホイルで包んだ箱に入れて層流フードに保管します。</li>
</ol>
4. 細胞含んだハイドロゲルの静的勾配ひずみ
<ol>
	<li>25 mm x 37.5 mm のサイズのフォトマスクを、透明フィルムに Figure 2b のレイアウトを印刷してカットします。Figure 2b の印刷サイズを、Figure 2a の寸法に合わせて調整してください。</li>
	<li>10% FBS、1% Pen-Strep、および250 mLのDPBSを含む100 mLのDMEM培地を37°Cの水浴で調製し、細胞培養培地として使用します。</li>
	<li>凍結乾燥したGelMA25 mgを、1.5 mLの黒色微量遠心チューブで予熱した(37°C)細胞培養培地0.3 mLに秤量します。微量遠心チューブを実験室のスターラー/ホットプレートに置き、GelMAが培地に溶解するまで待ちます。</li>
	<li>50 mgの光開始剤を1 mLのDPBSに秤量し、微量遠心チューブに入れ、80°Cのオーブンで15分間、または光開始剤が溶解するまで</li>置きます。
	<li>ステップ4.4の10%光開始剤を25μL取り、ステップ4.3の微量遠心チューブに加えます。よく混ぜるために数回ピペットで動かします。</li>
	<li>自動セルカウンターを使用して、3 x 106 NIH 3T3細胞をカウントします。懸濁液を200 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を175 μLの細胞培養培地に再懸濁します。</li>
	<li>ステップ4.6の細胞溶液をステップ4.5の微量遠心チューブに添加して、5% GelMA、0.5%光開始剤、および~6 x 106 3T3細胞/mLのプレポリマー細胞溶液を得ます。混合後、100 μLの細胞プレポリマーを100 μLのマイクロシリンジにロードします。</li>
	<li>フォトマスクの一部を滅菌したグラジエント株チップの底面スライドに手動で位置合わせし(図3aを参照)、その間に少量のDI水を使用して位置を固定するだけです。プレポリマーセル溶液を充填した100μLマイクロシリンジをチップの入口に接続します。</li>
	<li>マイクロシリンジを使用して50μLのプレポリマー細胞溶液を流路に置き(図3b図3bを参照)、次にPDMSプラグを使用して出口を差し込む。さらに40 μLの溶液を注入して、円形PDMSメンブレンに凸状の膨らみを作ります。</li>
	<li>ステップ4.9のフォトマスク(下)、マイクロシリンジ(入口)、PDMSプラグ(出口)を備えたチップをUVランプ(365 nm、9 mW / cm2)の下に移動させ、30〜45秒間露光して、流体チャンバー内の同心円状のハイドロゲルを架橋します。</li>
	<li>PDMSプラグとマイクロシリンジを取り外して、液圧を解放します(図3c)を参照)。予熱したDPBSを充填した1 mLシリンジを使用して、入口から出口までフラッシングして架橋されていない樹脂を3回洗い流します。</li>
	<li>流路に約100μLの細胞培養液を入れます。</li>
	<li>チップを滅菌した培養皿に入れ、37°Cの5%CO2雰囲気で1週間培養します。毎日ミディアムをリフレッシュしてください。</li>
	<li>インキュベーションの4時間後の0日目に3つのチップを対照群として、3日目に3つのチップを実験セットとして、20倍の対物レンズを備えた顕微鏡を使用して撮影します。ソフトウェア(ImageJなど)を使用して、1行目から12行目までの各ハイドロゲルの線幅を測定し、圧縮ひずみを計算します(図4) 
	注:伸び率は、40μLと0μLの線幅差の値を40μLの線幅で割ることによって計算されます。</li>
</ol>
5. アライメント解析のための細胞染色
<ol>
	<li>シリンジを使用して、細胞を含んだハイドロゲルを固定するために、RTでDPBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)をフローチップに15分間注入します 
	注:注意。PFAは有毒であり、取り扱いには注意が必要です。</li>
	<li>溶液をDPBS中の0.5%細胞膜透過溶液と10分間交換して、RTで細胞膜を透過化します。</li>
	<li>PBSは、5〜10分の間隔でサンプルを3回洗浄します(ステップ5.1のように、負荷をかけたシリンジを使用)。</li>
	<li>1% BSA溶液をRTで45〜60分間流路にロードします(インレットポートからロードされたシリンジを使用)。</li>
	<li>Alexa Fluor 488 phalloidinと共にバイアルにメタノール1.5 mLを添加し、最終濃度6.6 μMのストック溶液を得ます。</li>
	<li>ステップ 5.5 で 5 μL の Alexa Fluor 488 ファロイジンを 5 μL 取り出し、200 μL の DPBS で 0.1% BSA で希釈して、最終濃度 0.165 μM の Alexa Fluor 488 ファロイジンを導き出します。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して200μLの混合物溶液を流路に加え、チップを37°Cで45〜60分間インキュベートしてアクチン染色します。PBSはサンプルを(上記のように)3回洗浄します。</li>
	<li>PBSで1 μg/mL DAPIを調製し、チップに流し、細胞核を37°Cで5分間染色します。</li>
	<li>DPBSを流路にピペットで注入して染色液を洗い流し、液路チャンバーにPBS溶液を補充して蛍光顕微鏡で画像を撮影します。</li>
	<li>倒立蛍光顕微鏡とCCD検出器、Alexa Fluor 488 phalloidin(アクチン)およびDAPI(核)のex/emのフィルターセットをそれぞれ488/520 nmおよび358/461 nmで使用して、ハイドロゲル中の3T3細胞の蛍光画像を撮影します。</li>
</ol>

<ol><li>Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystems+for+biomimetic+stimulation+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells.</a> Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulation+of+the+cardiac+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+tissue+constructs+that+mimic+myocardium+structure+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics.</a> Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).</li>
<li>Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes+in+a+compliant+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system.</a> Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿でハイドロゲル図形指導及び引張ストレッチ後細胞の配向挙動を比較する単純なアプローチについて報告する.柔軟な PDMS 膜は、同心の円形ヒドロゲルの高さ別の生成のためのドームの曲率を作成します。圧力を解放した後 PDMS 膜は自動的にセンターで最大と外側の境界で最小勾配ひずみ/伸長を形成するマイクロ パターンのヒドロゲルに力を適用します。グラデーションの歪みの形成は柔軟な PDMS 膜と流体チップの処理によって設計されに出席する必要がありますいくつかの重要なパラメーターがあります: (i) 正確に制御、PDMS の厚さの膜はグラデーションのひずみ値を調整することが重要です。膜が厚すぎる場合、セル プレポリマーの最大注入量もは PDMS 膜架橋結合セルを含んだヒドロゲルのグラデーションの高さの適切な凸の曲線を生成することができません。対照的に、薄すぎる PDMS 膜は、ヒドロゲルに十分な力を適用できません。PDMS カバー金型で加硫 PDMS の重量はチップあたり約 1.6 2.0 g であることを確認してください。(ii) 汚染の防止は、流体チップで細胞を含んだゲルの架橋処理中に非常に重要です。インキュベーターで培養、徹底的に流体管内...

ネイティブの微小環境を模したブロック素材として、ゲルの細胞外マトリックス (ECM) を含む再細胞の成長をサポートする生体模倣組織足場を構築できます。組織の機能を所有するには、組織のセルの配置は必須要件です。さまざまな 2 D (すなわち表面上で培養した細胞) と 3 D (すなわちハイドロゲルにカプセル化細胞) セルの配置は、培養または細胞またはマイクロ フレキシブル基板上にカプセル化することによって達成されている- またはナノ パターン1。マイクロ アーキテクチャの 3 D セルの配置はより魅力的な微小環境は、ネイティブの組織構築2,3,4に近いです。3 D のセルの配置のための一般的なアプローチは、ハイドロゲル形2,3の幾何学的なキューです。短軸方向に細胞増殖の制限された空間のため細胞はマイクロ パターン化ハイドロゲルの長軸方向に沿って配置を目指しています。別のアプローチは、ストレッチ方向4,5並列セルの配置を達成するためにゲルに引張のストレッチを適用することです。
圧縮ひずみなどの ECM ゲル上生物物理刺激または電気のフィールドは、適切な組織統合、増殖および分化1,2,3の細胞機能を調整できます。多くの研究は、複数機械制御ユニット4,6,7,8,9を使用して、一度に 1 つのひずみ条件を適用することによって細胞の挙動を調査するために行われています。たとえば、機械式ステップ モーターの使用は圧迫や共通のアプローチ7,10されている 3 D セルでカプセル化されたコラーゲンのゲルの上に伸ばし。しかし、そのような制御装置は余分なスペースを必要とする、インキュベーター7,9,11,12の汚染の問題に直面しています。さらに、大型の楽器は、再現性の高い13を提供する正確に制御環境を与えることはできません。
細胞を含んだヒドロゲルは、医用マイクロ スケールで通常用いられることを考えると、同時に 3 D 模倣構造体外2,14,15,16,17,18細胞の挙動を調査するためのひずみ/ストレッチ刺激の範囲を生成する MEMS 技術を組み合わせることが有利です。たとえば、マイクロ流体チップの PDMS 膜を変形するガス圧を使用して、異なる系統9,16に細胞の分化を運転系統に上昇を与えることができます。ただし、クリーン ルームやモーター、ポンプ、バルブ、圧縮ガスのソフトウェア管理の統合で複雑なチップ製造プロセスなど、多くの技術的課題があります。
この作品は、同心の円形ハイドロゲル パターンと柔軟な PDMS 膜を用いた自律的勾配の静的ひずみマイクロ流体チップを取得する単純なアプローチを紹介します。異なり、既存のアプローチのほとんどは、当社のプラットフォームは黄色い部屋の外を作製できるし、孵化の間に外部機器なしの携帯カプセルのヒドロゲルを同心円のグラデーションの系統を自己生成所有しているポータブルと使い捨ての小型デバイスです。ハイドロゲル形状の組み合わせによって影響を受けた 3T3 繊維芽細胞の挙動と 3 日間のグラデーションひずみチップで 3 D の ECM 模倣環境内セルの配置の観察の間に様々 な引張ストレッチ指導の手がかりを示した。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 黒色微量遠心チューブ</td><td>Argos Technologies&nbsp;</td><td>03-391-161</td><td>これは、アルミホイルで覆われた1.5mLチューブのニュートラルカラーと交換できます</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidin&nbsp;</td><td>インビトロジェン</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Molecular Probe</td><td>C1430</td><td>生細胞</td></tr><tr><td>CCD</td> PCOの標識用<td>。イメージング</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>細胞膜透過液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>0.5% Triton X-100 浸透細胞膜</td></tr>用 <tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>細胞核染色</td></tr><tr><td>透析膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>分子量カットオフ = 14,000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>ゲル強度 300、タイプ A、豚の皮から</td></tr><tr><td>高周波電子コロナ発生器</td><td>電気技術製品</td><td>モデル BD-20</td><td></td></tr><tr><td>メタクリル無水物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>80501</td><td>50 &mu;L&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>IX71</td><td>2つのフィルターセットが含まれています:LF405/LP-B-000とLF488/LP-C-000 Semrock</td></tr><tr><td>酸素プラズママシン</td><td>から ハリックプラズマ</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>細胞固定用</td></tr><tr><td>PDMS</td> ダ<td>ウコーニング</td><td>シルガード184</td><td>PDMSチップキャスト成形製造用</td></tr><tr><td>混合物 ペン-連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>光開始剤</td><td>CIBA</td><td>イルガキュア2959</td><td></td></tr>ヨ<tr><td>ウ化プロピジウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P4170</td><td>死細胞の標識用</td></tr><tr><td>滅菌ろ過カップ</td><td>ミリポア</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>440159</td>ヒ<td>ドロゲル固定化</td></tr><tr><td>超音波装置</td><td>デルタ用</td><td>D150H</td><td>150W、43kHz</td></tr><tr><td>UVライト</td><td>ダイハン</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3(線維芽細胞)</td><td>食品産業研究開発機構(FIRDI)</td><td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini 自動セルカウンター</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

人工細胞の配置については、組織工学の分野でのホットな話題です。過去の研究のほとんどは、複雑な実験的プロセスおよび汚染の問題に通常関連付けられている質量システム制御、使用して細胞を含んだハイドロゲルのひずみ誘起細胞の単一の位置合わせを調査しました。したがって、この記事では PDMS のプラスチック カバー、UV 透明なガラス基板 3 D ゲルの細胞挙動の刺激のため流体チップを用いた勾配静的ひずみを構築するシンプルなアプローチを提案する.流体の商工会議所でのオーバー ロードの写真パターン形成可能なセル プレポリマーは、カバーの凸曲面 PDMS 膜を生成できます。UV 架橋後湾曲した PDMS 膜とバッファー洗浄、調査細胞の微小環境下で同心円形パターンをさまざまなグラデーションの株の下で動作は外部機器なしの単一の流体チップで自己確立です。NIH3T3 細胞をゲル上 15-65% から様々 なひずみの刺激との連携で、ジオメトリの指導の下で細胞の配置の傾向の変化を観察した後示した。3 日間培養後ハイドロゲル ジオメトリは、細胞が高圧縮ひずみハイドロゲル伸長方向に沿って整列低圧縮ひずみ, セルの配置を支配しました。これらの間は、細胞は、ハイドロゲルの伸長とパターン化ハイドロゲルの幾何学指導の根本的な指導の逸散によるランダムな配置を示した。

完成したグラデーションひずみ刺激チップの各円形のハイドロゲルの機械的変化を比較するためは 0 μ L (図 4 a) の注入量と 40 μ L (図 4 b) では、同じチップの 2 つの各円形のハイドロゲルの線幅をそれぞれ測定しました。各サークルでパーセントの伸びを 0 μ L 注入チップ (図 4 c) に対応するハイドロゲルの線幅で 40 μ L 注入チップの伸びを割ることによって求めた。ヒドロゲルは縦収縮ひずみは横方向の伸張ひずみ量に相当するので非圧縮性材料であります。したがって、40 μ L 注入量とチップのパーセントの伸びを示す 15 65% 伸長圧縮ひずみに変換することができます (補足のファイル 1を参照してください)。
それ...

組織工学用セルの配置を調整する同心円状細胞を含んだハイドロゲルの非連続的なグラデーション静的系統を提供する単純なアプローチを紹介します。

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

このグラジエントひずみチップの全体的な目標は、一連のひずみ条件下での細胞の挙動を調査するために、3Dハイドロゲル上に非連続的なグラジエント静的ひずみを生成するためのシンプルなアプローチを提供することです。この方法は、幹細胞の分化の刺激や人工組織器官の発達のための細胞アライメントの制御など、バイオエンジニアリング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞の挙動を比較するために、同じ微小環境下で細胞層とハイドロゲルにさまざまな菌株を適用できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、高い細胞変動性を確保するために実験の基礎として光が3〜4時間で完了する必要があるため、チップ調製手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。10グラムのゼラチン粉末を計量し、100ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を入れたガラスフラスコに加えます。マグネティックスターバーをフラスコに入れ、フラスコを攪拌ホットプレートに置きます。フラスコをアルミホイルで覆い、水分の蒸発を防ぎます。ホットプレートの温度を50〜60度に設定し、スターラーを100RPMで1時間設定してゼラチン粉末を溶解します。ゼラチンが溶解した後、ピペットを使用して8ミリリットルの無水メタクリル酸を非常にゆっくりと加えます。摂氏60度で3時間反応させます。次に、予熱したDPBSをフラスコに加え、最終容量500ミリリットルにします。溶液を15分間よく混合して反応を止めます。その間、透析膜を数本の25ミリメートルの長さのチューブに切断します。それらを脱イオン水に15分間浸します。そして、透析チューブの一端を閉じるために結び目を作ります。適量のポリマー溶液を透析チューブに装填し、もう一方の端を閉じます。次に、充填したチューブを脱イオン水を入れた5リットルのプラスチックビーカーに1週間入れます。脱イオン水は1日2回更新し、透析中は溶液を摂氏40〜50度に維持します。透析後、チューブから溶液を500ミリリットルのガラス瓶に集めます。約450〜500ミリリットルの溶液を500ミリリットルのフィルターカップに注ぎます。そして、真空を適用して、溶液をフィルター膜に強制的に通過させ、滅菌します。次に、滅菌したポリマーを数本の50ミリリットルの滅菌チューブに移します。滅菌したポリマーを50ミリリットルの滅菌チューブ数本に移し、マイナス80°Cの冷凍庫で3〜5日間保存します。マイナス80°Cのポリマーを凍結乾燥機で1週間凍結乾燥させてGelMAを形成し、マイナス80°Cの冷凍庫で保存します。チップ製造のためには、まずポリメタクリレートまたはPMMAを調製し、テキストプロトコルに記載されているように再生および成形する。次に、30グラムのPTMSエラストマーと3グラムのPTMS硬化剤を適切に混合して、PTMSカバーとPTMSプラグを準備します。真空チャンバー内で混合物を1時間脱気します。混合物の1.8〜2グラムをPTMSカバー用のPMMA型に鋳造します。また、PTMS プラグの PMMA 金型の各キャビティを充填するために適切な量を使用します。さらに、10グラムの未硬化PTMS混合物をブランクの10センチメートルのプラスチックプレートにキャストします。これらの金型を真空チャンバーに入れて30分間脱気します。PTMSを摂氏80度で2時間硬化させます。金型で硬化したPTMSを冷却した後、PTMSカバーとPTMSプラグをPMMA金型から取り外します。次に、PTMSカバーの流路の端に直径約3ミリメートルの2つの穴を開けます。10cmのプラスチック板から成形したPTMSシートを、1cm×1cmの立方体に多数カットします。そして、各PTMSキューブに3ミリメートルの穴を開けます。PTMSカバーの開口部に1cm×1cmの未硬化のPTMSキューブを2つ接着して、中程度のリザーバーとして機能し、勾配円形のヒドロゲルパターンの硬化プロセスを支援します。その後、摂氏80度で1時間硬化させます。次に、PTMSカバーと2つのPTMSリザーバーをTMSPMAコーティングスライドに接着します。これを行うには、PTMSカバーの接着面とTMSPMAコーティングスライドを酸素プラズマ装置の下で90秒間酸素プラズマ処理します。PTMSカバーとTMSPMAスライドのプラズマ処理面に接触させ、それらを密接に押し付けて、シリコン酸素シリコンボンドの形成を通じて永久結合します。フォトマスクは、決められたレイアウトを透明フィルムに印刷して印刷します。次に、印刷したフォトマスクを25ミリメートル×37.5ミリメートルのサイズにカットします。25ミリグラムの凍結乾燥GelMAを0.3ミリリットルの温めた細胞培養培地に秤量し、1.5ミリリットルの黒色微量遠心チューブに入れます。GelMAが培地に溶解するまで、微量遠心チューブを実験室の攪拌機ホットプレートに置きます。微量遠心チューブ内の1ミリリットルのDPBSに50ミリグラムの光開始剤を加えます。そして、それを摂氏80度のオーブンに15分間、または光開始剤が溶解するまで置きます。25マイクロリットルの10%光開始剤をマイクロ遠心チューブに加えます。よく混ぜるために数回ピペットで動かします。次に、自動セルカウンターを使用して300万個のNIH3T3細胞をカウントします。懸濁液を200Gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞を175マイクロリットルの細胞培養培地に再懸濁します。細胞溶液を微量遠心チューブに加えて、5%GelMA、0.5%光開始剤、およびミリリットルあたり約600万個の3T3細胞のプレポリマー細胞溶液が得られます。100マイクロリットルの細胞プレポリマーを100マイクロリットルのマイクロシリンジに混合ロードした後。フォトマスクの一部を滅菌したグラジエントストレインチップの下部スライドに手動で位置合わせします。そして、その間に少量の脱イオン水を使用して位置を固定するだけです。プレポリマーセル溶液を充填した100マイクロリットルのマイクロシリンジをチップの入口に接続します。次に、マイクロシリンジを使用して50マイクロリットルのプレポリマーセル溶液を流路に入れ、PTMSプラグを使用して出口を塞ぎます。さらに40マイクロリットルの溶液を注入して、円形PTMSメンブレンに凸状の膨らみを作ります。フォトマスク、マイクロシリンジ、PTMSプラグを装着したチップをUVランプの下に移動します。そして、それを30〜45秒間さらして、流体チャンバー内の同心円状のヒドロゲルを架橋します。架橋後、PTMSプラグとマイクロシリンジを取り外して液圧を解放します。予熱したDPBSを充填した1ミリリットルのシリンジを使用して、入口から出口まで洗い流して架橋されていない樹脂を3回洗い流します。次に、流路に約100マイクロリットルの細胞培養培地を充填します。チップを滅菌した培養皿に入れ、摂氏37度の二酸化炭素5%雰囲気で1週間培養します。毎日ミディアムをリフレッシュしてください。対照群として4時間のインキュベーション後の0日目に3つのチップの画像を撮影します。そして、3日目に3チップを実験セットとして、20倍の対物レンズを持つ顕微鏡を使用。ソフトウェアを使用して、ライン1からライン12までの各ハイドロゲルのライン幅を測定し、圧縮汚れを計算します。ここに示されているのは、0マイクロリットルと40マイクロリットルのオーバーインジェクション、UV架橋および4時間のインキュベーション後のハイドロゲルパターンの代表的な結果です。非オーバーインジェクションコントロールの3Dハイドロゲルの線幅は、予想通り均一に見えます。しかし、40マイクロリットル以上の注入によるハイドロゲルパターンは、ハイドロゲルの勾配線幅をライン1からライン12に減少させます。3日間のインキュベーション後、ハイドロゲル内の細胞は異なる方向に伸びます。ライン1の細胞は、ハイドロゲル伸長の刺激により半径方向に沿って整列します。それどころか、12行目の細胞は、形状の手がかりが細胞の整列を支配するヒドロゲル形状に沿って整列します。行 7 には、行 1 と行 12 の 2 つの細胞配置の手がかりが互いにバランスをとる特定の細胞配置はありません。3Dハイドロゲル上のグラジエントひずみの微小環境を測定すると、適切に実行されれば、グラジエントひずみチップによって2時間で測定できます。この手順を試みる際には、細胞プレポリマー溶液をロードする前にグラジエント株チップを滅菌することを忘れないようにすることが重要です。また、チップを細胞培養インキュベーターに入れる前に、チップの表面を75%エタノールで完全に拭いてください。このビデオを見た後、さまざまなひずみインペリアル下での細胞の挙動を調査するための勾配ひずみチップを生成する方法について非常によく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は明確に定義された微小環境における空間的および時間的勾配を生成することができる勾配を発生するマイクロ流体デバイスの微細加工のためのプロトコルについて説明します。このアプローチでは、勾配を発生するマイクロ流体デバイスは、指示細胞の遊走、胚形成、創傷治癒、癌の転移を研究するために使用することができます。...

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。...

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

流体成分と統合された微細加工デバイスは、in vivoの微小環境を模倣した細胞研究のためのin...

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。...

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。...

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。...

ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能

我々は、新生児の心筋細胞と組織工学のためのフィブリンハイドロゲルの構造でカプセル化するための細胞の調製の分離を説明します。我々は、電気刺激と細胞の生存および免疫組織染色により発生する活性力を含む培養期間後に心筋培養組織を分析するための方法を説明します。...

心臓組織工学のためのフィブリンゲルにおける心筋細胞のカプセル化

学ぶ、ひずみ勾配チップを用いて細胞を含んだハイドロゲルに静的ひずみを与え、細胞配向と行動を調べる方法。組織工学における幹細胞分化と人工組織開発の研究に応用できる。

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

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