無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

この手順の全体的な目標は、新たに単離された無傷のマウス大動脈において、蛍光色素DAF-2DAおよびDHEを使用して細胞内一酸化窒素およびスーパーオキシド陰イオンを同時に検出することです。この方法は、内皮機能障害やeNOSの脱共役など、心血管生理学分野の研究者の症例を研究室で回復するのに役立ちます。この技術の主な利点は、無傷の血管内で一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンを同時にex vivoで直接検出および可視化するためのシンプルで正確な方法を提供することです。

このプロトコルでは、摂氏37度に加熱し、炭素ガスタンクから95%酸素、5%二酸化炭素ガスで曝気できる臓器浴システムを構築します。まず、必要に応じて十分な量の新鮮なKrebs-Ringer Bicarbonate Bufferを調製し、目的の組織を入浴させます。たとえば、1回の実験では、アオルタには200ミリリットルが必要です。

オルガンバスシステムのスイッチを入れ、熱制御を摂氏37度に調整します。クレブス・リンガー重炭酸緩衝液でチャンバーを洗浄した後、各チャンバーに5ミリリットルのクレブス・リンガー重炭酸緩衝液を加え、ガスをオンにして95%の酸素と5%の二酸化炭素で30分間曝気します。チャンバーを覆ったままにしてください。

また、氷冷したKrebs-Ringer Bicarbonate Bufferのボトルをエアレーションで調製します。胸部大動脈を切除した後、すぐに組織全体を氷冷したクレブスリンガーバッファーの入った皿に浸します。.解剖顕微鏡下で、胸部大動脈セグメントをバッファーに保持しながら、心臓と大動脈弓を切除します。

次に、外科用ハサミと鉗子を使用して、血管周囲組織に付着していない大動脈を解剖します。次に、鉗子を使用して組織の端をつかみ、シリンジから送達された氷冷したクレブスリンガーバッファーを使用して血管内腔から血液を穏やかに洗い流します。血管内腔の血栓は、人工的なシグナルを引き起こし、蛍光シグナルを妨げる可能性があるため、洗い流す必要がありますが、同時に、内皮層を損傷しないようにフラッシング強度を制御する必要があります。

次に、洗浄した大動脈輪を3ミリメートルの長さのセグメントに切断します。洗浄した大動脈リングを準備した後、それらを染色します。血管を固定せずに、鉗子で大動脈輪の外膜側のみに触れて、洗浄された大動脈セグメントを準備された臓器浴室に移します。

動脈をバッファー内で30分間平衡化させます。30分後、アセチルコリンを臓器浴に加えて最終濃度を1マイクロモルにし、動脈をアセチルコリンと10分間インキュベートします。一方、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、予め加温したクレブス緩衝液を添加した1ミリリットルの染色溶液を調製します。

次に、チューブをホイルで包んで光への露出を最小限に抑え、摂氏37度に保ちます。アセチルコリン刺激後、大動脈輪を臓器浴から染色液のチューブに移し、暗所で曝気しながら30分間インキュベートします。この時点以降のすべての手順は、最小限の光にさらされて行う必要があります。

次に、大動脈輪をクレブス緩衝液で満たされた新しいチューブに1分間移します。この洗浄手順を3回実行します。次に、大動脈輪を4%パラホルムアルデヒド溶液の浴中で室温で30分間固定します。

固定ステップの後、リングをDAPI溶液に室温で3分間移し、対比染色を塗布します。次に、大動脈輪をPBSで3回、1回の洗浄につき1分間洗浄します。リングを動かすときは、常に内皮組織の脆弱性に注意してください。

顕微鏡下で、スライド上の顕微手術用ハサミで大動脈輪を縦方向に切断します。次に、大動脈を濡らしたまま、大動脈の余分な液体を取り除きます。2つの顕微手術用鉗子を使用して、内皮をスライドガラス上に下に向けて、巻き上げた大動脈をスライドに対して平らに押し込みます。

このプロセスでは、アオルタを前後に動かさないでください。この手順は非常に重要ですが、操作は簡単ではありません。正式な実験の前に十分に練習することをお勧めします。

その後、封入剤を大動脈に落とします。スライドを覆い、マニキュアで密封します。暗所で風乾した後、共焦点顕微鏡でスライドを画像化します。

200 ヘルツのスキャン速度、1024 x 1024 ピクセルの解像度、1/4 ミクロンの Z スタック サイズを使用します。DAF-2DAを観察するには、アルゴンレーザーを使用し、励起蛍光を488ナノメートルに設定し、発光検出を515ナノメートルに設定します。DHEを観察するには、励起蛍光を514ナノメートルに設定し、検出を605ナノメートルに設定します。

10倍の倍率でピントを合わせた後、対物レンズを40倍の倍率に調整します。次に、DAPI染色された核を目印として使用して、コントロールパネルのz位置を調整して、内皮層の範囲を定義します。次に、内腔境界上の内皮層から内皮層の全厚までスキャンし、画像を記録します。

各サンプルについて、少なくとも3つの異なる視野をスキャンします。若いC57ブラック6マウスは、14週間にわたって高脂肪食を与えて肥満にしました。コントロールには通常のチャウが与えられました。

14週間後、胸動脈を検査しました。染色前に、組織をeNOS阻害剤L-NAMEに1ナノモルで1時間曝露しました。DAF-2Tからの信号(緑色)は、非蛍光性のDAF-2から一酸化窒素によって変換されています。

したがって、染色は細胞内に一酸化窒素が存在することを示唆しています。同様に、スーパーオキシドによって酸化されると、DHEは赤色の蛍光シグナルを発します。したがって、より多くの赤色を示すサンプルは、細胞内により多くのスーパーオキシドを持っています。

共焦点蛍光画像を定量化すると、高脂肪食を与えられたマウスの大動脈内皮層における一酸化窒素産生の減少とL-NAME感受性スーパーオキシド産生の増加が明らかになりました。これらのデータは、eNOSのアンカップリングが肥満と起こるという考えを裏付けています。このビデオを見れば、一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンの検出方法、および無傷の血管での蛍光色素の使用について十分に理解できるはずです。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6時間で習得できます。この手順を試行する間、手術の全手順で内皮層を無傷に保つことを覚えておくことが重要です。また、固定ステップの前に内皮細胞を生き続けるために、常に血管をクレブスリンガーバッファーに浸してください。

この手順と組み合わせることで、血管の血管運動反応の分析などの他の手段を実行して、血管緊張の調節における内皮細胞の生理学的機能などの追加の質問に答えることができます。