Name: 無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶマウス大動脈における一酸化窒素とスーパーオキシドの同時蛍光検出法。DAF-2DAとDHEを用いたこの手法は、内皮機能と酸化ストレスを可視化し、心血管疾患研究に有用です。

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この作業は、スイス国立科学財団(310030_141070/1)、スイス心臓財団、およびスイス国立研究能力センター(NCCR-Kidney.CH)の支援を受けました。Yu Yiは、Chinese Scholarship Councilの支援を受けています。

動物の作業はフリブール、スイスの獣医事務所の倫理委員会によって承認されました。プロトコルは、私たちの施設で動物のケアと実験のガイドラインに従います。 単離された動脈のインキュベーションのためのセットアップの調製<ol><li> 37℃に加熱し、炭素ガスタンクから95％O 2および5％CO 2を通気することができる器官浴システムを構築します。 </li><li>以下の組成物の濃度に必要な量のクレブス-リンガー重炭酸緩衝液を準備します（118のNaCl、4.7のKCl、2.5mMのCaCl 2を、1.2 mMの硫酸マグネシウム、1.2 mMのKH 2 PO 4、25mMのNaHCO 3を、0.026 mMのEDTA、および11.1 mMのD-グルコース）。 </li><li>氷上ストック緩衝を維持し、95％O 2および5％CO 2でバッファを通気。 </li><li>オーガンバスシステム上のスイッチ、37℃に温度を設定し、各チャンバーにすぐに使用できるバッファの5ミリリットルを追加95％O 2および5％CO 2でバッファを通気保ちます。 </li><li> 30分間クレブス - リンガー緩衝液で1回チャンバーを洗浄します。 </li><li>各チャンバーに5ミリリットルクレブス - リンガー緩衝液を添加し、蒸発を避けるために、チャンバーをカバーしています。 </li></ol>マウス大動脈の2の単離<ol><li>マウスを犠牲にする150 10mg / kgの濃度で腹腔内の0.9％NaClに溶解されたペントバルビタールを注入します。 </li><li>手術用ボードに無気力にマウスを置きます。 </li><li>消毒や水分の目的のために70％エタノールで胸部の毛スプレー。 </li><li>心臓や肺を露出させ、肺を除去するために、リブの周りに切断してオープン胸腔。 </li><li>ティッシュペーパーで軽く胸腔内の血液を除去します。 </li><li>ピンセットでそっと心をつかみ、手術用ハサミで大動脈と背骨の間の血管周囲脂肪組織を切断することにより、胸部大動脈を切り離します。 </li><li>すぐにwholを浸します氷冷（4℃）クレブス - リンガー緩衝の電子組織。 </li><li>解剖顕微鏡下で心臓や大動脈弓を削除し、バッファに胸部大動脈セグメントを保ちます。 </li><li>手術用ハサミやピンセットで顕微鏡下で血管周囲の組織を接着するから無料大動脈を解剖。 </li><li>鉗子で大動脈の端縁をつかみ、ゆっくり26 G×1 / 2&quot;シリンジでクレブス - リンガーバッファをフラッシュすることにより、血管の内腔に血液を洗い流します。 </li><li> 3ミリメートル長いセグメントに洗浄大動脈輪をカットします。 注：内皮層に損傷を与えないために、この段階で注意を払ってください。 </li></ol> 3. DHEとDAF-2DA染色<ol><li> 37℃のクレブス-リンガー緩衝液で満たされた臓器槽チャンバに鉗子で洗浄大動脈セグメントを転送するには、95％O 2および5％CO 2を通気。 鉗子で大動脈環のタッチだけ外膜側をaとbを固定しないでください注：lood船。 </li><li> 30分間器官槽チャンバ内の動脈を平衡化します。 </li><li>最終濃度1μMの器官槽にアセチルコリン（AChの）を追加し、10分間動脈をインキュベートします。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブに予め温めたクレブス - リンガー緩衝液で（千×ストックから希釈した各色素の5μM）DHE / DAF-2DA溶液1mlを準備します。光暴露を避けるためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。 </li><li>刺激後、37℃でマイクロ遠心チューブにDHE / DAF-2DA溶液に器官浴から大動脈環を転送、95％O 2および5％CO 2を通気し、30分間大動脈環をインキュベートします。 注：このステップから、暗闇の中で常に大動脈を保ちます。 </li><li>洗浄のためにクレブス - リンガー緩衝液で新しいマイクロチューブに大動脈輪を移し、1分以内に洗浄を3回繰り返します。 </li><li> 30固定のために4％パラホルムアルデヒド溶液に大動脈環を転送します分。 </li><li>準備1ミリリットル4 &#39;、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内のバッファを持つ（千×ストックから希釈した300 nMの、）6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）ソリューション。 3分間の大動脈を対比染色。 </li><li> 1分間の洗浄のためにPBS緩衝液で新しいマイクロチューブに大動脈を転送します。洗浄を3回繰り返します。 注：大動脈輪をクランプまたは内皮層を傷つけないよう注意してください。 </li></ol> 4. アンフェイスマウント<ol><li>スライドにマウンティング培地のドロップを追加します。 </li><li>ロールアップ大動脈を平らにし、スライドガラス上に下向きに内皮とマウンティング媒体に顔エンそれをマウントし、顕微鏡下で顕微はさみで縦方向に大動脈リングをカット。前後に大動脈を移動しないでください。 </li><li>カバースリップとスライドを覆い、マニキュアとスライドを封印。 </li><li>光保護下に空気乾燥した後、悲惨な画像化するためのスライドを使用CTLY時間以内または今後数日間、-20℃で保管してください。 </li></ol> 5.共焦点顕微鏡イメージング<ol><li>蛍光シグナルを検出するために、共焦点顕微鏡を使用してください。マシンに切り替えて、このような倍率、スキャン速度、分解能、Zスタックなどの画像設定を最適化。 <ol><li>このプロトコルでは、200 Hzの走査速度、1024×1024ピクセルの解像度および0.25μmでのZ-ステップサイズを使用します。一方、514 nmでのDHEから蛍光を励起し、605 nmの発光で検出し、488nmのアルゴンレーザーをDAF-2DAから蛍光を励起し、515 nmで検出します。 </li></ol></li><li> DAPI信号が紫外線を透明になるまで、サンプルに焦点を当てる10X倍率を使用し、その後、40倍の倍率に目標を調整します。 </li><li>コントロールパネル上のZ位置を調整することにより、内皮層の範囲を定義します。 DAPI染色された核の信号は、内皮層における楕円形や円形のドットです。 </li><li>上からスキャン内皮信号と記録画像の全厚を通る試料の（内腔の境界線上に内皮層）。各サンプルを走査するための少なくとも3つの異なるフィールドを選択してください。 </li></ol>画像の6.分析<ol><li>共焦点顕微鏡によってスキャンしたデータを開くためにソフトウェアを使用してください。分析のためのフィールドごとに3つの連続した​​画像を選択し、サンプルあたり少なくとも3つの異なるフィールドを評価します。選択した画像をエクスポートし、JPEGファイルとして保存します。 </li><li>画像処理ソフトでDAF-2DA、DH​​E及びDAPI染色から画像を定量化します。 DAPI染色からの画像は、DAPI陽性の核の数をカウントする「プラグイン」→「分析」→「セルカウンター &#39;を選択します。 <ol><li> DAF-2DAとDHE染色からの画像では、信号の強度を分析し、相対シグナル強度として「平均」の値を取る→「メジャー &#39;&#39;を分析する」を選択します。 DAF-2DAの比にとして存在し、結果DAPI陽性核またはDAPIに対するDHEの比率。各サンプルについて、すべての画像およびフィールドの平均値をとります。 </li></ol></li><li>倍の変化を取得するには、対照群の平均値で各サンプルの結果を割ります。統計分析は、ダネットまたはボンフェローニ事後検定を用いて不対スチューデントt検定またはANOVAを用いて行きました。平均±SEMとしてデータを与えます。 p &lt;0.05の14で有意で、平均値の差を考慮してください。 </li></ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

NOまたはO 2の検出は、.-蛍光色素で頻繁に組織の凍結切片23にも培養内皮細胞における多くの研究で使用されました。ここでは、 顔のNOの検出とO 2 .-、比較的単純で、かつ直感的に有効であるそれぞれDAF-2DAとDHE、と内皮層におけるレベル途中 、 すなわち 、無傷の生きた血管、この方法を拡張しました。血管の凍結切片での方法と比較して、この方法は、より低いバックグラウンドを示し、動脈のメディアにおける弾性繊維の凍結切片において、特に大動脈が特定NOまたはO 2と干渉する可能性が非常に強い自己蛍光シグナルを与えるので、より定量的です。 -内皮細胞で生成された信号。また、内側平滑筋細胞におけるNADPHオキシダーゼまたはその他の酵素によって特異的O 2 .-生成も妨害する可能性が血管の凍結切片を用いる方法の欠点を表し、血管のセクション、中の内皮細胞内シグナルと。対照的に、 ア...

血管内皮細胞は、血管作動性因子1を放出することによって血管の機能的および構造的完全性を維持します。これらの要因の中では、内皮NOシンターゼ（eNOSの）を介して、L-アルギニンから生成された内皮由来一酸化窒素（NO）は、心臓血管生理学2の中で最も重要かつ最もよく特性要因です。 NOは、平滑筋の弛緩を引き起こし、細胞増殖を阻害し、したがって血管疾患の発達3に対する保護、内皮下の空間に血小板凝集、および炎症性細胞接着および浸潤を抑制する。加齢、高血圧、糖尿病、高脂血症などを含む多くの生理学的および病理学的条件下では、することを特徴と内皮機能障害は、NO生物学的利用能を低下させず、O 2を増加させた .-生産が存在し、アテローム性動脈硬化症2の病因を促進します。近年の研究では、eNOSのの脱共役であることを実証しています様々な上記条件1,4の下でのeNOSの酵素は、O 2を生成する内皮機能不全、.-代わりにNOのための重要なメカニズム。したがって、内皮機能の分析は、特に、NO産生を内皮ず、O 2 .-世代は、心血管疾患や合併症に関する実験的研究のために極めて重要です。 生物学的サンプル中のNO産生を分析せず、測定するために開発されてきた多数の方法論的アプローチがあります。容易にNO 2に酸化されるNOの極めて不安定な性質のために-及びNO 3 - 3〜6秒の半減期で、直接測定しないことは困難です。したがって、NO 2の決意- / NO 3 -流体サンプル中の細胞または組織5から放出されたNOの指標としました。手順は比較的容易であるが、この方法は、しかしながら、EA/ NO 3 - -溶液中に含まれるsily安定したNO 2の高いバックグラウンドによって影響を受けます。 NOは、環状グアノシン一リン酸（cGMP）6を生成するために可溶性グアニル酸シクラーゼを刺激するため、細胞のcGMPレベルはまた、NO放出7を推定しないと判定されました。繰り返しますが、これは間接的な推定値であり、そのようなC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）のようないくつかの内皮由来の要因も、粒子状グアニル酸シクラーゼ8の活性化を介してcGMPレベルを高める可能性があるので、特定できない場合があります。 NOは、副生成物9、L-シトルリン生産の測定は、したがって、NO産生を推定しないように間接的な方法として使用されているように、L-シトルリンの生成とL-アルギニンから生成されます。この方法の主な欠点は、それが放射性であり、それは、生物活性NOレベルを測定しないことがあり、O 2によってNOが急速に不活性化することができた解放以来.-。また、L-シトルリンは、L-ためにリサイクルすることができます10アルギニン 。このような化学発光検出11、電子スピン共鳴12、または電気化学ポルフィリンNOセンサ13などの他の化学的方法は、いくつかの研究者によって使用されています。これらの方法は、通常、検出手順の動作が容易ではなく、特殊な装置を必要とします。これは、多くの研究は、内皮機能を評価し、間接的に内皮由来NO媒介血管弛緩を測定するために、内皮の有無にかかわらず、単離された血管と器官槽実験を適用することを言及することもあります。それは生理学的状況に主に近いですが、厳密に言っているが、NO機能を測定しません。しかし、この方法では、それはむしろeNOSの機能の正味の影響を反映し、一般的に内皮媒介血管運動応答、他の内皮由来弛緩の生産を評価します要因と内皮由来契約要因、O 2 .-の生産、また、平滑筋細胞の応答これらの要因に。 eNOSの機能またはNO産生の具体的な分析は、通常3を必要とされています。 我々を含む多くの研究グループは、近年NO 14〜19の細胞内産生を検出する蛍光色素法を使用しています。この方法では、細胞透過性の蛍光標識ジアミノ-2アセテート（DAF-2DA）は、in vitroまたはex vivo での細胞および生体組織中の遊離NOおよびNOS機能を測定しました。原理は、生きた細胞内で、DAF-2DAは、その後、NOと反応させることにより、DAF-2トリアゾール（DAF-2T）を蛍光性に変換した非蛍光4,5-ジアミノ（DAF-2）に細胞内エステラーゼにより脱アセチル化されていることです。 DAF-2Tからの蛍光は、蛍光顕微鏡または蛍光共焦点顕微鏡14で観察することができます。細胞内の蛍光強度は、したがって、細胞の細胞内NO産生または無傷の血液vesse内の内皮を反映しますリットル。このようなジヒドロ（DHE）のような特定の蛍光染料と組み合わせることで、1は、同時に細胞または血管14に細胞内NOとO 2 .-世代を評価することができます。同様に、DHEはまた、O 2 .-、細胞内で酸化された細胞透過性化合物、および酸化物であるその後、蛍光顕微鏡や蛍光共焦点顕微鏡により定量的に検出可能な鮮やかな赤色を発光する核酸とインターカレー。 DHEは、O 2を検出するための非常に特異的な色素である.-生物学的試料から、それは本質的に、スーパーオキシドラジカルを検出すると、細胞によって十分に保持され、さらに穏やかな固定20を許容することができます。この蛍光色素法の利点の一つは、それが検出され、直接に生体血管の無傷内皮層の面エン NOおよび/ ​​またはO 2を .-可視化することです。 本論文では、我々は、この蛍光色素NOを検出する方法とO 2 .-私たちはNOとO 2の顔検出専用のために適合している.-高脂肪食（HFD）の給電により誘導される肥満モデルマウスの無傷の大動脈でについて説明します。我々は、このメソッドが正常にかつ確実にNOとO 2 .-レベルを測定し、肥満で新たに単離した無傷のマウスの大動脈の内皮層中のeNOS（DYS）機能を評価することができることを実証します。

<table><tbody><tr><td>ジヒドロエチジウム(DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td>は<td>DMSOで5&nbspに溶解します。mmol/L を 1,000x ストックとして、-20&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>ジアミノフルオレセイン-2 ジアセテート (DAF-2DA)</td><td>カルバイオケム</td><td>251505</td><td>DMSO で 5&nbsp;mmol/L を 1,000x ストックとして、-20&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td> を<td>水で 300&nbsp;&マイクロ;mol/L を 1,000x ストックとして、4&nbsp;&deg;C</td></tr><tr><td>マウント媒体</td><td>ベクトル労働。(リアクトラブ)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N<サブ>&#969;-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩(L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>マルチミオグラフシステム&nbsp;</td><td>デンマークのMyo Technology A/S</td><td>Model 610M</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>DM6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ&nbsp;</td><td>S&T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>顕微手術用ハサミ&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>S&T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ 丸径 15&nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>チップ 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヒント200 &#956;l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ セーフロック チューブ 1.5 ml</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>塩化アセチルコリン</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

内皮NOシンターゼ（eNOSの）から製造された内皮由来一酸化窒素（NO）は、心臓血管生理学の中で最も重要な血管保護分子の一つです。そのようなのeNOSの脱共役としての機能不全のeNOSは、スーパーオキシドアニオンにおけるNO生物学的利用能および増加の減少につながる（O 2 .-）の生産、ひいては心血管疾患を促進します。したがって、内皮細胞におけるNOとO 2 .-レベルの適切な測定は、心血管疾患や合併症の研究のために極めて重要です。なぜならNO及びO 2 .-の極めて不安定な性質のため、測定及びO 2 .-直接血管内のが困難です。多くの方法は、NOとO 2 .-産生を測定するために開発されています。しかしながら、いずれかの非感受性、または非特異的な、または技術的に要求され、特別な装置を必要とします。ここでは、適応を説明します顔を同時に検出し、細胞内のNOとO 2の可視化エン .-誘発性肥満マウスモデルの無傷の大動脈で、それぞれ、細胞透過性ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用するための蛍光色素法の高脂肪食負荷によって。我々は、細胞内のNOを減少し、コントロールリーンマウスと比較して、O 2 .-肥満マウスの新たに単離された無傷の大動脈内のレベルを高め実証できました。我々は、この方法は、NOとO 2の直接検出と可視化.-無傷の血管のための簡単な技術であり、広く（生理）病理学的条件下での内皮（DYS）関数の調査のために適用することができることを実証しています。

肥満は虚血性冠動脈性心疾患の重要な危険因子であり、関連するとNOの生物学的利用能、アテローム性動脈硬化性血管疾患21の特徴を内皮ない減少します。 eNOSの-脱共役内 ​​皮22老化を含む多くの生理学的および病理学的条件下での機能不全、アテローム性動脈硬化症、及び肥満14の重要なメカニズムであることが示されています。そこで、ここではNOとO 2の代表的な結果.-大動脈内のレベルを示すためにリーンと肥満マウスを比較します。 10.6％の脂肪、27.6パーセントのタンパク質、および57％の炭水化物、繊維4.8％：エネルギー量; 7週齢で開始し、雄マウス（C57BL / 6J）は、通常の固形飼料（NCのいずれかに14週の間の自由なアクセスを与えられました）または高脂肪食（HFD、エネルギー含有量：55％脂肪、21％のタンパク質、および24％炭水化物...

この記事では、 顔を同時に検出し、細胞内の一酸化窒素（NO）とスーパーオキシドアニオン（O 2の可視化エンための蛍光色素ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用して適応が比較的容易な方法を記載しています.- ）は、それぞれ、肥満マウスモデルの新たに単離された無傷の大動脈です。

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

この手順の全体的な目的は、蛍光染料であるDAF-2DAおよびDHEを用い、新鮮に分離したマウスの完全な大動脈において、細胞内の一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンを同時に検出することです。この手法は、血管内皮機能不全やeNOSアンカップリングなど、心血管生理学分野の研究における解析に有用です。本技術の主な利点は、完全な血管において一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンをex vivoで直接かつ同時に検出および可視化するための、簡便で精緻な方法を提供することにあります。本プロトコルでは、37 °Cまで加熱可能で、炭酸ガスボンベからの95%酸素・5%二酸化炭素ガスでエアレーションができる臓器浴システムを構築します。まず、対象組織の浸漬に必要な量の新鮮なKrebs-Ringer重炭酸緩衝液を準備します。例えば、1回の実験で大動脈を用いる場合は200 mLが必要です。臓器浴システムを起動し、温度調節を37°Cに設定します。チャンバーをKrebs-Ringer重炭酸緩衝液で洗浄した後、各チャンバーにKrebs-Ringer重炭酸緩衝液を5mL加え、ガスを導入して95%酸素および5%二酸化炭素で30分間エアレーションします。その間、チャンバーの蓋を閉じたままにします。また、エアレーション済みの氷冷Krebs-Ringer重炭酸緩衝液をボトルで準備します。胸部大動脈を摘出した後、速やかに組織全体を氷冷Krebs-Ringer緩衝液を入れたディッシュに浸します。解剖顕微鏡下で、胸部大動脈セグメントを緩衝液に浸したまま、心臓と大動脈弓を除去します。次に、外科用はさみとピンセットを用いて、周囲の血管周囲組織を除去しながら大動脈を摘出します。続いて、ピンセットで組織の端を掴み、シリンジで氷冷したKrebs-Ringer緩衝液を注入して、血管腔内の血液を穏やかに洗い流します。血管腔内の血栓は、偽陽性のシグナルを生じさせ、蛍光シグナルを妨げる可能性があるため、完全に除去する必要があります。同時に、内皮層を損傷させないよう、洗浄の強さを調節してください。次に、洗浄した大動脈リングを3 mm間隔のセグメントに切断します。洗浄した大動脈リングの準備が完了したら、染色を行います。ピンセットで大動脈リングの外膜側のみに触れ、血管を挟み込まないように注意しながら、洗浄した大動脈セグメントを準備済みの臓器浴チャンバーに転移させます。動脈を緩衝液中で30分間平衡化させます。30分後、最終濃度が1 µMとなるようにアセチルコリンを器官浴に添加し、アセチルコリンとともに動脈を10分間インキュベートします。その間に、1.5 mLマイクロ遠心チューブを用いて、あらかじめ加温したKrebs緩衝液で1 mLの染色溶液を調製します。次に、光への曝露を最小限にするためにチューブをアルミホイルで包み、37 °Cに保持します。アセチルコリン刺激後、大動脈リングを器官浴から染色液の入ったチューブに移し、エアレーションを行いながら暗所で30分間インキュベートします。ここからのすべての工程は、光への曝露を最小限にして行ってください。次に、大動脈リングをKrebs緩衝液を満たした新しいチューブに移し、1分間保持します。この洗浄ステップを3回繰り返します。その後、大動脈リングを4%パラホルムアルデヒド溶液を満たしたバスに入れ、室温で30分間固定します。固定後、リングをDAPI溶液に移し、室温で3分間置いて対比染色を行います。その後、大動脈リングをPBSで3回洗浄し、1回あたり1分間洗います。リングを移動させる際は、内皮組織が非常に脆弱であることに常に注意してください。顕微鏡下で、マイクロサージカル鋏を用いて大動脈リングをスライドガラス上で縦方向に切断します。次に、大動脈を湿った状態に保ちながら、過剰な液体を除去します。2本のマイクロサージカルピンセットを使用し、内皮側をガラススライドに向けて、丸まった大動脈をスライド上に押し付けて平らにします。この工程では、大動脈を前後に動かさないでください。このステップは非常に重要ですが、操作が困難です。本実験の前に十分な練習を行うことをお勧めします。次に、大動脈に封入剤を滴下します。スライドガラスをカバーし、マニキュアで封止します。暗所で風乾させた後、共焦点顕微鏡を用いてスライドを撮影します。スキャン速度を200 hertz、解像度を1024 x 1024 pixels、z-stackサイズを0.25 µmに設定します。DAF-2DAを観察するには、アルゴンレーザーを使用し、励起蛍光波長を488 nanometers、放出検出波長を515 nanometersに設定します。DHEを観察するには、励起蛍光波長を514 nanometers、検出波長を605 nanometersに設定します。10倍の倍率でピントを合わせた後、対物レンズを40倍に調整します。次に、DAPI染色された核を指標として、コントロールパネルでzポジションを調整し、内皮層の範囲を決定します。その後、管腔境界の内皮層から内皮層の全厚にわたってスキャンし、画像を記録します。各サンプルについて、少なくとも3か所の異なる視野をスキャンしてください。若いC57 black 6マウスに14週間高脂肪食を投与し、肥満を誘導しました。対照群には通常飼料を投与しました。14週後、胸部大動脈を検査しました。染色の前に、組織を1 nMのeNOS阻害剤であるL-NAMEに1時間さらしました。緑色に示されるDAF-2Tのシグナルは、一酸化窒素によって非蛍光性のDAF-2から変換されたものです。したがって、染色の結果は細胞内に一酸化窒素が存在することを示唆しています。同様に、DHEはスーパーオキシドによって酸化されると赤色の蛍光信号を発します。そのため、より強い赤色を示すサンプルほど、細胞内のスーパーオキシド濃度が高いことを意味します。共焦点蛍光画像を定量化した結果、高脂肪食を投与したマウスの大動脈内皮層において、一酸化窒素の産生減少およびL-NAME感受性スーパーオキシド産生の増加が認められました。これらのデータは、肥満に伴いeNOSのアンカップリングが生じるという概念を支持するものです。このビデオを視聴することで、一酸化窒素およびスーパーオキシドアニオンの検出方法と、無処置の血管における蛍光色素の使用法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、適切に実施することで6時間で完了させることができます。この手順を行う際は、操作の全過程を通じて内皮層を損なわないようにすることが重要です。また、固定ステップに至るまで、内皮細胞の生存を維持するために、血管を常にKrebs-Ringer緩衝液に浸漬させておいてください。本手順に加えて、血管の血管運動反応の解析などの他の手法を組み合わせることで、血管緊張の調節における内皮細胞の生理学的機能といった、さらなる問いに対する答えを得ることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

電子常磁性共鳴（EPR）分光法はウシ大動脈内皮細胞および鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオ、Feを（MGD）を用いてヒト好中球からのスーパーオキシドラジカルアニオンから一酸化窒素を検出するために採用した...

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

一酸化窒素（NO）の内因性産生は、生物多様な機能を調節する。それは、NOベースのシグナリングの中断または調節不全は、多くのヒト疾患に関与していることがますます明らかになりつつあります。関連するNOの代謝産物を定量化しないための方法は、ヒトの疾患の新しい診断または予後バイオマーカーを提供することがあります。...

一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

血管細胞機能は、細胞内メッセンジャーの活性に依存します。 ここで説明するのは、単離された大動脈の個々の内皮細胞および平滑筋細胞における生理学的および薬理学的刺激に応答した細胞内カルシウムおよび一酸化窒素レベルの測定を可能にするex vivo...

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Primary Human Umbilical Vein endothelial cells...

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

マウス頸動脈および大動脈の顔面の準備を行う手順が記載されている。そのような調製物は、特異的抗体で免疫蛍光染色されたとき、共焦点顕微鏡法によってタンパク質の局在化および血管壁全体の細胞型の同定を研究することができる。...

マウスの血管の顔面準備

この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して単一細胞のNO•変動をリアルタイムで監視するための新しい遺伝的にコードされた一酸化窒素(NO•)プローブ（geNOps）の適用のためのプロトコルを提示します。個々の内皮細胞レベルでのCa2+によって誘発されるNO•形成は、geNOpsと化学的なCa2+センサーを組み合わせることによって視覚化されました。...

遺伝的にコードされた蛍光一酸化窒素の応用（•NO）シングル細胞におけるNO•信号のリアルタイムイメージングのためのプローブ、geNOps、

ここでは、マウス大様の内皮細胞を直接観察する免疫蛍光染色のためのプロトコルを提示する。この技術は、異なる流れパターンでの内皮細胞の細胞および分子表現型を研究し、アテローム性動脈硬化症の発症に有用である。...

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

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自動酸化およびニトロソ化化合物からの一酸化窒素およびその誘導体の検出のための化学発光ベースのアッセイ

スーパーオキシドアニオンの生成は、血小板の刺激に不可欠であり、調節不全の場合、血栓性疾患にとって重要です。ここでは、スーパーオキシドアニオンの選択的検出と酸化還元依存性血小板調節の研究のための3つのプロトコルを紹介します。...

血小板中のスーパーオキシドアニオン生成を検出するための代替法 

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ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

学ぶマウス大動脈における一酸化窒素とスーパーオキシドの同時蛍光検出法。DAF-2DAとDHEを用いたこの手法は、内皮機能と酸化ストレスを可視化し、心血管疾患研究に有用です。

無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

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