Name: IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶIRF3のリン酸化依存性活性化解析法。高解像度SDS-PAGEとNative-PAGEを組み合わせ、リン酸特異抗体を用いた免疫ブロットで、ウイルス感染における自然免疫応答のメカニズムを詳細に解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、プロトコルの開発について研究室の過去および現在のメンバーに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)[grant # MOP-130527]およびカナダ自然科学工学研究評議会[NSERC-355306-2012]からの資金提供によって支援されました。NGは、Tier II Canada Research Chairを受賞しています。ARは、Fonds de la recherche du Québec-Santé(FRQS)のRespiratory Health Research Networkのトレーニングプログラムから学生資格を保持しています。

<ol><li>Juang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+activation+of+interferon+A+and+interferon+B+gene+transcription+by+interferon+regulatory+factory-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).</li>
<li>Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+casein+kinase+II+phosphorylation+in+the+regulation+of+IRF-1+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity.</a> Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+interferon+regulatory+factor+3+target+genes%3A+direct+involvement+in+the+regulation+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes.</a> J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).</li>
<li>Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptors+and+the+innate+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection.</a> Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).</li>
<li>Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+antiviral+response%3A+from+viral+invasion+to+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion.</a> Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Signaling+Pathways+Leading+to+the+Phosphorylation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3.</a> J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+IRF-3+reveals+mechanism+of+autoinhibition+and+virus-induced+phosphoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystal+structure+of+IRF-3+and+its+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ser-386+of+interferon+regulatory+factor+3+as+critical+target+for+inducible+phosphorylation+that+determines+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation.</a> J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).</li>
<li>Clement, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+IRF-3+on+Ser+339+generates+a+hyperactive+form+of+IRF-3+through+regulation+of+dimerization+and+CBP+association%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association.</a> J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+interferon-regulatory+factor+3-dependent+innate+antiviral+response+by+the+prolyl+isomerase+Pin1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1.</a> Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).</li>
<li>Wathelet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+infection+induces+the+assembly+of+coordinately+activated+transcription+factors+on+the+IFN-beta+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo.</a> Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).</li>
<li>Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-3+is+an+in+vivo+target+of+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TAK1-JNK+cascade+is+required+for+IRF3+function+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response.</a> Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).</li>
<li>Solis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TBK1+and+IKKepsilon+in+lipopolysaccharide-induced+activation+of+the+interferon+response+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages.</a> Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).</li>
<li>Soucy-Faulkner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NOX2+and+reactive+oxygen+species+for+efficient+RIG-I-mediated+antiviral+response+through+regulation+of+MAVS+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).</li>
<li>Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation%2C+transactivation+potential%2C+and+proteasome-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection%3A+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP%2Fp300%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li>
<li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+%28IRF3%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP%2Fp300+without+overall+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li>
<li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li>
<li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li>
<li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+%28SOCS1%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).</li>
<li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li>
<li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+I%7Bkappa%7DB+Kinase+%28IKK%29-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1%2FIKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

私たちはここで説明するプロトコルは、IRF3の二量体/単量体とphosphoforms I〜IVを区別するためのいくつかのリン酸化抗体の使用に結合された高解像度のSDS-PAGEおよびネイティブPAGEの組み合わせで構成されます。これらIRF3の種の適切な検出が完全に特定の設定でIRF3の活性化を特徴づけるために不可欠です。例えば、活性化マクロファージのLPS刺激は、低リン酸化（II型）を示すが、（III型およびIV）過剰リン酸化はない、SDS-PAGE 15内のパターンの二量体、Ser396 / 398のリン酸化IRF3の形成につながります。記載されているプロトコルを使用して、このプロファイルは、Ser386およびSer396リン酸化10に加えて、追加のSer339のリン酸化を必要とするウイルス誘導性過リンのフォームと区別することができます。重要なことは、これはまた、二量体化を示すが、10転写活性ありませんSer396リン酸化種の間の識別ができます。イムportantlyは、IRF3のphosphoformsの形式I-IVのパターンがヒトIRF3に適用することを留意する...

<html>遍在的および構成的に発現する転写因子、インターフェロン（IFN）調節因子3（IRF3）は、主に、IFNβの誘導により、病原体に対する防御の最初の行のために重要であるが、また、ケモカイン（CCモチーフ）の誘導リガンド5（CCL5を通じて）およびIFNにより誘導されるタンパク質を含むいくつかの抗ウイルスタンパク質テトラトリコペプチドとは、IFIT1 / 2/3 1〜3を繰り返します。またはリポポリサッカライド（LPS）4：IRF3の活性化は、多数のウイルスの感染、またはポリイノシン-ポリシチジル酸（CポリI）への曝露後に報告されています。重要なことは、ほとんど研究されたウイルスは、IRF3媒介応答を回避し、それによって宿主自然免疫防御5をエスケープする機構を進化させてきました。したがって、IRF3の活性化を監視する先天的抗ウイルス宿主防御の分子機構を理解するだけでなく、この応答に対抗するためにウイルスによって使用される戦略を同定するために非常に重要です。 ENT &quot;&gt;多くの公表された報告は、しかしながら、低解像度のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に結合IRF3標的遺伝子誘導のモニタリング（IFNB1およびIFIT1）によって実行IRF3の活性化および/ ​​またはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの限定された分析を提供します（SDS- PAGE）IRF3の解析が、多数の生化学的研究は、様々なIRF3の変異体及びIRF3結晶構造6-11の解明の挙動の解析がでリン酸化により逐次翻訳後修飾の複雑なセットを施すことがIRF3を確立するために貢献しています複数のサイト。IRF3の活性化に関与するリン酸化のセットは、細胞型に刺激に依存して、最も可能性が高いと思われる。非感染細胞では、IRF3は1で、Thr135およびSer173を含むphosphoresiduesを含む非リン酸化および低リン酸化種として共存-198 AAのN末端 ​​領域6,12-14。この低リン酸化Fの蓄積IRF3のORMは、ストレス誘導物質、成長因子およびDNA損傷剤6によって誘導されます。細胞型に依存した方法で15〜17℃またはLPS：トランス活性化ドメインを含むIRF3のC末端領域におけるセリン/スレオニン残基のリン酸化は、ウイルス、ポリIによる活性化、次のトリガされます。 IRF3のC末端のリン酸化は、それぞれが二量体化、核蓄積、CREBとの会合を通じてIRF3の活性化に寄与することを二つの主クラスタ、Ser385 / Ser386およびSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405、で編成一切7未満の異なるホスホサイトを伴いません-結合タンパク質（CBP）/ P300の活性化補助因子、敏感な応答要素（ISRE）コンセンサス配列と標的遺伝子9,10,17-19のトランスをIFNするDNA結合。 Thr390のリン酸化はまた、ウイルス誘導IRF3の活性化20に寄与していると考えられます。質量分析は、Ser386、Thr390、Ser396およびSer402残基が直接phosphorylatであることを実証したIRF3の分析κBキナーゼεの阻害剤（IKKε）によりED / TANK結合キナーゼ1（TBK1）は9,10キナーゼ。 C末端残基でのリン酸化はまた、ポリユビキチン化およびプロテアソーム媒介分解10を介してIRF3活性化の終了のために必要とされます。このプロセスは、プロピルイソメラーゼPin1が10,11の募集のために必要であるSer339でのリン酸化に依存します。少なくともリン酸化Ser339 / 396分の386残基を含むIRF3種は、高リン酸化形態と考えられています。各サイトの正確な配列および機能が議論10,21の問題のまま。それは活性化したIRF3が均一な状態を表すものではありませんが、個別のリン酸化または二量体化特性を示す、異なる活性種が10,22に存在することが明らかです。 特定の病原体に応答して、IRF3の活性化の完全な理解を提供するために、それをCHする必要がありますaracterize活性種の誘導されます。 IRF3標的遺伝子、IFNB1およびIFIT1の誘導は、IRF3の活性化のための信頼性の高い読み出しを提供するように証明されています。しかし、これらの遺伝子の発現をモニターすることは、IRF3の異なる活性化状態を区別しません。特定の設定でIRF3活性化状態の包括的な分析は、そのリン酸化および二量体化状態10の詳細な特性に依存しています。非リン酸化（形態I）は、（フォームII）及び過低リン酸化（形態IIIおよびIV）IRF3形態6,18,23が正常に高解像度のSDS-PAGE分析を小さく移動度によって解決することができます。単量体および二量体IRF3種を効率的にネイティブPAGE分析によって同定することができます。異なるIRF3のホスホ部位に対して向けリン酸化特異的抗体と組み合わせて使用​​した場合、これらのアプローチは、大幅に改善されます。 標準的なプロトコルは、貧しい人々の解像度を可能にします明確なIRF3リン酸化型の効率的な分離を許可しないタンパク質です。ここでは、詳細に合計とリン酸化抗体を用いたイムノブロットとの組み合わせでネイティブ-PAGEに結合されたSDS-PAGEを使用して、個別のウイルス活性化IRF3種の誘導を監視するための最高の解像度を達成するための手順が記載されている。アクティブに異なるとの間で生体差別IRF3の形態は、SDS-PAGE上で観察され、それらの移動度シフトに基づいて行われます。また、IRF3モノマーおよびダイマーは、非変性電気泳動によって区別す​​ることができます。イムノブロットによるこれら二つの相補的な技術の組み合わせは、IRF3のリン酸化媒介活性化の完全な分析のためにすべての必要な情報を取得するための手頃な価格に敏感なアプローチであることが分かります。

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>37°Cで暖かい。使用前のCバス。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14190-144</td><td>細胞培養用。</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>仙台ウイルス Cantell Strain</td><td>Charles River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>先端の先端を切り、非常に厚いのでゆっくりとピペットします。</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール(ノニデットP-40)洗剤に対応する登録商標</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>バイオショップ</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>バイオショップ</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>オルトバナジン酸ナトリウムの活性化 0.2 M : 1) 1 N NaOH または 1 N HCl を使用して pH を 10.0 に調整します。オルトトバナジン酸ナトリウム溶液の開始pHは、多くの化学物質によって異なる場合があります。2) 溶液はpH 10.0で黄色である。3)無色になるまで煮沸します。5)pHを10.0に戻し、溶液が無色のまま10.0で安定するまでステップ3〜4を繰り返します。活性化オルトバナジン酸ナトリウムアリコートを-20°Cで保存します。.</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr>ベータ<tr><td>-グリセロリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>バイオ・ラッド Protein Assay 試薬&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>細胞 毒性</td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビスアクリルアミド (37.5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>細胞 毒性</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>ヒュームフードの下で作業します。有毒で刺激性があります。</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>刺激。</td></tr><tr><td>過硫酸アモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>毒性および刺激性。</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>ベータメルカプトエタノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M6250</td><td>ヒュームフードの下での作業。神経系、粘膜に有毒です。上気道、目、中枢神経系に有毒である可能性があります。</td></tr><tr><td>グリシンバイオ</td><td>ショップ</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>バイオショップ</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>刺激。</td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン (0.45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>酢酸氷河</td><td>バイオショップ</td><td>ACE222.4</td><td>ヒュームフードの下での作業。有毒で、刺激性があり、可燃性です。</td></tr><tr><td>レッドポンソー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P3504&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp;</td><td>イムノブロット用のPBS組成物用。</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>イムノブロット用PBS組成物用。</td></tr><tr><td>KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ></td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P0662&nbsp;</td><td>イムノブロット用のPBS組成物用。</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>イムノブロット用のPBS-T-BSA組成物用。</td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>カーネーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリソルベート 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>先端の先端を切り取り、非常に厚いのでゆっくりとピペットします。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>-20 oCで分注されたストア。 凍結/解凍を避けてください。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Home made19</td><td></td><td>Store は -80 oC で aliquoted. 凍結/解凍を避けてください。</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4947s</td> は <td>-20 oC で保存します。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Home made15</td><td></td><td>Store は -80 oC. 凍結/解凍を避けてください。</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-full length</td><td>Actif motif</td><td>39033</td><td>-80 oCでaliquoted。</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Store aliquoted at -20 oC.</td></tr><tr><td>Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini CCD camera apparatus</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>-20 oC.</td></tr></tbody></table>

irf3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

IRF3転写因子は、主にインターフェロンβと抗ウイルス遺伝子発現を通じて、病原体に対する防御の第一線にとって重要です。IRF3の活性化の詳細な分析は、病原体が自然抗ウイルス反応をどのように誘導または回避するかを理解するために不可欠です。IRF3の異なる活性化型は、リン酸化とモノマーとダイマーの状態に基づいて区別できます。IRF3の異なる活性化種間のin vivo識別は、SDS-PAGE上での移動性シフトに基づいてIRF3リン酸化型を分離することで達成できます。さらに、IRF3モノマーとダイマーのレベルは、非変性電気泳動を使用してモニターできます。ここでは、IRF3の活性化ステータスに関する最も多くの情報を取得するために、最高の解像度に到達する手順について詳しく説明します。これは、高分解能SDS-PAGEとネイティブPAGEの組み合わせと、複数の総抗体およびリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロットの組み合わせによって達成されます。この実験戦略は、IRF3のリン酸化を介した活性化の完全な解析に必要なすべての情報を取得するための、手頃な価格で高感度なアプローチです。

図2は、高解像度のSDS-PAGEによるWCEの決議後にIRF3総抗体およびSer396およびSer398に対するIRF3、リン酸化抗体を用いて検出されたIRF3の代表的なイムノブロット像を示します。刺激されていないA549細胞では、IRF3は50で二つのバンドと非リン酸化（I型）に対応し、SDS-PAGE上の53kDaの低リン酸化及び（II型）IRF3の種として検出されます。 3のためのSeVにA549細胞の曝露 - 時間依存シフトで9時間の結果が徐々に形IおよびIIからよく区別されている過リン酸化形態のIIIおよびIVを、移行します。高リン酸化バンドは55-57 kDaのに移行します。フォームIIIとIVはまた、特にSer396およびSer398に対するリン酸特異的抗体を使用して免疫検出されています。アクチンの免疫検出は、レーン間の等しい負荷の対照として働きます。センダイウイルス感染の制御は、ウイルスヌクレオPの蓄積によって示されています60kDaので移動rotein（N）、。 <p class="jove_content"...

ここでは、IRF3転写因子のリン酸化依存性活性化の詳細な分析を可能にする手順について説明します。これは、高分解能のSDS-PAGEとネイティブPAGEを組み合わせ、複数のリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロットと組み合わせることで実現されます。

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

この手順の全体的な目標は、IRF3転写因子のリン酸化依存性活性化の詳細な分析を可能にすることです。したがって、この方法は、インターフェロン媒介自然免疫応答に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。病原体がIRF3依存性インターフェロンβ発現を活性化または侵入するなど。この技術の主な利点は、異なる刺激の後に発生する可能性のある異なるIRF3活性化形態を区別するための手頃な価格で感度の高いアプローチを構成することです。この方法は、ヒト細胞のウイルス感染に関する洞察を提供しますが、他の病原体または病原体に関連する分子パターンにさらされたマウスまたはヒト組織にも適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室の 2 人の Cell Simulink 専門家である Alexa Robitaille と Melissa Mariani です。この手順で使用されるA549細胞は、摂氏37度、二酸化炭素5%の15センチメートルプレートで、完全なF-12Kハム培地で培養されます。感染の24時間前に、プロトコルテキストに記載されているように細胞をトリプシン処理し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。350 x Gで室温で3分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットを8ミリリットルの完全F-12Kハム培地に再懸濁して、均質な単一細胞懸濁液を得ます。血痕計を用いて細胞を数えた後、60ミリメートルプレートあたり10分の1から6番目の細胞の密度で細胞を播種し、予熱した完全なF-12Kハム培地を4ミリリットルに播種します。摂氏37度、5%の二酸化炭素で20〜24時間インキュベートします。20〜24時間後、細胞は90%コンフルエントな単層を形成するはずです。培地を取り出し、2ミリリットルの無血清F-12Kハム培地(SFM)で細胞を洗浄します。60mmプレートあたり2ミリリットルの新鮮なSFMを追加します。センダイウイルスを予熱したSFMで希釈して解凍し、100マイクロリットルあたり60の赤血球凝集単位(HAU)を得る。ピペッティングで優しく上下させて混合し、希釈したウイルス100μリットルを各プレートに一滴ずつ加えて、6番目の細胞に10個あたり40HAUで感染を行います。感染していないコントロールプレートにウイルスを加えないでください。インキュベーター内で細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。感染の最初の1時間の間に、プレートを手で3〜4回攪拌します。感染後2時間で、20%の熱と活性化FDSを含む2ミリリットルのF-12Kハム培地を追加し、最終濃度10%の熱と活性化FDSを取得します。インキュベーター内で細胞をさらに1時間、4時間、および7時間インキュベートして、それぞれ3時間、6時間、および9時間の合計感染時間に到達します。細胞は、次のビデオセグメントで示されるように、全細胞抽出物の調製のために、これらの各時点で回収されます。この手順は、感染培地を取り除くことから始めます。1ミリリットルの氷冷DPBSで掻き取って細胞を採取します。細胞懸濁液を予め冷却した1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。細胞を16, 000 x g、摂氏4度で20秒間遠心分離してペレット化します。そして、DPBSのすべてのトレースを慎重にデカントします。細胞ペレットを70マイクロリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。氷上で20分間インキュベートします。ライセートを液体窒素浴中で15秒間インキュベートすることにより、急速凍結します。次に、溶解物が完全に溶けるまで室温で解凍します。10秒間渦巻きます。この凍結融解渦のサイクルを3回繰り返します。16, 000 x gで摂氏4度で20分間遠心分離します。全細胞抽出物である上清を、新しい予冷済みの1.5ミリリットル遠心チューブに移します。全細胞抽出物を常に氷上に保管することが重要です。高分解能SDS-PAGEで全細胞抽出物を分離するには、IRF3型検出用の16cmゲル2個、センダイウイルスタンパク質検出用の8.5cmゲル1個、変性電気泳動ゲル3個を調製します。16cmゲル各1ウェルに14マイクロリットルの分子量標準液を入れます。次に、2つの16センチメートルゲルのウェルあたり30マイクログラムの変性全細胞抽出物をロードします。8.5センチメートルのゲルの1つのウェルに7マイクロリットルの分子量標準をロードします。8.5センチメートルのゲルのウェルあたり8〜10マイクログラムの変性全細胞抽出物をロードします。マイグレーションフロントがゲルの底に達するまで、30ミリアンペアの定電流でゲルを泳動します。技術的には、16 cmのゲルで約3時間、8.5 cmのゲルで約45分移動します。この分析は、プロトコールテキストの手順に従って、長さが8.5 cm以上の非変性分離ゲルを調製することから始めます。ランニング装置を下部チャンバー電気泳動バッファーのレベルまで氷に押し込みますが、ゲルが氷の中にないことを確認してください。ゲルを40ミリアンペアの定電流で氷上で30分間事前に分析します。プレラン中に、氷上に保持した全細胞抽出物をTwo-X Native-PAGEローディングバッファーと1対1で混合します。プレランの終了直後に、8〜10マイクログラムの全細胞抽出物をゲルにロードします。バンディングが乱されないように、サンプルをウェルの底の近くにロードすることが重要です。プレランで示したように、氷上で25ミリアンペアの定電流でゲルを泳動させ、移動面がゲルの底に達するまで泳がせます。これには約40分かかります。すべてのゲルランの完了時に、タンパク質はニトロセルロースメンブレンに移され、固定されます。転送手順は、付属のプロトコルテキストで説明されています。Native-PAGEメンブレンは除く3つのSDS-PAGEメンブレンは、赤いPonceau溶液で染色して分子量マーカーを同定します。SDS-PAGEおよびNative-PAGEの4つのメンブレンすべてをブロッキング溶液中でインキュベートした後、この図に示す順番に従って、メンブレンを一次抗体とインキュベートします。メンブレンは、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートする前に、PBS-Tで5分間の洗浄を5回行う必要があります。PBSで微量のTweenを除去した後、メンブレンを完全に覆うのに十分な量の増強化学発光試薬でメンブレンを1分間インキュベートします。濾紙を使用してメンブレンを乾燥させ、発光イメージアナライザーにセットして免疫反応性バンドを可視化します。次の一次抗体とインキュベートする前に、メンブレンをPBSで毎回5分間3回洗浄します。抗体間でストリッピングが必要な場合は、予め温めたストリッピング溶液でメンブレンを摂氏50度で20分間、定期的に撹拌してインキュベートします。イムノブロット解析の詳細については、添付のプロトコールテキストをご覧ください。ここに示されているのは、全細胞抽出物を高分解能で測定した後、Ser396およびSer398に対するIRF3総抗体およびIRF3リン酸化特異抗体で検出されたIRF3の典型的なイムノブロット画像です。刺激を受けていない細胞では、IRF3は、IRF3の非リン酸化種と低リン酸化種に対応する2つのバンドとして検出されます。センダイウイルスに細胞を曝露すると、ゆっくりと移動する高リン酸化型3型および4型に時間依存的にシフトし、これらもSer396およびSer398に対するリン酸化特異的抗体を用いて特異的に免疫検出されます。次の図は、ネイティブPAGEで分離した全細胞抽出物から得られたIRF3検出のプロファイルを示し、続いて抗IRF3 NES抗体を使用したイムノブロット、およびSer386に対するリン酸化特異抗体を示しています。刺激を受けていない細胞では、IRF3はモノメア型に対応する単一のバンドとして検出されます。センダイウイルスに感染すると、IRF3モノマーのレベルは減少し、それに伴い、二量体型のIRF3に対応するゆっくりと移動するバンドが蓄積します。これは、Ser386に対するリン酸化特異的抗体を使用して特異的に免疫検出されます。この手順を試行する際には、IRF3リン酸化型化合物の適切な分離を達成するためには、さまざまなゲルの組成と長さが重要であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、IRF3活性を評価するために、DNA結合や遺伝子レポーター酸などの他の方法を実行できます。このビデオを見た後、IRF3のさまざまなアクティブフォームを区別する方法をよく理解しているはずです。病原体を扱う作業は危険である可能性があり、操作は受入機関のバイオセーフティガイドラインに従って行う必要があることを忘れないでください。

a-high-resolution-method-to-monitor-phosphorylation-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。...

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

このビデオでは、単一分子プルダウンアッセイを用いたタンパク質リン酸化の高感度定量技術を示しています。ポリエチレングリコール-ビオチンの官能基化と標識抗体の使用により、リン酸化チロシンの検出が特異的に増加します。...

タンパク質リン酸化分析のための単一分子プルダウンアッセイ:細胞溶解物中のタンパク質リン酸化を定量するハイスループット技術

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

本研究では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 によって Rab10...

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

CAL-1血漿細胞性樹状細胞株における内因性インターフェロン調節因子5ダイアライゼーションを分析するためのネイティブウェスタンブロット法が記載されている。このプロトコルは、他のセルラインにも適用できます。...

内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

このプロトコルは、小さなDNAおよびRNA基質上のポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)のキナーゼ活性を測定するための非放射性アッセイを記述する。...

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

多機能Ser/ThrキナーゼAURKAの活性化は、Thr288の自己リン酸化によって特徴付けられます。ここでは、プローブエンジニアリングの戦略と、有糸分裂全体のキナーゼ活性化に従う迅速なFRETプロトコルを示す。...

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング

時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動細胞ベースのアッセイプロトコルは、384ウェルフォーマットの細胞溶解物中の内因性リン酸化シグナルトランスデューサおよび転写活性化剤(STAT)1/3/4/5/6タンパク質の単純、特異的、高感度、および堅牢な定量のために記載されています。...

ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。...

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

学ぶIRF3のリン酸化依存性活性化解析法。高解像度SDS-PAGEとNative-PAGEを組み合わせ、リン酸特異抗体を用いた免疫ブロットで、ウイルス感染における自然免疫応答のメカニズムを詳細に解析できます。

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

さらに動画を探す