Name: 磁気マイクロビーズ閉塞モデルマウスにおける緑内障高眼圧症依存誘導すること (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶマウス眼の前房に磁気マイクロビーズを注入して緑内障高眼圧症を誘導する方法。網膜神経節細胞死前の早期病理変化を研究し、最小侵襲で再現性のある眼圧上昇モデルを構築できます。

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著者は、デビッド・カルキンス博士(ヴァンダービルト大学)とジェームズ・モーガン博士(カーディフ大学)に、彼らの専門知識を共有し、この手順の開発に役立つアドバイスを提供していただいたことに感謝したいと思います。この研究は、カナダ衛生研究所(ADP)からの助成金によって支援されました。Y.A.I. と N.B. は、Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) からポスドク フェローシップを受けています。N.B.は、Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central(GRSNC)からH.H.ジャスパー奨学金を授与されました。A.D.P.は、Chercheur Boursier National FRQSです。

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<li>Gallego, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IOP+induces+upregulation+of+GFAP+and+MHC-II+and+microglia+reactivity+in+mice+retina+contralateral+to+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma.</a> J neuroinflammation. 9, 92(2012).</li>
<li>Rojas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+mouse+retina+contralateral+to+experimental+glaucoma+exhibit+multiple+signs+of+activation+in+all+retinal+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers.</a> J neuroinflammation. 11, 133(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).</li>
<li>Morquette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD2-mediated+inhibition+of+mTOR+promotes+dendrite+retraction+induced+by+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury.</a> Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで紹介するビデオ技術は、効果的かつ再現性のマウスにおいてIOP上昇を誘導するために、磁性マイクロビーズの房内注入を実行する方法の詳細な手順を提供します。追加の注射を必要とし、高眼圧症induction.Elevated IOPの最初の3週間以内に検出可能なRGCソーマと軸索の損失を促進しない持続的なIOPの上昇でこの手順の結果は、ヒトにおける緑内障を開発するための主要な危険因子です。したがって、これは、広範囲のアプリケーションの可能性を有している貴重なマウス眼圧症依存緑内障モデルです。 前房内にマイクロビーズの注入に関連した共通の欠点は、針が引き抜かれたとき、多くの場合、房水の流出と増加変動の唯一の部分的な閉塞をもたらす、注射部位を介して逆流をビーズに関連します。この問題に対処するには、いくつかの重要な修正が実装されました。ファーズ<html>トン、ファセットベベルときれいな、シャープなガラスマイクロニードルの入念な準備は、マイクロビーズの成功注射のために不可欠です。適切に準備されたマイクロニードルは、繊細な眼表面への圧力の最小限のアプリケーションと角膜の制御とスムーズな浸透を可能にします。小さな角膜穿刺は、マイクロビーズの逆流を防止します。また、微細なマイクロニードルは、このような非疾患関連の炎症につながる可能性があり、虹彩やレンズなどの損傷近くの構造のリスクを低減します。第二に、中および注入後の戦略眼領域へのハンドヘルド磁石の適用は、この技術の別の重要な側面です。注入中に、磁石は、マイクロニードルが引き抜かれるとき、マイクロビーズの前房防止に還流した磁気マイクロビーズを描画するために使用されます。注射後、磁石は、その後、房水の流出を阻止するために虹彩角膜角のマイクロビーズを導くために使用されます。 10トン&quot;&gt;多くの場合、マイクロビーズ閉塞モデルで遭遇する別の問題が繰り返さビーズ注射は、多くの場合、持続的なIOP上昇10,11を達成するために必要であるということである。これは、時間と虹彩角膜角から外れるマイクロビーズの結果である可能性がある。ハンドヘルド磁石の組み合わせ、上述の、および術後のマウスの位置が大幅に結果を改善する。柔軟性が処置中にヘッドを移動し、より長い術後回復期間を必要とすることができるように注射用麻酔薬の使用が有利である。の配置として操作眼は手術後の時間のカップルのための上向きを持つマウスは、虹彩角膜角でマイクロビーズの和解に寄与し、前房に戻って脱落の危険性を減少させます。 注入されたビーズの数が比較的一致していることを保証することは、動物間の変動を最小限にするもう一つの重要なステップです。マイクロビーズは、Bに落ち着くので、チューブのottomは、完全にマイクロビーズ液を均質化し、タイムリーにマイクロニードルへの適切な量を撤回する必要があります。前房への少ないビーズの注入は貧しいまたは可変IOP上昇につながる可能性がある、房水の排水構造の不完全閉塞につながる可能性があります。マイクロビーズの注入の究極の目的は、IOPを高めることであるが、目を覚ましたマウスからのIOP測定は、この研究（〜25 mmHgの）で報告されたピーク値よりも高い場合注目すべきは、注意が取られるべきです。非常に高いIOPSが虚血性損傷のリスクを増加させ、また、動物に苦痛を引き起こす可能性があります。 IOPの上昇は、手術の成功を評価するために、多くの要因の一つとして考えられるべきです。このように、手順の結果は、IOP上昇、RGCソーマ死、および軸索の損失を含むいくつかのパラメータに基づいて測られるべきです。 ここで説明するプロトコルは、ほとんどのマイクロビーズ成功したことになるが、LY角度でのセトリング、このモデルの潜在的な制限は、前房内に浮遊したまま、これらのビーズは、角膜を通してライブ網膜イメージングだけでなく、光の効果的な通過を必要とする電気生理学的または行動アッセイを妨害するかもしれないということです。このマイクロビーズ閉塞モデルを利用する際に考慮すべきもう一つの重要な側面は、IOP上昇とそれに続くRGC変性の程度は年齢や操作マウスの遺伝的背景[4]によって変化することです。したがって、IOP上昇の程度およびRGC変性のタイムラインは、それぞれ特定のトランスジェニックマウスのラインおよび/または年齢層のために決定する必要があります。 このモデルの特徴は、マイクロビーズの注入後の最初の3週間の間にRGC死が徐々に失われ、大幅なRGC死で上昇したIOPの結果は処置後3週間で検出されていることです。したがって、このモデルは、この（d）に発生する初期および/または微妙な変化の検査を可能にします前明白なRGCソーマと軸索の損失にisease、。 RGC死の有意な増加は、高眼圧症の誘導後3及び6週間の間に認められませんでした。成功したのにもかかわらず、3および6週間の間、25％とこれらの時点でのIOPの上昇を持続 - 、実際には、RGCの細胞体と軸索損失は〜22で安定していました。持続IOPの長い期間をC57BLで他のマウス系統と比較して、RGCの損傷に対してより耐性であるように見える/ 6マウスを、発生する追加のRGC喪失のために必要となる場合があります。5さらなる改変をここで紹介するプロトコルに、ビーズサイズの調整を含みますそして追加の注射は、後の時点でのRGC喪失を研究するために必要になることがあります。したがって、我々のプロトコルは、ヒトの緑内障で発症し、早期の進行に関連するささやかなRGCの神経変性と相関早期病態生理学的変化に焦点を当てた研究に最適です。

緑内障は、失明は、網膜神経節細胞（RGC）の選択的な死によって引き起こされる、緑内障患者では。2020年1によって世界中で8千万人に影響を与える進行性で不可逆的な盲目状態であるから、視覚情報を伝達する出力ニューロン脳へ網膜。緑内障は、最も一般的な眼内圧上昇（IOP）である、多くの危険因子を有する年齢関連神経変性疾患です。確かに、IOPは緑内障でのみ修正可能なリスク因子であり、現在の治療法は、眼圧を管理するだけに焦点を当てます。しかし、複数の、遺伝的な細胞、および環境要因が、この疾患の発症および進行に影響を与えます。したがって、最終的には神経細胞死に貢献するさまざまなメカニズムを理解することは、緑内障のための有効な治療法を開発することが不可欠です。 緑内障の動物モデルは、疾患の病態生理を研究すると識別するために不可欠であるとテスト有望な治療薬。遺伝的にコード化された蛍光トレーサーを運ぶ条件付きノックアウト株とマウスを含むトランスジェニックマウス系統の可用性を高めるには、誘導性マウス緑内障モデルの必要性を推進しています。緑内障のいくつかのげっ歯類モデルは、（2,3に概説）、長年にわたって開発されてきました。これらのモデルの多くでは、緑内障は、眼圧の上昇が生じ、房水動態を破壊することによって誘導されます。マイクロビーズまたは他の物質が水性排出を遮断するために、眼の前房に注入された閉塞モデルは、IOP 4-14を増加させるために部分的にそれらの相対的な容易さ、近年人気を集めています。 最初の霊長類12で行わ緑内障のマイクロビーズ閉塞モデル、ウサギ8、およびラット4,9,11は 、最近マウス5,6,10における使用のために適合させました。これらの研究では、ポリスチレンマイクロビーズの房内注射、単独で、または中粘弾性材料との組み合わせが、その後のRGC死6,10につながるIOP上昇をもたらしました。しかし、針が虹彩角膜角からマイクロビーズの目と脱落から引き抜かれ還流が処置中に発生する一般的な問題です。これらの欠点を最小限に抑えるために、磁石は、眼4,9の隅角に磁性マイクロビーズを引き付けるために使用されています。 ここで説明するプロトコルは、磁性マイクロビーズとマウスの眼（ 図1）に適合した携帯型マグネットを使用した以前の研究9,10に基づいて修正された手順です。いくつかの重要な変更は、マウスにおいて効果的かつ再現性のIOPの増加を確保するために、私たちのプロトコルで導入されています。まず、マイクロビーズの注入は、ファセットベベルで慎重に準備したガラスマイクロニードルを使用して行われます。マイクロニードルの結果の滑らかな表面だけでなく、その鋭利な先端は、最小限の被害であることを保証しますそれは角膜を穿刺として与えました。マイクロニードルの先端部は、それによってそのような絞りやレンズなどの損傷近くの構造のリスクを減少させる、前房に入ると、このガラスマイクロニードルの使用はまた、増加した制御をもたらします。また、小さな注射病変は、角膜の自己修復を容易にし、不要な傷害関連の影響を低減します。 第二に、磁性マイクロビーズの注入およびハンドヘルド磁石の使用は、正確な制御が小さなマウスの眼の虹彩角膜角にビーズを誘致することができます。このマイクロビーズのサイズが用意したマイクロニードルの開口部を詰まらせ、重要なのは、1回注射しなかったため、直径4.5ミクロンを使用したある磁性マイクロビーズは、これらのマイクロビーズは効果的房水の排出を阻止しました。このアプローチは、注入されたマイクロビーズの逆流を減少させるだけでなく、マイクロビーズの最大数を効果的に房水の排出をブロックするために標的領域に蓄積することを保証するだけでなく。 Furthermoreが、この戦略はまた、絞りやレンズのような他の構造との接触を回避する前房内に浮遊するビーズの数を減少させ、後部チャンバーに通過を阻止します。まとめると、これらの変更は、マイクロビーズの注入手術が比較的容易にし、マウスでの高眼圧症の非常に、再現性の効果的、かつ持続的な誘導が得られ適時に行われていることを確認してください。

<table><tbody><tr><td>プー</td><td>ラーNarishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ガラス毛細管</td><td>世界の精密機器</td><td>TW150F-4</td><td>毛細管は、外径1.5mm、内径1.12mm、</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイ</td>ス<td>MZ9.5</td><td>ズームファクター範囲2.5〜6.0です。針作りやマイクロビーズ注射手術に使われる顕微鏡です。</td></tr><tr><td>フットスイッチ</td><td>ラインマスター</td><td>T-91-SE</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製ブレード</td><td>フェザー</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ電極ベベラー</td><td>科学製品</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾル ダスター</td><td>フィッシャー</td><td>23-022-523</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>ダイナビーズM-450エポキシ</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー14011</td><td>磁気ビーズは4.5&microです。直径はm。ストック溶液の濃度は4 x 108ビーズ/mlです。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>ミニチューブローテーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-450-127</td><td></td></tr><tr><td>3 ハンドヘルドマグネット</td><td>Geomag</td><td></td><td>0.45 テスラ。マイクロビーズの調製やマイクロビーズ注入手術に使用するマグネットです。</td></tr><tr><td>25 ml 血清学的ピペット</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ドラモンド</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>生物学的封じ込めフード</td><td>Biostad</td><td>377355</td><td></td></tr><tr><td>平衡塩溶液 (BSS)</td><td>アルコン</td><td>0065-0800-25</td><td></td></tr><tr><td>P1,000 マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 ml</td><td>ザルスタット</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>P200 マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72737.002</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td></td><td></td><td>規制物質</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル ヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセプロマジン</td><td>ベトキノール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-100 インスリン注射器</td><td>ベクトン ディキンソン アンド カンパニー</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>バランス</td><td>Ohaus</td><td>CS 200</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td></td><td></td><td>規制物質</td></tr><tr><td>トロピカミド 点眼液</td><td>アルコン</td><td>0998-0355-15</td><td>1% ミドリアシル</td></tr><tr><td>手動マイクロシリンジ ポンプ デジタル ディスプレイ付き</td><td>ワールド プレシム インスツルメンツ</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>手動マイクロマニピュレーター ワールド プレシム</td><td>インス</td>ツルメン <td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>プラットホーム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-673-52</td><td>8 x 8インチ</td></tr><tr><td>吸収性綿棒</td>ケ<td>ッテンバッハ</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>P20マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック鉗子</td><td>ユーロバンド</td><td>1001</td><td>鉗子がプラスチックであり、目のフル</td></tr><tr><td>オロキノロン眼科溶液</td><td>アルコン</td><td></td><td>の損傷を避けるために平らな表面を持っていることを確認してくださいVigamox</td></tr><tr><td>加熱パッドSunbeam</td><td></td><td>E12107-834</td><td></td></tr><tr><td>眼圧計</td><td>iCare</td><td>TV02</td><td>TONOLABリバウンド眼圧計&nbsp;</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、パラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>解剖ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スモールブラシ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr>カ<tr><td>コジル酸ナトリウム、トライハイドレート</td><td>CanemcoおよびMarivec</td><td>124-65-2</td><td></td></tr><tr><td>Brn-3a抗体(C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-31984</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート、48 ウェル</td><td>ファルコン</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 594 コンジュゲート</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-11058</td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>スローフェード ゴールド 退色防止試薬</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ S36936</td><td></td></tr><tr><td>カバー ガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 2% 水溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>3294949</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>無水コハク酸ドデセニル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>無水ナディックメチル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>酸化プロピレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205-1L</td><td></td></tr><tr><td>金型の埋め込み-Dykstra</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>ポーター・ブルム超ミクロトーム</td><td>ソルバル</td><td>MT-2</td><td></td></tr><tr><td>トルイジン ブルー O (認定生物学的染色)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>T161-25</td><td></td></tr></tbody></table>

磁気マイクロビーズ閉塞モデルマウスにおける緑内障高眼圧症依存誘導すること

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

緑内障のげっ歯類モデルの使用は、この多因子性神経変性疾患の病態生理学の根底にある分子機構を理解するために不可欠でした。多数のトランスジェニックマウス系統の出現により、高眼圧症の誘導マウスモデルにおける関心が高まっています。ここでは、ファセットベベルで修飾されたマイクロニードルを使用して、眼の前房への磁性マイクロビーズの注入に基づいて、緑内障の閉塞モデルを提示します。磁性マイクロビーズは、前房からの房水の排出を遮断するために、ハンドヘルド磁石を用いた虹彩角膜角に魅了されています。ヒトの緑内障患者で観察されるように、その後、網膜神経節細胞の喪失につながる眼圧の安定した高さの水力学におけるこの混乱。この原稿で提示マイクロビーズ閉塞モデルも非常に他の誘導性緑内障のモデルと単純な比較され、効果的かつ再現可能。重要なことは、ここで提示さの変更は、多くの場合、閉塞モデルで発生する一般的な問題を最小限に抑えることができます。まず、面取りガラスマイクロニードルの使用は、マイクロビーズの逆流を防ぎ、傷害関連の影響を低減し、最小限のダメージが注入時に角膜に起こることを保証します。第二に、磁性マイクロビーズの使用は、効果的に他の構造（ 例えば 、虹彩、レンズ）との接触を回避する前房内に浮遊するビーズの数を減少させる、虹彩角膜角に最もビーズを引き付ける能力を確実にします。効率的に磁性マイクロビーズを指示し、マイクロニードルが引き抜かれるときに、目からマイクロビーズの小さな逆流があることを確認するために、小さなマウスの眼を取り扱う際は最後に、ハンドヘルド磁石の使用は柔軟に行うことができます。要約すると、ここで紹介するマイクロビーズ閉塞マウスモデルはglauの発症および進行中に発生する神経変性変化を研究するための強力な調査ツールです。コマ。

このプロトコルで説明成体マウスの前房内への磁性マイクロビーズの注入は、IOPの堅牢性と再現性の上昇をもたらしました。 、*** P &lt;0.001;一週間処置後、IOPは、高血圧の目には19±0.5ミリメートルHgの（スチューデントのt検定、10±0.6ミリメートルHgの（平均±SEM）、反対側の眼の平均ベースラインIOPから増加しましたN = 12、 表1、図2）。 IOPは、最長の時点では、本研究で検討し、その後安定し、少なくとも6週間は20ミリメートルHgの平均で上昇したままでした。手術後2、3、および6週目のマイクロビーズを注入した目で平均ピークIOPは、25ミリメートルHgのでした。処置したマウスの大部分は、したがって、このプロトコルは、マイクロビーズの目の注射を必要としない、持続的な高IOPを開発しました。 このモデルではRGC損失の経時変化を評価するために、RGCソーマがありました最初Brn3a、RGC特異的マーカー17を用いた免疫染色によって定量しました。 Brn3a陽性細胞の数は、高眼圧症の誘導後1,2,3、及び6週目にフラットマウント網膜上で定量しました。重要なIOP上昇は、マイクロビーズ、注射後早ければ1週間として検出されたが、RGCソーマの有意な損失は（ 図3）手順の最初の2週間以内に観察されませんでした。実質的なRGC死（22％）、しかし、3週間後に明らかであった（2430±67のRGC / mm 2であり、平均±SEM、N = 12）と6週間（2350±74のRGC / mm 2であり、n = 10）後非手術マウスから無傷の対照眼と比較して、高眼圧症の誘導、（3141±49のRGC / mm 2であり、n = 23）（ANOVA、P &lt;0.001）。 RGC軸索の機能不全および変性は緑内障の基本的特徴です。したがって、軸索損失はマイクロビーズの注入による後3および6週間後に検査しましたトルイジンブルーで染色し、視神経の断面におけるRGC軸索の定量化（ 図4）。 RGC軸索の実質的な損失（25％）は、3週間で観察された（平均±SEM 28401±702軸索/神経、N = 5）、6週間（29426±948軸索/神経、n = 6）がマイクロビーズの注射後非手術眼（39467±137軸索/神経、N = 4）（ANOVA、P &lt;0.001）から無傷の視神経に比べて。まとめると、これらのデータは、マウスの前房への磁性マイクロビーズの注入が再現可能につながり、RGCソーマと軸索変性をもたらすIOP上昇を持続することを示しています。 <table><tbody><tr><td colspan="2"> OHT手術後の時間 </td><td> N </td><td colspan="3"> IOP（mmHgの）平均±SEM </td><td colspan="2"> ピークIOP（mmHgで） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>反対側の</td><td>緑内障</td><td>ディfference </td><td>反対側の</td><td>緑内障</td></tr><tr><td colspan="2"> 1週間</td><td> 12 </td><td> 10±0.4 </td><td> 19±0.5 </td><td> 9±0.6 </td><td> 12±0.4 </td><td> 22±0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2週間</td><td> 13 </td><td> 11±0.5 </td><td> 20±0.8 </td><td> 9±0.5 </td><td> 12±0.9 </td><td> 25±0.7 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3週間</td><td> 10 </td><td> 11±0.8 </td><td> 20±0.7 </td><td> 10±0.9 </td><td> 13±0.2 </td><td> 25±0.9 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6週間</td><td> 12 </td><td> 12±0.5 </td><td> 20±0.6 </td><td> 9±0.7 </td><td> 13±0.5 </td><td> 24±0.6 </td></tr></tbody></table> ネズミ磁気マイクロビーズOcclusiにおける眼圧の表1標高モデルに。アウェイク雌C57 BL / 6マウスでは、IOPを較正リバウンド眼圧計を用いて測定しました。オペ目は手続き後少なくとも6週間は上昇したまま1週間後の手術で検出されたIOPの増加を示しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig1.jpg" /> 緑内障のマウス磁気マイクロビーズ閉塞モデルに含まれるステップの図1.ワークフロー。中に、前に実行されたすべての手順をステップバイステップのアウトラインは、手術後。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig2.jpg" /> ネズミ磁気マイクロビーズ閉塞モデルにおける眼圧図2.増加。目を覚まして雌のC57 BL / 6マウスは、IOPを較正リバウンド眼圧計を用いて測定しました。マイクロビーズを注射した眼のIOPには有意に1週間の術後（ANOVA、P &lt;0.001）で上昇しました。 IOPSが大幅に少なくとも6週間（ANOVA、P &lt;0.001）のために注射したマウスの反対側の眼に比べて上昇したままでした。 （インタクト：N = 12; 1週間：N = 12、2週間：N = 13、3週間：N = 10、6週間：N = 12）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig3.jpg" /> ネズミ磁気マイクロビーズ閉塞モデル。RGCを図3.網膜神経節細胞死を誘導するためにマイクロビーズ注入後3,6週間で無傷のコントロール網膜（A）および緑内障網膜でBrn3aを用いた平面実装型網膜の免疫染色により可視化しました高眼圧症（OHT）（B、C）。スケールバー：20μmです。 （D）定量分析手順が目を制御するために比較した後、マイクロビーズの注入が3と6週目に有意なRGCソーマ損失をもたらしたことを確認しました。無傷の、非緑内障性C57 / BL6マウスにおけるRGCの細胞体の密度は、基準（白色バー、100％の生存率）として示されています。 N = 23; 1週間：値は、SEM（無傷の平均±として表現さ​​れたn個= 6、2週間：N = 6、3週間：N = 12、6週間：N = 10、ANOVA、*** P &lt; 0.001）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig4.jpg" /> ネズミ磁気マイクロビーズ閉塞モデル図4.軸索変性。RGC軸索は、中のトルイジンブルーで視神経断面の染色により可視化しましたマイクロビーズの注入後3,6週間で無傷対照（A）及び緑内障網膜は眼圧症（OHT）（B、C）を誘導します。スケールバー：10ミクロン。 （D）定量分析手順が目を制御するために比較した後、マイクロビーズの注入が3と6週目に有意なRGC軸索の喪失をもたらしたことを確認しました。無傷の、非緑内障性C57 / BL6マウスにおけるRGC軸索の密度は、基準（白色バー、100％の生存率）として示されています。値の平均±SEMとして表されている（インタクト：N = 4; 3週間：N = 5、6週間：N = 6、ANOVA、*** P &lt;0.001）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a>

ここでは、緑内障に観察される網膜神経節細胞の損失をもたらすマウスの眼の高眼圧症を誘発するためのプロトコルを提示します。磁性マイクロビーズは、前房に注入し、房水の流出を阻止するために磁石を使用して、虹彩角膜角に引き寄せられます。

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

この手術手順の全体的な目的は、マウスの眼前房に磁性マイクロビーズを注入することにより、眼圧上昇依存性の緑内障を誘発することです。この手法は、明らかな網膜神経節細胞の死に至る前に、眼内でどのような早期病理学的変化が起こるかなど、緑内障分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、手術中の眼への損傷を最小限に抑えつつ、眼圧を確実に上昇させることができる点にあります。この手法に不慣れな人は、マイクロニードルの準備不備や位置決めが不適切であるために、注入時に角膜の穿刺に苦労したり、水晶体などの近接組織を損傷させたりすることがあります。まず、キャピラリープラーを用いて、Bohrホウケイ酸ガラスキャピラリーからマイクロニードルを形成します。顕微鏡下で鋭利なブレードを使用し、マイクロニードルの先端に慎重に開口部を作成し、先端が長軸径約190 micrometers、短軸径約70 micrometersの楕円形になるようにします。マイクロピペットのベベリングシステムにおいて、マイクロニドルの開口部がベベリングプレートに接するように、プレートに対して20度の角度でマイクロニドルを配置します。エッジが平坦で滑らかになるまで、水を数滴滴下しながら約10分間ベベリングを行います。次に、ニドルを回転させて開口部を囲む2つのエッジをベベリングし、マイクロニドルの先端を鋭く仕上げます。次に、エアダスターを用いて、マイクロニードルの先端開口部からすべてのゴミと水分を取り除きます。完成したマイクロニードルを顕微鏡で注意深く検査してください。破損しているマイクロニードルは廃棄します。以下の手順を完了するには2人の担当者が必要です。特定の操作を特定の担当者が行う場合は、「担当者1」または「担当者2」として指示されます。テキストプロトコルに従って磁性マイクロビーズ溶液を調製してください。覚醒状態のマウスの基線眼圧（IOP）を測定するには、耳の間の皮膚を軽く保持してマウスを優しく固定します。マウスをベンチトップに置き、動物が快適で眼にアクセスしやすい状態にします。角膜にプロパラカイン塩酸塩を1滴点眼し、トノメーターを角膜表面に対して垂直に保持して、1眼につき10回連続の測定を少なくとも3セット行い、IOPの平均値を算出します。次に、テキストのプロトコルに従ってマウスを麻酔し、ブプレノルフィンを体重1kgあたり0.05mg皮下投与します。次に、注射中のマイクロニードルの位置を確認しやすくするため、トロピカミド点眼液を投与して瞳孔を散大させます。処置中の角膜の乾燥を防ぐため、対側眼に外用軟膏を塗布します。ここで、滅菌済みのマイクロニードルをマイクロシリンジポンプの注入アセンブリに取り付けます。次に、麻酔したマウスを手術台に移動させます。顕微鏡下で、瞳孔が十分に散瞳し、眼筋が弛緩して眼球運動がないことを担当者1に確認させ、処置中の安定性を確保します。吸収性スワブを用いて、眼に点眼したトロピカミドをそっと拭き取ります。担当者2に、ピペッティングを繰り返して磁性マイクロビーズ溶液を混合させます。次に、マイクロシリンジポンプを用いて、均質化した磁性マイクロビーズ溶液 1.5 µL をマイクロニードルに充填します。このとき、マイクロニードルの先端に気泡が入っていないことを確認してください。可能な限り速やかに、角膜輪部に対して前方45度の角度で針を配置します。操作者1はプラスチックピンセットで眼球を支持し、マイクロニードルとプラスチックピンセットの間の角度を約90度に保ちます。操作者2はマイクロシリンジポンプを使用し、装填したマイクロニードルで角膜を緩やかに穿刺し、水晶体、虹彩、および後房を避けながら、マイクロニードルの先端を前房内に挿入します。マウスの頭を動かさない状態で、助手1に針先の反対側の目の横にマグネットを配置させます。これは、磁性マイクロビーズを前房内に誘引し、ビーズが角膜の内面に接触することを最小限に抑えるためです。助手1にマグネットを持たせたまま、助手2がマイクロシリンジポンプを用いて、15～30秒かけて磁性ビーズ溶液1.5 µLを前房内に注入します。ビーズの全量を注入し終えたら、マイクロニードルを眼からゆっくりと抜きます。マイクロビーズの逆流を防ぐため、担当者1にさらに30～60秒間、眼の横に磁石を保持させ、ビーズを前房内に引き寄せます。その後、磁石を用いてビーズを虹彩角膜隅角へ誘導します。この際、ビーズが付着する可能性がある角膜内面に引き寄せられないよう注意してください。ビーズが前房の円周上に均等に分布してリング状に配置されていることを確認します。その後、感染リスクを最小限に抑えるため、処置した眼に抗菌点眼薬を投与します。マウスをヒートパッドの上で完全に目覚めるまで回復させます。その際、感染を防ぎ、またビーズが角膜の内表面に蓄積するのを避けるため、処置した眼を上に向けて保持してください。少なくとも2日間の回復期間を経た後、ビデオの前半で示した方法でIOPを測定し、週に1回以上、または必要に応じて、一日のうち同じ時間帯にモニタリングを行います。結果はテキストプロトコルに従って解析してください。本プロトコルで説明した成マウスの前房への磁性マイクロビーズの注入により、強固で再現性のあるIOPの上昇がもたらされました。ここで示されているように、処置の1週間後、高血圧眼におけるIOPは、ベースライン平均の10 ± 0.6 mmHgから19 ± 0.5 mmHgに上昇しました。この表は、その後IOPが安定し、本研究で検討した最長期間である少なくとも6週間にわたって、平均20 mmHgの高値で維持されたことを示しています。手術後2週、3週、および6週時点でのマイクロビーズ注入眼における平均ピークIOPは25 mmHgでした。網膜神経節細胞（RGC）の消失を評価するため、眼高血圧誘導後1週、2週、3週、および6週における網膜フラットマウント標本のBRN-3A陽性細胞数を定量化した。1週時点で有意な眼圧（IOP）上昇が検出されたものの、最初の2週間ではRGC細胞体の有意な消失は観察されなかった。しかし、術後3週および6週では、有意な細胞死が観察された。この図では、トルイジンブルーで染色した視神経の横断面において、正常な視神経と比較して3週目および6週目にRGC軸索の大幅な消失が認められ、この手術が緑内障で見られるような軸索消失を引き起こすことが示されています。習熟すれば、マウス1匹への注入は15分で完了します。この手順を行う際は、前房に注入されるマイクロビーズの数が同一になるよう、適切な措置を講じることが重要です。これにより、個体間で生じうるばらつきを抑えることができます。ビデオを視聴することで、マウスの眼前房に磁気マイクロビーズを注入し、眼圧亢進を誘発する方法について十分に理解できるはずです。

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