Name: 定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぶ、フィルター法によるN-グリカンとタンパク質の同時精製とLC-MS/MSを用いた定量法。がんと対照群の正確な比較定量が可能となり、グリコミクスとプロテオミクスの統合的研究に貢献します。

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この研究は、NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02)、NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776)、US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020)、W.M. Keck Foundation、およびノースカロライナ州立大学から寛大に資金提供されました。雌鶏の血漿は、ノースカロライナ州立大学家禽科学部のジェームズ・N・プティット博士とレベッカ・ワイソッキー博士の協力を得て入手しました。

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+carbohydrate+determinants+in+regulating+hemostasis%3A+insights+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities.</a> Blood. 121, 3801-3810 (2013).</li>
<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
<li>Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and glycomics.</a> Omics. 14, 401-418 (2010).</li>
<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glycopeptides+for+glycan+structure+and+attachment+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification.</a> Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).</li>
<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
<li>Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+LC-MS%28n%29%3A+technical+design+and+applications+to+peptide+and+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein.</a> J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).</li>
<li>Apweiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniProt%3A+the+Universal+Protein+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">UniProt: the Universal Protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).</li>
<li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).</li>
<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
<li>Kronewitter, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+retrosynthetic+glycan+libraries+to+profile+and+classify+the+human+serum+N-linked+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome.</a> Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).</li>
<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

私たちはケンブリッジ同位体研究所(CIL)と協力関係を結んでおり、P2GPN試薬と技術を製品(GTK-1000)の形でより広範な科学コミュニティに普及させています。 ただし、本商品の販売による収益は一切得られません。

ルーチンの糖鎖分析を容易にするには、ハイスループットの定量法が必要です。過去 30 年間、グリコミクス分析は、疾患、臨床応用、医薬品における重要性にもかかわらず、研究グループのサブセットに限定されてきました。グリコミクスおよびプロテオミクス用のFANGS-P2GPN精製およびタグ付け法は、サンプルの1つのアリコートに対して同じ分析を実行するため、供給コストと必要な材料の量が削減されます(特にヒトおよびマウスの研究で重要です)。さらに、追加のステップごとにエラーの一因となり、症例対照研究における重要ではあるが存在量の少ない変化が隠蔽される可能性があるため、調製のばらつきを最小限に抑える取り組みが非常に重要です。FANGSを疎水性ヒドラジドタグ付けに結合させることで、タンパク質サンプルと糖鎖サンプルを同じRPLCカラムで実行でき、糖鎖イオン化が促進され、相対的な定量が可能になり、血漿に定量的に適用できます。
N-糖鎖分析では、完全な脱グリコシル化を達成するために、推奨レベルのPNGase Fを使用することが重要です。糖鎖は溶媒にさらされますが、タンパク質の変性と過剰な酵素により、効率的かつ完全な切断が保証されます。糖鎖を正確に定量するには、誘導体化後に糖鎖を完全に乾燥させて反応を消光し、NAT種とSIL種を混合する際の交差反応を防ぐ必要があります。最後に、ワークフローをグリコサイト分析に拡張する場合、非特異的脱アミド化を最小限に抑えるために、ステップのタイミングが重要です。グリコミクスとプロテオミクスを組み合わせた分析のために提供された修正プロトコルは、それに応じて実行された場合に一貫して機能します。
このワークフローでは、ゴールドスタンダードの SPE 法と比較して、血漿からの N 型糖鎖の正確な相対定量が達成されます。抽出された糖鎖の種類には、分子量、親水性、組成構造の点で明らかな偏りはありません。O結合糖鎖の定性分析は調査していませんが、FANGSは、N結合糖鎖のPNGase F消化後のβ脱離ステップの追加に対応できると期待しています。ただし、手順では、質量分析の前に試薬のクリーンアップに大幅な変更が必要となり、ペプチド分析に大きな影響が及びます。プロテオミクスの場合、従来のFASP法と比較して、同じ深さのプロテオームカバレッジが達成されます。重要なのは、このメソッドが N-糖鎖脱アミド化の誤発見率を最小限に抑えることです。この方法は、PNGase消化ステップ22,23中のAsnの18O標識と互換性がありますが、グリコシル化部位の誤発見率が低いため、必要ではない可能性があることを示唆しており、コストと複雑さがさらに軽減されます。
この方法では、プロテオームは糖タンパク質に富んでおらず、長所と短所の両方があります。特定の低存在糖タンパク質は分析で検出されない場合があります。ただし、タンパク質あたりのグリコシル化部位の占有率は、生物学的サンプル間で比較できます。さらに、レクチン親和性精製または化学的濃縮によってもたらされるエラーとバイアスが排除されます。結論として、糖鎖ヒドラジドタグ戦略で標識する際の個体性正規化にFANGSを結合すると、グリコームとプロテオームのタンデム分析のための簡素化された定量的ハイスループット方法が得られ、臨床症例対照研究への応用に大きな可能性を秘めています。

プロテオミクスの分野では、フィルタ支援試料調製（FASP）が広く、出発材料の量を最小化する試料調製のアーティファクトを減少させる、およびサンプルスループット1を最大化する能力のために採用されています。しかしながら、このような方法は未だ出現し、グライコミクスの分野のための牽引力を獲得しています。高スループットの開発は、定量的なワークフローがあるため生体防御および癌または疾患2,3によってその変調におけるグリコシル化の重要な役割で必要とされています。哺乳類では、N個の -glycansは、コア構造を飾る糖単位（ヘキソース（16進数）、ヘキソサミン（のHexNAc）、シアル酸（NeuAcで）、およびフコース（Fucは））、（16進数3のHexNAc 2）4共有結合した繰り返しで構成されていますアスパラギンへ。異性体がカウントされるときglycospaceがかなり大きいですが（&gt; 10 12）、それは、組成に基づいて非常に小さく、分子量は、典型的には1,000-8,000ダ5 &lt;範囲/ SUP&gt;。クラスの組成均一性およびグリカンの親水性は、精製、分離、および質量分析（MS）ワークフロー6に特有の課題を提起します。 伝統的には、Nの -glycansはF（PNGアーゼF）は、ペプチドのNによるタンパク質またはペプチドから-glycosidase消化され、次いで、ヒドラジドビーズ8によって、レクチンアフィニティークロマトグラフィー7によって濃縮捕捉、または固相抽出（SPE）9,10を介して精製しました。これらの方法は全て非常に有効であるが、これらは、脱塩のための余分な工程を導入し、同時に処理されたサンプルの数を制限します。過去10年間、グライコミクスのためのハイスループットプラットフォームの数が提案されています。 Kim らは、真空操作、SPE 96ウエルプレート11を用いて、半自動化された方法を発表しました。また、アフィニティーフィルター法は、（N -glyco-FASP）をFi接続の初期誘導体化を必要とマン・グループ、によって開発されましたレクチン12の合成とLTER。最後に、トーマス・オーツのグループは、半定量法、glycospace 13の狭い組成サイズを悪用フィルター支援N -Glycan分離（牙）を、提案しました。分子量カットオフフィルターに依存する、小さな汚染物質が第一無駄に洗浄し、次いで、N個の -glycansを消化し ​​、溶出しました。脱グリコシル化タンパク質は、このプロトコルでフィルター上に残存すると、インラインFASPに供することができます。 エレクトロスプレーイオン化（ESI）MSによる同定およびグリカンの定量化は、異性体および低豊富な種の検出のための誘導体化の（部分的な）解決のためにオフライン分離を必要とします。個性で標識グリカンヒドラジドタグ戦略正規逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）14,15との互換性を与えます。 4フェネチル - ベンゾヒドラジド（P2PGN）疎水性タグはENH、グリカンの親水性を仲介します、平均して、4倍の16でイオン化をancing。容易な条件で化学量論的に1：例えば過メチル化17またはアミン反応性タグ付け化学18のような他の技術が、同様の利点を提供するが、ヒドラジド反応において、グリカンは1を反応させます。相対的定量化は、天然の（NAT）または13 C 6安定同位体ラベル（SIL）で誘導体化された試料のタンデム分析によって達成されます。 以下の方法は、正確な相対的定量化のためのP2GPN疎水性タグにプラズマアプリケーションやカップル、それをするための牙を展開します。更に、分析の完全性を損​​なうことなく、サンプルの単一のアリコートにショットガンプロテオミクス、脱アミド化プロファイル、および定量的グライコミクスを実行するように設計されました。

<table><tbody><tr><td>酢酸(50%)</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、HPLC グレード</td><td>バーディック &ジャクソン&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Σ アルドリッチ&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>Σ アルドリッチ&nbsp;</td><td>B6916</td><td>代替品:ビシンコニン酸キット(Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>14,000 x gに達する代替遠心分離機が適切な</td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール、1&nbsp;溶液中のM</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>代替ナノまたは超高圧LCは、次のような同様のデータを生成します: 1. Dionex UltiMate&Ograve; 3000 LC (Thermo Scientific);2. Acquity UPLC(ウォーターズ)。</td></tr><tr><td>フローティングチューブラック</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーサイエンティフィック アイソテンプスタンダードラボオーブン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-690-625F</td><td>56&nbspに達する代替インキュベーター;&deg;Cは</td></tr><tr><td>適切なギ酸</td><td>シグマアルドリッチ&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE 電子レンジ</td><td>ゼネラル・エレクトリック</td><td>57B5 E82904</td><td>調整可能な電力設定の電子レンジは、</td></tr><tr><td>INLIGHT Glycan Tagging Kitに適しています&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>INLIGHTキットは、P2GPN試薬のNATおよびSILバージョンを提供します。</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &Aring;, C18バルク固定相</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>バルクメディア</td><td>の代替品:任意のC18固定相5&nbsp;mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon Software and Server</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>メタノール、HPLC グレード</td><td>Burdick &ジャクソン&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit セルフパックコラム 360&nbsp;&#956;メートル、OD 75&nbsp;&#956;m ID, 15&nbsp;&#956;mチップ、コーティングなし、5個入り/箱、50cm</td><td>New Objective</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F(グリセロールフリー)、75,000&nbsp;単位/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF ハイブリッド四重極-Orbitrap 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Alternate 高質量精度 (5&nbsp;ppm)質量分析計は、同様のデータ</td></tr><tr><td>を提供します RNase B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (豚膵臓</td><td>Sigma Aldrich) &nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ アルドリッチ&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>真空濃縮器Savant SPD131DDA SpeedVac 濃縮器</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>代替真空濃縮器は</td></tr><tr><td>Vivacon 500 30 kDaフィルターに適しています&nbsp;</td><td>ザルトリウス・ステディム・バイオテック</td><td>VN01H22</td><td>代替品:アミコン ウルトラ0.5遠心フィルターユニット(ウルトラセル-10付き)&nbsp;kDaメンブレン(ミリポアUFC501096)</td></tr><tr><td>水、HPLCグレード</td><td>バーディック&ジャクソン&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>水、18O</td><td>ケンブリッジ同位体研究所</td><td>OLM-240-97-1</td><td>PNGase F消化ステップでの18Oの追加はオプションであり、95%の信頼度で完了した脱アミド化研究には必要ないかもしれません</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

生物学と臨床科学では、複数のクラスの生体分子を統合し、相関させて生物学を解明し、経路を定義し、治療を改善し、病気を理解し、バイオマーカーの発見を助けるという欲求が高まっています。N-結合型グリコシル化は、タンパク質に対する最も重要で堅牢な翻訳後修飾の1つであり、シグナル伝達、接着、酵素機能などの重要な細胞機能を調節します。N型糖鎖を精製および分析するための分析技術は、過去10年間、比較的静的なままでした。正確で効果的である一方で、一般的には多大な専門知識とリソースが必要です。ハイスループット精製スキームはいくつか開発されていますが、まだ広く採用されておらず、多くの場合、糖ペプチドの濃縮に依存しています。Thomas-Oatesらが開発した有望な方法の1つである、フィルター支援N型糖鎖分離(FANGS)は、組織上で定性的に実証されました。ここでは、FANGSを血漿に適合させ、糖鎖ヒドラジドタグ法による標識時の個別正規化と組み合わせたことで、液体クロマトグラフィー質量分析による正確な相対定量とエレクトロスプレーイオン化の向上を実現しました。さらに、鶏血漿上のタンデム、ショットガンプロテオミクス、およびグリコシル化部位分析を達成することにより、プロトコルに新しい機能を設計しました。フィルターで精製し、疎水性ヒドラジドタグで誘導体化したN型糖鎖は、固相抽出(SPE)によるものと存在量とクラスの点で同等であることを示しました。後者は、この分野ではゴールドスタンダードと見なされています。重要なことに、2つのプロトコルのばらつきは統計的に異ならなかった。グリコミクスデータに沿って収集されたプロテオミクスデータは、標準的なトリプシン消化物と比較して同じ深さでした。ペプチドの脱アミド化は、プロトコールで最小限に抑えられ、グリコシル化モチーフで検出される非特異的な脱アミド化を制限します。これにより、直接的なグリコシル化部位分析が可能になりましたが、このプロトコールは18O部位の標識にも対応できます。全体として、定量的グライコミクスおよびプロテオミクス分析のための新しいインラインハイスループット、ノンバイアス、フィルターベースのプロトコルを実証しました。

<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> 図1：組み合わせたプロテオミクスとグライコミクス解析のための牙-P2GPN疎水性タグ付け結合された方法（方法A）が与えられたのスキーム手順グリコシル化部位の同定と、グライコミクスのみの処理とタンデムグライコミクスおよびプロテオミクス解析の間で異なる、強調表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> インラインプロテオミクスとグライコミクス、フィルターベースP2GPN疎水性タグ付け方法（方法A）は、プールされた鶏の血漿サンプル（ 図1）を使用して識別、定量化、および分子量のバイアスのために検証されました。もっぱらグライコミクス実験のために、Nの存在量で相互比較は法によって抽出された-glycansSPE（ゴールドスタンダード、方法B）作製した（ 図2）を carbographします。 2つの方法のグリカンの存在量に有意差はなかったです。同様の方法で抽出されたグリカンのNAT比内ばらつきもSILを定量することによって評価しました。両方の方法のログ2 -distributionsはゼロを中心に、ガウスた、と（ 図3A-B）に有意差はなかっ。分子量は、フィルタは、Nは分子量範囲及び親水性（ 図4）に基づいて-glycans区別しなかったことを示唆し、完全に重なった2つのプロトコルの間の範囲です。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> 図2：NAT およびSIL Nの等モル混合物を、方法AまたはB法により抽出された-glycansは鶏血漿2.5μlのから調製した（N = 4）の試料は肛門ました。各NAT / SILチャネルで、セクション6に各グリカンのための存在量を示唆した推奨パラメータに従ってUPLC-MSによってyzed、分子を補正し、抽出イオンクロマトグラム（MMA = 3 ppm）で下の面積を積分することによって計算されました重量が重なり、TGNFによって調整します。これらの比率は、その標準誤差で示しています。方法Bの存在量：方法A Nの -glycansはた（p&gt; 0.05）で有意差は認められなかった<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> 図3（A）方法A（N = 133）または（B）方法Bにおける内変動性（N = 123）の戦略を比較しました。同じ抽出方式からNの -glycansのNATとSIL等モル混合物で、、3つの技術の反復にわたって分析しました。ログ2 -distributionsは、ゼロを中心と2つのワークフローの間で有意差は認められなかったた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> 図4：各戦略からのグリカンの分子量範囲を比較しました。 2つのワークフローは、同じ分子量の範囲に及ぶグリカンを生成した。N -glycans他対1のプロトコルで検出されたばかりの検出（1×10 5豊富）の限界を超えて下落したと系統的なバイアスを反映するものではありません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。</a> 表5）と比較しました。 FASPトリプシン消化物（STDプロトコル）に続いて私たちの典型的な18時間のフィルタベースのPNGase F消化は、glycositesの識別を妨害することができるの非特異的脱アミド化の有意なレベルをもたらしました。従って、高温（50℃）で、より短いインキュベーション時間を利用する方法およびPNGアーゼFのスパイクステップ（SPIプロトコル）は、非最小化するために、マイクロ波消化プロトコル（MDプロトコル）と共に、代替として調査しました。特定の脱アミド。新しい消化法で観察されたグリカンは、標準の18時間からの組成物または存在量における有意差は認められなかった37°CフィルタのPNGase Fダイジェスト（ <strong&gt;図5）。短いトリプシンインキュベーションと組み合わせることで、非特異的脱アミド化が著しくglycosites &lt;5％（ 表5）のための偽陽性率で、減少しました。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4">タンパク質</td><td></td><td colspan="4">ペプチド</td><td></td><td colspan="4">脱アミド化ペプチド</td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4">糖タンパク質</td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18時間</td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> MD </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> 10 </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> 表5： 標準トリプシンからのプロテオームデータの比較のインライン牙-P2GPNタギング法に対するダイジェストが行われた準備が（+）とし、せずに行った-非特 ​​異的脱アミド化および推定の背景率を決定するために、PNGアーゼF（）。偽陽性率をglycosite。タンパク質は、1％の偽発見率（FDR）で同定されました。ペプチドは、プロテオームのDiscoverer 1.4（Q &lt;0.01）で「高」ペプチドの信頼に基づいて、濾過しました。 glycositesはidentifiました保存されたグリコシル化モチーフ（NXS / T）の脱アミド化を含むユニークな配列に基づいてED。および糖タンパク質は、少なくとも1つの識別glycositeを含む同定されたタンパク質として定義されていました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> 図5：グリカンのための短縮プロトコルは、試料中の脱アミノ化を最小限に抑えるために開発され、18時間牙のPNGase F消化物と比較しました。存在量の平均の差は10％とそれぞれMD（2.2.3）およびSPI（2.2.2）プロトコル、5％でした。同定された48グ ​​リカンのうち、90％未満1.5倍の変化を示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

血漿中のプロテオミクスとグライコミクスの精製、およびLC-MS/MS定量を組み合わせたハイスループットプロトコルが開発されました。N-結合型グリコシル化モチーフの脱アミド化解析は、脱グリコシル化部位に特異的でした。糖鎖ヒドラジドタグ法による標識では、フィルターを用いたN型糖鎖分離と個別性標準化を組み合わせることで、N型糖鎖の正確な定量が達成されました。

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

このシングルフィルターベースのワークフローの全体的な目的は、質量分析に向けて、生物学的試料からN-グリカンとタンパク質をタンデムに、簡便かつ定量的に精製することです。本手法のスケールアップ可能性、速度、および分析再現性により、生物学的質量分析ラボにおけるリソースやスキルセットの面で直接的な導入が可能となります。この手法の主な利点は、大規模なハイスループット生物学的研究において、グリコミクス、糖鎖付加部位の占有率、およびプロテオミクスに関する課題を同時に調査できることです。この手法を質量分析用に最適化した誘導体化戦略と組み合わせることで、N-グライカンの測定における課題を克服し、がん状態と対照群の間で正確な相対定量が可能となりました。分析のばらつきが低減されたことで、グライコンとプロテオームの間の新たな生物学的相互作用が解明され、疾患状態への重要な知見やバイオマーカー探索の新たな機会が得られる可能性があります。まず、2.5 µLの血漿をフィルターにロードします。次に、フィルター内の各サンプルに1Mジチオスレイトール溶液を2 µL加えます。100-mM 重炭酸アンモニウムPNGase消化バッファー200 µLでサンプルを希釈します。フィルターサンプルチューブにキャップをし、フィルターが定座から外れないように注意しながら、軽くボルテックスします。タンパク質および糖タンパク質を変性させるため、サンプルを56 °Cで30分間インキュベートします。サンプルをアルキル化するため、最終濃度が約200 mMになるように1M Iodoacetamideを50 µL加えます。その後、37 °Cで60分間インキュベートします。サンプルを14,000 x gで40分間遠心分離し、変性した糖タンパク質をフィルター上に濃縮した後、ろ液を廃棄します。100 µLのPNGase消化バッファーでサンプルを洗浄します。糖タンパク質をフィルター上に濃縮し、ろ液を廃棄します。洗浄および濃縮ステップをあと2回繰り返し、計3回行うことで、フィルターのデッドボリュームに濃縮液を得ます。洗浄が完了したら、すべてのフロースルーと回収バイアルを廃棄します。その後、新しい回収バイアルに付け替えた後、グリセロールフリーのペプチドN-グリコシダーゼFまたはPNGase Fを2 µLフィルターに加えます。PNGase消化バッファーを98 µL加え、全量を100 µLにし、フィルター上で緩やかにピペッティングして混合します。スパイクイン消化プロトコルの場合は、サンプルを50 °Cで2時間インキュベートします。速やかにサンプルを取り出し、グリセロールフリーのPNGase Fをさらに2 µLスパイクインします。サンプルを1〜2秒間軽くボルテックスして混合します。サンプルを50 °Cでさらに2時間インキュベートします。20 °Cで遠心分離してグリカンを溶出させた後、フィルターに100 µLのPNGase消化バッファーを加え、再度遠心分離します。残存するN-結合型グリカンを含む洗浄液を、溶出液と同じ回収チューブに回収します。これを2回繰り返し、フィルターを取り出して、プロテオミクス調製用の新しい回収バイアルに入れます。次に、糖鎖サンプルを80℃のフリーザーで、凍結するまで30〜60分間インキュベートします。その後、真空濃縮機を用いて室温で4〜6時間、完全に乾燥させます。脱アミノ化ペプチドを含むフィルターを400 µLの8M ureaバッファーで洗浄します。回収用バイアルにキャップをし、軽くボルテックスして混合します。すべてのフロースルーを廃棄する前に、フィルター上でペプチドを濃縮させます。尿素バッファーによる洗浄をさらに2回繰り返した後、脱アミノ化ペプチドを含むフィルターをTrypsin消化バッファーでリンスします。回収バイアルにキャップをし、軽くボルテックスして混合してから、前述と同様にフィルター上で再び濃縮します。すべての透過液を廃棄し、この操作をさらに2回繰り返し、計3回のTrypsin消化バッファー洗浄を行います。今後のすべての溶出液および洗浄液を新しい回収バイアルに回収します。次に、ディスカバリープロテオミクスの場合は1:50、定量プロテオミクス実験の場合は1:5のトリプシン対タンパク質比で、50 µLの豚由来修飾トリプシンを加えます。回収バイアルにキャップをし、軽くボルテックスして混合します。サンプルを37°Cで2時間インキュベートした後、速やかにサンプルを取り出し、適切なトリプシン対タンパク質比に従ってさらに50 µLのTrypsinを添加します。1〜2秒間軽くボルテックスして混合します。その後、50°Cでさらに2時間インキュベートします。前述と同様に20分間遠心分離してペプチドを溶出させた後、フィルターに残っているペプチドをクエンチバッファーで洗浄します。前述と同様に15分間遠心分離して、フィルターから溶出させます。サンプル中のペプチド濃度を定量した後、ペプチドサンプルを80℃のフリーザーで凍結するまでインキュベートします。次に、真空凝縮機を用いて室温で4～6時間、完全に乾燥させます。その後、液体クロマトグラフィー質量分析（LCMS）解析の直前に、トリプシン消化したタンパク質を移動相Aで目的の濃度まで再溶解します。2.5 µLの血漿からのトリプシン消化ペプチド濃度は、100～300 ng/µLの範囲になります。糖鎖分析に先立ち、乾燥した安定同位体標識4-フェネチルベンゾヒドラジド試薬および天然型P2GPN試薬を、最終濃度が0.25 mg/mLとなるように1 mLの誘導体化溶液で再構成します。試薬が完全に溶解するまでに最大10分かかります。完全に溶解させるため、十分にボルテックスしてください。乾燥させたN-glycansに、200 µLの安定同位体標識またはネイティブのP2GPN試薬を加えてタグ付けします。ピペッティングにより乾燥 glycanを再懸濁させます。その後、サンプルをボルテックスし、ベンチトップ遠心機で約5秒間スピンダウンさせます。糖鎖と試薬を56°Cで3時間反応させます。反応後、直ちに糖鎖をインキュベーターから真空濃縮機へ移し、55°Cで3〜5時間かけて完全に乾燥させます。液体クロマトグラフィー・質量分析（LC-MS）分析の直前に、タグ付きN-糖鎖を25〜50 µLの水で再懸濁します。ピペッティングを繰り返し、N-glycansを完全に溶解させます。前述と同様にサンプルを5分間遠心分離した後、ピペットのチップが遠心チューブの底に触れないよう注意しながら、上清を除去します。相対定量タンデム分析のため、ネイティブサンプルと安定同位体標識サンプルのペアを1:1の比率で混合します。プロテオミクスおよびグリコミクスのワークフロー用に、2種類の異なるLCMSメソッドを準備します。タンパク質分析では、NPAに含まれる約400 nanogramsのタンパク質をカラムに注入します。サンプルを300 nanoliters per minuteで流し、1 microliterのプレカラム平衡化と5 microliterの分析カラム平衡化を行います。テキストプロトコルに記載されたMS条件でタンパク質をイオン化します。糖鎖分析では、再懸濁したP2GPNタグ付きの天然および安定同位体標識等量サンプルを5 µL、カラムに注入します。サンプルの流速を300 nL/minとし、2 µLのプレカラム平衡化と5 µLの分析カラム平衡化を行います。次に、テキストプロトコルに記載されたMS条件でグリカンをイオン化します。フィルターベースの精製プロトコルを標準的な固相抽出法と比較したところ、2つのプロトコル間で検出された血漿グリカン量に有意な差は見られませんでした。どちらの方法においても、検出限界付近で変動が増大する同様のグリカンが認められました。フィルターベースの抽出プロトコルまたは標準的な固相抽出プロトコルによって精製された血漿のequiM混合物における個体間変動を評価した。どちらのプロトコルにおいてもガウス分布を示し、平均値はゼロと有意な差はなかった。グリカンの80%が2倍の変化範囲内に収まった。新規および従来の精製プロトコルで検出された糖鎖の分子量分布に有意な差はなく、同様の範囲を網羅していました。定性的に、糖鎖間にバイアスは観察されませんでした。血漿タンパク質は、標準的なフィルター補助試料調製および複数のインラインプロトコルによって調製されました。同定されたタンパク質の数は、各プロトコルで同様でした。非特異的な脱アミド化は、マイクロ波消化およびスパイク消化プロトコルにおいて10%未満に制御されました。この手順を行う際は、正確な糖鎖付加部位の占有率を維持するために、熱への曝露と処理時間を最小限に抑えることが重要である点に留意してください。習得後は、インラインでのpecurikene N-糖鎖精製を2日間で完了させることができます。本手順に従うことで、正確なタンパク質N-糖鎖定量および糖鎖付加部位の占有率を統合し、高次統計手法を用いてモデル化することが可能です。この技術により、がん生物学が発する複雑な情報を迅速に読み解き、タンパク質治療薬間の差異を定量的に比較し、生物学的コンテキストにおける糖鎖付加の重要性を真に明らかにすることができます。

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Research

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化学

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細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ

O結合型糖鎖の多様性を包括的に探求するために、ペルメチル化および迅速な相分配法と組み合わせた新しいゲル内還元的β除去の手順を、SDS-PAGEによって分離され、その後の質量分析による糖鎖分析に適した糖タンパク質から直接放出されるO結合型糖鎖の分析に適用されます。...

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。...

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。...

細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

タンパク質上の糖鎖を自動的かつ迅速に分析するためのシステムは、以前に開発されました。本稿では、バイオ医薬品やその他の複合糖質材料の糖鎖構造解析に従事するユーザーなど、幅広いユーザー向けに最適化された「糖質定性分析」のプロトコールを紹介します。...

全自動システムを用いた組換えタンパク質の迅速な糖質定性評価

このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。...

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。...

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

学ぶ、フィルター法によるN-グリカンとタンパク質の同時精製とLC-MS/MSを用いた定量法。がんと対照群の正確な比較定量が可能となり、グリコミクスとプロテオミクスの統合的研究に貢献します。

定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

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