定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

このシングルフィルターベースのワークフローの全体的な目標は、質量分析から得られた生体サンプルから N 型糖鎖とタンパク質を簡単かつ定量的に精製することです。この分析法のスケーラビリティ、速度、分析再現性により、生物質量分析ラボのリソースやスキルセットに直接アクセスすることができます。この手法の主な利点は、研究者が大規模なハイスループット生物学研究において、グライコミクス、グリコシル化部位占有率、プロテオミクスの問題を同時に調査できることです。

私たちは、この方法を質量分析に合わせた誘導体化戦略と組み合わせることで、N型糖鎖測定の課題を克服し、がんと対照状態との間の正確な相対定量を実現しました。分析のばらつきが小さくなることで、グライコームとプロテオームの間の新たな生物学的相互作用が解明され、疾患状態に関する重要な洞察が得られ、バイオマーカー発見の新たな機会が得られます。まず、2.5マイクロリットルの血漿をフィルターにロードします。

次に、フィルター内の各サンプルに2マイクロリットルの1Mジチオスレイトール溶液を加えます。サンプルを200マイクロリットルの100 mM重炭酸アンモニウムPNGase消化バッファーで希釈します。フィルターサンプルチューブにキャップをし、フィルターをシートから乱さないように注意しながら、軽く渦を巻きます。

サンプルを摂氏56度で30分間インキュベートし、タンパク質と糖タンパク質を変性させます。サンプルをアルキル化するには、50マイクロリットルの1Mヨードアセトアミドを添加して、最終濃度を約200 mMにします。その後、摂氏37度で60分間インキュベートします。

フロースルーを廃棄する前に、サンプルを14, 000 x gで40分間遠心分離することにより、変性糖タンパク質をフィルターに濃縮します。サンプルを100マイクロリットルのPNGase消化バッファーで洗浄します。糖タンパク質をフィルターに濃縮し、フロースルーを廃棄します。

洗浄と濃縮のステップを2回、合計3回繰り返し、フィルターのデッドボリュームに濃縮物を生成します。洗浄が完了したら、すべてのフロースルーと収集バイアルを廃棄します。次に、新鮮な収集バイアルに移した後、2マイクロリットルのグリセロールフリーペプチドN-グリコシダーゼFまたはPNGase Fをフィルターに加えます。

98マイクロリットルのPNGase消化バッファーを追加し、総容量を100マイクロリットルにし、フィルターを静かに上下にピペットで動かして混合します。スパイクイン消化プロトコルでは、サンプルを摂氏50度で2時間インキュベートします。迅速に作業し、サンプルを取り出し、さらに2マイクロリットルのグリセロールフリーPNGase F.Lightlyボルテックスサンプルを1〜2秒間渦巻きにして混合します。

サンプルを摂氏50度でさらに2時間インキュベートします。サンプルを摂氏20度で遠心分離して糖鎖を回避した後、100マイクロリットルのPNGase消化バッファーをフィルターに加え、再度遠心分離します。残った N 結合型糖鎖を含む洗浄液を、溶離液と同じ収集バイアルに集めます。

2回繰り返した後、フィルターを取り外し、プロテオミクス調製用の新しいコレクションバイアルに入れます。次に、糖鎖サンプルを80°Cの冷凍庫で30〜60分間インキュベートし、凍結させます。その後、真空濃縮器で室温で4〜6時間乾燥させます。

脱葉ペプチドを含むフィルターを400マイクロリットルの8M尿素緩衝液ですすいでください。コレクションバイアルにキャップをし、軽く渦を巻いて混ぜます。ペプチドをフィルターに濃縮してから、すべてのフローを廃棄します。

尿素緩衝液の洗浄をさらに2回繰り返した後、分解されたペプチドを含むフィルターをトリプシン消化緩衝液ですすいでください。コレクションバイアルにキャップをし、軽く渦を巻いて混ぜてから、前と同じように再びフィルターに集中します。すべてのフロースルーを廃棄し、さらに2回繰り返して、合計3回のトリプシン消化バッファー洗浄を行います。

今後のすべての溶離液と洗浄液を新しい収集バイアルに集めます。次に、50マイクロリットルのブタ修飾トリプシンを、創薬プロテオミクスの場合はトリプシンとタンパク質の比率が1:50、定量的プロテオミクス実験の場合はトリプシンとタンパク質の比率が1:5で追加します。コレクションバイアルにキャップをし、軽く渦を巻いて混ぜます。

サンプルを摂氏37度で2時間インキュベートした後、迅速にサンプルを取り出し、トリプシンとタンパク質の比率でさらに50マイクロリットルのトリプシンをスパイクします。サンプルを1〜2秒間軽くボルテックスして混合します。その後、摂氏50度でさらに2時間インキュベートします。

前回と同様に20分間遠心分離してペプチドを溶出した後、フィルターから残りのペプチドをクエンチバッファーですすいでください。前回と同様に15分間遠心分離してフィルターから溶出します。サンプル中のペプチド濃度を定量した後、ペプチドサンプルを摂氏80度の冷凍庫で凍結するまでインキュベー

その後、真空濃縮器で室温で4〜6時間乾燥させます。次に、液体クロマトグラフィー質量分析または移動相AでのLCMS分析の直前にトリプシンタンパク質を目的の濃度にします。2.5マイクロリットルの血漿からのトリプシンペプチド濃度は、マイクロリットルあたり100〜300ナノグラムの範囲です。

糖鎖分析に先立ち、乾燥安定同位体標識 4-フェネチルベンゾヒドラジド試薬と天然 P2GPN 試薬を 1 ミリリットルの誘導体化溶液に溶解し、最終濃度が 0.25 ミリグラム/ミリリットルになるようにします。試薬が完全に可溶化するまでに最大10分かかります。完全な可溶化を確実にするために広範囲に渦

乾燥させたN型糖鎖に、200 μLの安定同位体標識試薬または天然P2GPN試薬を添加します。ピペットで上下に動かして、乾燥した糖鎖を再懸濁します。次に、サンプルをボルテックスし、ベンチトップ遠心分離機で約5秒間スピンダウンします。

糖鎖を試薬と56°Cで3時間反応させます。直ちにインキュベーターから真空濃縮器に糖鎖を移し、摂氏55度で3〜5時間乾燥させます。液体クロマトグラフィーおよび質量分析の直前に、タグ付きN型糖鎖を25〜50マイクロリットルの水に再懸濁します。

N型糖鎖が完全に可溶化するようにピペットで上下します。前回と同様にサンプルを5分間遠心分離した後、ピペットの先端が遠心チューブの底に触れないように注意しながら、上清を取り除きます。ネイティブ同位体標識サンプルと安定同位体標識サンプルのペアを1:1の比率で組み合わせて、相対定量タンデム分析を行います。

プロテオミクスおよびグライコミクスワークフロー用に2種類のLCMSメソッドを調製します。タンパク質分析では、NPAのカラムに約400ナノグラムのタンパク質を注入します。サンプルを毎分 300 ナノリットルで分析し、1 マイクロリットルのプレカラム平衡化と 5 マイクロリットルの分析カラム平衡化を行います。

テキストプロトコールで規定されているMS条件下でタンパク質をイオン化します。糖鎖分析では、再懸濁したP2GPNタグ付きネイティブおよび安定同位体標識の等価Mサンプルを5マイクロリットルをカラムに注入します。サンプルを毎分 300 ナノリットルで分析し、2 マイクロリットルのプレカラム平衡化と 5 マイクロリットルの分析カラム平衡化を行います。

次に、テキストプロトコールに記載されているMS条件下で糖鎖をイオン化します。フィルターベースの精製プロトコルを標準的な固相抽出法と比較したところ、2 つのプロトコル間で検出された血漿糖鎖の存在量に有意差はありませんでした。どちらの方法でも、同じ糖鎖が検出限界付近でばらつきが増大することがわかりました。

フィルターベースまたは標準的な固相抽出プロトコルによって精製された血漿のequiM混合物の相互変動性を評価しました。どちらのプロトコルも、平均がゼロと有意に異ならないガウス分布を持っていました。糖鎖の 80% は 2 倍の変化に収まりました。

新しい精製プロトコルと従来の精製プロトコルで検出された糖鎖の分子量分布は、有意差はなく、同じ範囲をカバーしていました。定性的には、糖鎖間のバイアスは観察されなかった。血漿タンパク質は、標準的なフィルター支援サンプル調製と複数のインラインプロトコルによって調製されました。

同定されたタンパク質の数は、さまざまなプロトコルで同様でした。非特異的な脱アミド化は、マイクロ波消化プロトコルとスパイク消化不良プロトコルで 10% 未満に制御されました。この手順を試行する際、正確なグリコシル化部位の占有率は、熱と時間への曝露を最小限に抑えることが条件であることを覚えておくことが重要です。

一度習得すれば、インラインペクリケネN型糖鎖精製は2日で完了します。この手順に従うことで、タンパク質のN型糖鎖の正確な定量とグリコシル化部位の占有率を統合し、高次の統計手法を用いてモデル化することができます。この技術により、がん生物学が語る複雑な言語を迅速に読み返し、タンパク質治療の違いを定量的に比較し、生物学的な文脈におけるグリコシル化の重要性を真に明らかにすることができます。