単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討
2016年2月16日
我々は、分離、表現型の特徴およびマウス歯肉からの免疫細胞の機能解析のための手法を確立しました。
本手法の全体的な目的は、口腔免疫および歯周炎に関連する免疫応答の詳細な特性解析を行うために、歯肉免疫細胞を単離することです。この手法は、歯周炎の病原性に関与している細胞因子は何かといった、口腔免疫分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、口腔免疫細胞ネットワークの評価が可能であること、および、下流のin-vitro解析に十分な量の生存細胞を単離できることです。
本プロトコルの最初のステップとして、まずピンでマウスの体を固定し、胸腔と腹腔を開いて心臓と内臓を露出させます。次に、大静脈を切開し、27ゲージの針を装着した3ミリリットルシリンジを用いて、左心室から3 millilitersのPBSを灌流します。血液がすべて洗い流されたら、マウスの頭部を解剖パッドに固定し、腹側を上にして配置します。
次に、はさみを用いて口角から頸部に向かって切開し、下顎および頸部領域を覆う皮膚を分離して、下層の組織と筋肉を露出させます。下顎の両側を分離するため、下顎切歯の間を切断します。口腔内にアクセスするため、分離した下顎の両側を25ゲージの針で固定します。
口蓋を確認した後、10番の外科用メスを用いて、第一大臼歯の直前および第三大臼歯の直後に垂直切開を加えます。次に、組織を鼻腔から剥離し、ブロックを下顎骨から切り出します。その後、歯肉の縁から余分な組織を取り除き、上顎および下顎のブロックを、氷上で5 mLのコラゲナーゼおよびDNaseを含む50 mLコニカルチューブに移します。
シェーカーインキュベーターを用いて37°Cで1時間、組織を消化させ、最後の5分間に0.5 M EDTAを50 µL加えます。その後、組織に冷えたDNase培地を5 mL加え、チューブの内容物を緩やかに回転させて混ぜ合わせます。次に、4つの組織ブロックをペトリ皿に移します。
そこに500 µLの新鮮なDNase培地を加え、覆います。メスを使用して、各組織ブロックから歯肉を除去します。そして、ディッシュの内容物すべてを、50 mLチューブの上に設置した70 µmセルストレイナーに転送します。
シャーレとストレーナーを3～5 mLの新鮮なDNase培地で洗浄します。次に、滅菌済みの3 mLシリンジのプランジャーを用いて、ストレーナーのメッシュに歯肉組織を押し付け、すり潰します。ストレーナーを30～35 mLの冷えたDNase培地で洗浄し、ろ液を遠心分離します。
次に、ペレットを1 milliliterの完全培地で再懸濁し、生存細胞数を測定します。たった今実演した免疫細胞の分離および処理により、野生型および歯周病感受性動物の両方から、ex-vivo刺激および歯肉細胞のサイトカイン分泌パターンのキャラクタリゼーションを行うのに十分な数の細胞を得ることができます。実際に、歯周病感受性LFAノックアウトマウスにおけるT細胞およびナチュラルキラー細胞分画を評価したこれらの密度プロットに示すように、マウス歯肉の免疫細胞組成を解析することが可能です。
適切なゲーティング戦略を用いることで、TCR β CD4陽性、TCR β CD8陽性、およびTCR γδ陽性T細胞、ならびにNK細胞および自然リンパ球の細胞内サイトカイン産生を決定することが可能です。この手法を習熟し、適切に実施すれば、免疫染色のための細胞分離を3時間で完了させることができます。本手順を行う際は、すべてのステップを効率的かつ迅速に完了させ、操作していない間は常に細胞を氷上に保持することが重要です。
この手順の後、セルソートなどの他の手法を行うことで、特定の細胞サブセットの機能に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。
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概要
本記事では、マウスの歯肉から免疫細胞を単離および特性解析するための手法を紹介します。この手法は、口腔免疫および歯周炎に関する理解を深めることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 口腔生物学
- 歯周病学
背景
- 口腔内における免疫応答を理解することは、歯周病への対処において極めて重要です。
- 歯肉免疫細胞は、口腔免疫において重要な役割を果たしています。
- 現在の手法では、詳細な解析に十分な数の生存細胞を得られない場合があります。
- 本手法は、詳細な機能研究を可能にすることで、その課題を解決することを目的としています。
研究目的
- 特性評価のために歯肉免疫細胞を単離すること。
- 歯周炎の病態生理に関与する細胞因子を調査すること。
- 口腔免疫細胞ネットワークを評価すること。
使用した手法
- マウスの固定および内臓の露出。
- 血液洗浄のための大静脈の切開。
- シリンジを用いた左心室からのPBS灌流。
- 以降の解析のためのマウスの調製。
主な結果
- 生存可能な歯肉免疫細胞の分離に成功すること。
- 口腔健康に関連する免疫応答の特性評価。
- 歯周炎の病態生理に関する知見の獲得。
- 下流のin-vitro研究への活用の可能性。
結論
- この手法は、口腔免疫の研究において有用なツールとなります。
- これにより、歯肉組織における免疫細胞のダイナミクスの理解が深まります。
- 今後の研究では、この方法を活用することで、歯周病に関するより深い知見を得ることが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
歯肉免疫細胞の精密な単離と機能プロファイリングは、口腔免疫学におけるメカニズムのデリスキングを可能にし、炎症性疾患研究におけるターゲット検証をサポートします。このワークフローは、定量的表現型解析およびex vivo機能アッセイに供するための生存率の高い細胞集団を提供し、初期探索およびトランスレーショナル研究における予測の信頼性を高めます。本手法は、組織常在性免疫ネットワークの堅牢な解析を可能にすることで、免疫学および口腔健康R&Dにおけるポートフォリオ決定に寄与することを目的としています。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 口腔炎症の病態に関与する免疫細胞サブセットの解析を可能にする。
- ex vivoサイトカイン分泌アッセイを通じて、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 疾患モデルにおける免疫細胞の寄与を明らかにすることで、メカニズム的なリスク低減を促進する。
- 仮説駆動型のポートフォリオ選別のための定量的なデータを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのアッセイ開発に向けた、生存しており表現型が特性評価された免疫細胞を提供します。
- 標準化されたスクリーニングワークフローのための、生物学的サンプルの再現性のある調製をサポートします。
- 化合物評価のための、免疫機能の定量的な読み取りを可能にします。
- ハイコンテントスクリーニングプラットフォームにおけるスケーラビリティとアッセイ準備性を向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 免疫細胞プロファイリングを疾患関連の口腔モデルと整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 前臨床の口腔免疫病理学研究における機能的バイオマーカーの探索を可能にします。
- 口腔組織を標的とした免疫調節戦略のリスク調整済み進展を支援します。
- 前臨床候補物質の選定に資する機序的な知見を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、口腔疾患モデルにおけるメカニズム研究および機能的スクリーニングの両方に向けて高品質な免疫細胞調製物を提供することで、発見から前臨床までの連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学： 口腔組織の恒常性と病理における免疫細胞の役割に関する仮説検証を推進します。
- スクリーニング： アッセイ開発および化合物試験のために、再現性のある生存細胞集団を提供します。
- 分析学： 比較分析のためのサイトカイン分泌量および免疫細胞表現型の定量的な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 探索的な知見を、疾患に関連する口腔モデルを用いた前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズ再利用： 多様な口腔免疫学研究プログラムに適応可能な標準化されたワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：経口免疫研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：研究間の比較可能性を確保するため、標準化され、再現性があり、拡張可能な免疫細胞分離を実現します。
- 戦略的価値：情報に基づいたgo/no-go判断を支援し、経口免疫学アセットの資本効率の高い進展を促進します。
- ポートフォリオへの影響：経口および粘膜免疫学パイプラインにおけるターゲットおよびアプローチのリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- マウスの解剖および免疫細胞の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- フローサイトメトリーおよびex vivo機能解析インフラへのアクセスが必須となります。
- 再現性のある細胞分離と解析のためには、チーム間での標準化が必要です。
- 他の粘膜組織に適応させる場合、プロトコルの最適化が必要になる可能性があります。
- 細胞の生存率と回収率は、処置のタイミングと温度管理に敏感です。
