Name: 単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: 学ぶマウス歯肉免疫細胞の単離と機能解析手法。口腔免疫と歯周病の病態メカニズムを解明し、細胞ネットワーク評価とin vitro研究への応用が可能です。

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著者は、NIDCR(N.M.M)の学内プログラムによって部分的に資金提供を受け、ウェルカムトラストステッピングストーンズフェローシップ(097820/Z/11/BからJ.E.K)およびマンチェスター共同炎症研究センターの助成金(J.E.K.へ)によって支援されました。著者は、原稿を批判的にレビューしてくれたテレサ・ワイルドに感謝します。

このプロトコルに記載されている全ての実験手順は、必要なガイドラインに従い、施設内動物管理使用委員会、NIDCR / NIHによって承認されました。 1.事前に準備<ol><li>完全培地を調製する：RPMIは2mM L-グルタミン、100単位/ mlのペニシリン、100μgの/ mlストレプトマイシン、10％FBSを補充しました。 </li><li> 7.5μgのDNA分解酵素を添加したRPMI培地50ミリリットル（、新鮮なメイク常に氷上に保つ）：DNアーゼメディアを準備します。 </li><li> DNアーゼメディアプラス3.2ミリグラム/コラゲナーゼIV型のミリリットルの5ミリリットル（、新鮮なメイク常に氷上に保つ）：コラゲナーゼ-DNアーゼメディアを準備します。 </li><li>前クールFACS緩衝液：PBSで希釈した0.5％FBS。 </li><li> 4℃に予冷遠心分離機。 </li><li> 37°Cまでのウォームシェーカーインキュベーター。 </li></ol>歯肉ブロックから2単離、解剖、および細胞単離<ol><li> ARACガイドラインに従って、適切なチャンバ内のCO 2にそれらを暴露することによって、マウスを安楽死させます。 </li> &lt;李&gt;は、心臓や内臓を露出するために胸部と腹腔を開きます。灌流するために、下大静脈内の切開を行い、27 G針で3ミリリットル注射器を用いて左心室を経てPBSの3ミリリットルを灌流。 </li><li>上を向いて胃とパッド上でマウスの体と頭を固定化します。 </li><li>下にある組織と筋肉を露出させ、下顎と首の領域を覆う皮膚を分離し、はさみで首に向かって唇の各交連をカット。下顎を発見するために下唇を解剖。 </li><li>下顎の両側を分離し、口腔にアクセスするためのそれぞれの側を固定する下側切歯間で切断。 </li><li>離れて鼻腔から口蓋を視覚化し、解剖。 </li><li> 10ブレードを使用して領域を解剖し、周囲の歯肉（ 図1）で上顎と下顎臼歯の領域を含みます。縦切開はちょうど第一大臼歯と後部第三大臼歯にとの水平切開部に前方ください歯肉の境界線（組織周囲の歯のホワイトカラー）。 </li><li> 5ミリリットルコラゲナーゼ/ DNアーゼ（氷上で保持）で50ミリリットルコニカルチューブに上顎と下顎のブロックを配置します。 </li><li> 37℃で1時間振とうインキュベーター中でインキュベートし、インキュベーションの最後の5分間に0.5 M EDTA50μlのを追加します。 </li><li>組織と50ミリリットルチューブに冷たいアーゼメディアの5ミリリットルを加え、穏やかに混合することが渦巻きます。 </li><li>シャーレ上の組織の4ブロックを転送し、DNアーゼメディア500μlのでカバー。手術用メスの刃を使用して、組織の各ブロックから歯肉を削除し、歯肉と歯間の領域に刃を向けます。 </li><li>セルストレーナー（70μmの大きさ）を介して新しい50mlチューブに、ペトリ皿だけでなく、解剖時に使用される前のDNアーゼメディアから組織やメディアを転送します。使用される機器のすべてとフィルタDNアーゼメディア（3-5 ml）で洗浄します。 </li><li>無菌の3ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナに対して組織をマッシュ、冷たいDNアーゼメディア（30〜35 ml）でフィルタリングします。 </li><li>冷たいDNアーゼメディアを持つセルストレーナーを洗浄します。 </li><li> 4°C、6分間、314×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、完全培地1ml中に再懸濁します。 </li><li>自動細胞計数器を用いて、（予想量が&gt; 80％の生存率で1.2×10 6細胞に8×10 5の範囲とすべきである）細胞を数えます。 </li></ol>歯肉細胞の3刺激およびFACS染色<ol><li>ブレフェルジンAの1μL/ mlの存在下でPMA（50ng / ml）およびイオノマイシン（2.5μgの/ ml）で単一細胞懸濁液を刺激</li><li> 37℃で3.5時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li>スピンダウンし、4℃でPBSと遠心機で洗います。 6分間314×gで。 </li><li>製造業者の説明書に従って生存能力染色を用いて細胞を染色します。 </li><li>細胞外マーカー（CD45、TCRγδ、TCRβ、CD4、CD8、TCRγδまたはアリ用ステイン製造者の指示に従って、選択したibodies）。 </li><li> 4°C、5分間、314×gでの冷FACS緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄。 </li><li>静かに細胞ペレットを破壊するためにボルテックス。 </li><li>室温で20分間、2％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。 </li><li>冷たいFACS緩衝液、4°C、細胞内サイトカインのための5分および染色のための314×gで遠心分離で細胞を洗浄。 <ol><li> 4°C、5分間、314×gでFACS緩衝液および遠心機で希釈し、冷0.5％サポニンの溶液でFACSチューブを埋めます。 </li><li> FACSチューブに0.5％サポニン溶液の300μl加え、4℃で暗所で15分間インキュベートし、その後、4℃、5分間、314×gで遠心します。 </li><li>製造者の指示に従って、細胞内のマーカー（IL-17AおよびIFNγまたは選択のサイトカイン）のための細胞を染色。 4°C、5分間、314×gで0.5％サポニン溶液と遠心で細胞を洗浄。 </li><li> FACSで再び洗浄バッファと4℃、5分間、314×gで遠心。 </li><li> FACS緩衝液300μlの中で細胞を再懸濁します。 </li></ol></li><li>フローサイトメーター上の結果を分析します。 </li></ol> 4.フローサイトメトリー分析<ol><li>細胞を可視化するデブリを排除するために、前方（FSC）および側方散乱（SCC）及びゲートに分析されます。 </li><li>高さ（FSC-H）パラメータ対前方散乱面積（FSC-A）を持つ単一のセルを選択します。 </li><li>さらなる分析（ 図2A および 2C）は造血マーカーCD45の+ライブ（生存能力染色によって示されるように）正あるゲート細胞。 </li><li> 図 2と図 3に示すように、特定のマーカーの解析を続けます。 </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません

現在の技術では、成功した表現型の特徴付けのためだけでなく、ex vivoでの機能研究のためだけではなく、適切な（シングルマウスからの）免疫細胞の多数をもたらします。別のグループは、以前に分離し、マウスの歯肉の免疫細胞を特徴付けるためのプロトコルを公開し、動物モデル9における歯周炎の研究で、フローサイトメトリー多色を使用しての値を導入していました。このプロトコルでキー変更のトラブルシューティング、かなり後には歯肉襟エリアと歯間歯肉（ 図1）の両方が含まれるために、組織の全体ブロックの解剖を含めることでした。単独で、歯肉切開して、多くの場合、全層フラップが達成されないと歯肉の一部は、特に歯間地域でミスしました。このアプローチを使用して、収集した免疫細胞の数が大幅に増加しています。また、この手法は、歯肉組織の最適な分離のために、両方の上顎anから可能にD下顎。 このプロトコルの重要なステップは、歯肉領域の保守的な解剖と解剖の効率的なレートが含まれます。具体的には、組織のブロックは、最小限の歯の周りの組織（歯肉）とな...

歯肉組織は、ヒトおよびマウスの歯列を囲み、常に歯 1の複雑なバイオフィルムにさらされています。歯肉障壁をポリシング免疫細胞ネットワークは、組織の完全性を維持するローカル共生微生物に恒常性を確保し、同時に、病原性のチャレンジ2に対して有効な免疫を提供するために不可欠です。恒常性を達成するために、免疫系を注意深くまだ少し詳細は歯肉の免疫細胞集団および組織免疫2の維持における役割の知られている高度に特化した免疫細胞ネットワークを作成歯肉環境に合わせて調整されます。 免疫恒常性が歯肉に破壊される場合には、いずれかの増加ホスト感受性および/ ​​またはdysbiotic微生物群集、炎症状態の存在を通して、歯周炎は、3〜4を発生します。歯周炎は、歯の喪失につながる、一般的な炎症性疾患でありますupporting構造。その重篤な形態では、一般集団5の約10％に見られます。歯周炎感受性および進行に関与する重要な要因を解剖すると6困難であることが判明しました。しかし、動物モデルは、歯周炎の開始および進行7のメカニズムを理解する上で極めて有用でした。モデルは、免疫ホメオスタシスおよび歯周炎の駆動開発を​​維持するために不可欠な重要な細胞集団および分子メディエーターを定義するために使用することができます。このような洞察は、免疫恒常性の歯肉固有の制御の我々の理解を変換し、疾患の病因の我々の現在の理解を促進します。

<table><tbody><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-11</td><td></td></tr>メス<tr><td>ハンドル#3</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>10003-12</td><td></td></tr>メス<tr><td>ブレード#10</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>10010-00</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>スプリンター鉗子</td><td>Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>通常の斜角付き針&nbsp;</td><td>BDメディカル</td><td>305109</td><td>27 G、長さ12.7 mm</td></tr><tr><td>Monoject シリンジ</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>ルアーロックチップ、3 ml</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10010-049</td><td>カルシウムおよびマグネシウムなし</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ロンザ</td><td>12-167F</td><td>L-グルタミンなし</td></tr><tr><td>DNase I 牛膵臓</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV型</td><td>Gibco(ライフテクノロジーズ製)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td>100-106</td><td></td></tr>ゲン<tr><td>タマイシン50 mg / ml</td><td>品質生物学的</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>ペン連鎖球菌</td><td>Gibco(ライフテクノロジーズ製)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ(ライフテクノロジーズ製)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>品質</td>生物学的 <td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml チューブ</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>ポリプロピレン、滅菌</td></tr><tr><td>70 &mu;M細胞ストレーナー</td><td>コーニング</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>コーニング</td><td>351029</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>5 ml FACS チューブ</td><td>コーニング</td><td>352052</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>555029</td><td>ブレフェルジン A 溶液</td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)</td> <td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン カルシウム塩が含まれています</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponin from quillaja bark</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR beta APCeFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウスガンマデルタ TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウスIL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウスIFN-&γ;PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス TCR ベータ FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

組織内の免疫細胞ネットワークは、局所免疫を媒介し、組織の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていますが、口腔粘膜や歯肉に常在する免疫細胞集団についてはほとんど知られていません。私たちは、常に微生物にさらされている領域であり、一般的な炎症性疾患である歯周炎に対して脆弱な部位であるマウスの歯肉組織から免疫細胞を分離し、研究するための技術を確立しました。私たちのプロトコルは、定常状態であっても、歯肉に常在する免疫細胞集団の詳細な表現型の特徴付けを可能にします。また、私たちの手順では、ex vivoでのサイトカイン分泌の評価などの機能研究に使用するのに十分な生存率を持つ細胞が得られます。歯肉免疫細胞ネットワークの表現型と機能的特性のこの組み合わせは、経口免疫と歯周恒常性に関与するメカニズムの調査に役立つはずですが、局所免疫病理に関与するメカニズムの理解も前進します。

プロトコルの適用を説明するために、我々は（ - / - 、 図2A - C LFA対WT）とし、歯周炎のないマウスの歯肉における免疫細胞のネットワークを調べる代表的な結果を示しています。代表的FACSプロットは、歯肉（ 図2A、2C）でのライブCD45 +造血細胞を示します。このプロトコルで免疫細胞の単離および処理は 、ex vivoで刺激し、サイトカイン分泌パターンの特徴付けを行うために十分な細胞が得られます。ここでは、定常状態（WT）の総CD45 +細胞でIL-17およびIFN-γ染色を示し、マウスでは（ 図2B - D）（によるLFA欠乏に）歯周炎を呈します。これらのデータは、組織の定常状態（WT）の間とローカル歯（ - / - LFA）との関...

我々は、分離、表現型の特徴およびマウス歯肉からの免疫細胞の機能解析のための手法を確立しました。

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

本手法の全体的な目的は、口腔免疫および歯周炎に関連する免疫応答の詳細な特性解析を行うために、歯肉免疫細胞を単離することです。この手法は、歯周炎の病原性に関与している細胞因子は何かといった、口腔免疫分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、口腔免疫細胞ネットワークの評価が可能であること、および、下流のin-vitro解析に十分な量の生存細胞を単離できることです。本プロトコルの最初のステップとして、まずピンでマウスの体を固定し、胸腔と腹腔を開いて心臓と内臓を露出させます。次に、大静脈を切開し、27ゲージの針を装着した3ミリリットルシリンジを用いて、左心室から3 millilitersのPBSを灌流します。血液がすべて洗い流されたら、マウスの頭部を解剖パッドに固定し、腹側を上にして配置します。次に、はさみを用いて口角から頸部に向かって切開し、下顎および頸部領域を覆う皮膚を分離して、下層の組織と筋肉を露出させます。下顎の両側を分離するため、下顎切歯の間を切断します。口腔内にアクセスするため、分離した下顎の両側を25ゲージの針で固定します。口蓋を確認した後、10番の外科用メスを用いて、第一大臼歯の直前および第三大臼歯の直後に垂直切開を加えます。次に、組織を鼻腔から剥離し、ブロックを下顎骨から切り出します。その後、歯肉の縁から余分な組織を取り除き、上顎および下顎のブロックを、氷上で5 mLのコラゲナーゼおよびDNaseを含む50 mLコニカルチューブに移します。シェーカーインキュベーターを用いて37°Cで1時間、組織を消化させ、最後の5分間に0.5 M EDTAを50 µL加えます。その後、組織に冷えたDNase培地を5 mL加え、チューブの内容物を緩やかに回転させて混ぜ合わせます。次に、4つの組織ブロックをペトリ皿に移します。そこに500 µLの新鮮なDNase培地を加え、覆います。メスを使用して、各組織ブロックから歯肉を除去します。そして、ディッシュの内容物すべてを、50 mLチューブの上に設置した70 µmセルストレイナーに転送します。シャーレとストレーナーを3～5 mLの新鮮なDNase培地で洗浄します。次に、滅菌済みの3 mLシリンジのプランジャーを用いて、ストレーナーのメッシュに歯肉組織を押し付け、すり潰します。ストレーナーを30～35 mLの冷えたDNase培地で洗浄し、ろ液を遠心分離します。次に、ペレットを1 milliliterの完全培地で再懸濁し、生存細胞数を測定します。たった今実演した免疫細胞の分離および処理により、野生型および歯周病感受性動物の両方から、ex-vivo刺激および歯肉細胞のサイトカイン分泌パターンのキャラクタリゼーションを行うのに十分な数の細胞を得ることができます。実際に、歯周病感受性LFAノックアウトマウスにおけるT細胞およびナチュラルキラー細胞分画を評価したこれらの密度プロットに示すように、マウス歯肉の免疫細胞組成を解析することが可能です。適切なゲーティング戦略を用いることで、TCR β CD4陽性、TCR β CD8陽性、およびTCR γδ陽性T細胞、ならびにNK細胞および自然リンパ球の細胞内サイトカイン産生を決定することが可能です。この手法を習熟し、適切に実施すれば、免疫染色のための細胞分離を3時間で完了させることができます。本手順を行う際は、すべてのステップを効率的かつ迅速に完了させ、操作していない間は常に細胞を氷上に保持することが重要です。この手順の後、セルソートなどの他の手法を行うことで、特定の細胞サブセットの機能に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

心臓から機能的な免疫細胞を単離するためのこの方法では、これらの細胞の反応性の低下、その結果、不要な免疫細胞の活性化を引き起こすコラゲナーゼ消化、の従来の方法に代わる方法が用意されています。分離の手法は、酵素消化に関連する問題を回避することによって機能的な心臓の免疫細胞が得られます。...

機能心臓の免疫細胞の単離

このビデオは、マウスモデルからの歯肉免疫細胞ネットワークの分離手順を示しています。酵素による消化により、付着した歯や骨から歯肉組織が放出され、さらに機械的に消化されて、歯肉から免疫細胞が放出されます。単離された細胞は、免疫学的実験の準備ができています。...

マウスの歯のブロックからの歯肉免疫細胞ネットワークの分離

この研究は、単一細胞培養を生成するために、マウス口腔から歯肉組織を分離して処理するための効率的な手法が記載されている。得られた細胞をさらにフローサイトメトリー分析および分子生物学的研究のために使用することができる。...

マウス歯肉細胞の単離、処理と解析

この記事では、宿主内に侵入して生存できる嫌気性細菌を測定するためのプロトコルと、宿主細胞と相互作用する嫌気性細菌を視覚化するためのプロトコルの2つを紹介します。この研究は、培養可能な嫌気性菌および真核細胞の種類に応用できます。...

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。...

結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

プロトコルの目的は、炎症性歯肉モデル体外を構築することです。この組織モデルは共同ひと細胞、HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞および三次元条件下での THP 1 マクロファージの 3...

歯肉の炎症性三次元人体同等

本プロトコルでは、部分的な外科的扁桃摘出術を受けた健康なヒトから扁桃体単核細胞を容易に処理および培養し、活性化時に自然免疫応答を研究し、粘膜組織におけるウイルス感染を模倣する方法を説明する。...

ヒト粘膜リンパ組織におけるEx Vivo自然免疫応答を研究する扁桃単核細胞の単核細胞の単離

ここでは、従来の方法にロック阻害剤Y-27632を添加することにより、ヒト歯肉上皮細胞の単離および培養のための改変方法を提示する。この方法は、より簡単で、時間のかかるおらず、幹細胞の特性を高め、実験室と臨床用途の両方で、より多くの高電位上皮細胞を産生します。...

Y-27632を用いた初原ヒト歯肉上皮細胞の単離と培養

現在のプロトコルは、成長し続けるマウス切歯、マウス臼歯、およびヒトの歯から単細胞RNA-seq分析に適した単一細胞を単離するための迅速で効率的で穏やかな方法を提示します。...

マウスとヒトの歯からの単一細胞の迅速な分離

2型炎症に関与するグループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)は、主に蠕虫感染、アレルギー疾患、代謝恒常性、および組織修復に応答します。この研究では、マウス鼻粘膜からILC2を分離し、CD226の発現を検出する手順が実証されています。...

CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

このプロトコルの目的は、異なる分子サイズの蛍光標識デキストトランスを歯 肉表面に局所的に塗布し、その後単一光子顕微鏡システムを用いて 体外 画像を施すことで、マウスの歯肉上皮上皮障壁の完全性を定量的に評価する標準化されたアプローチを提供することです。...

蛍光トレーサーを用いたマウスの歯肉上皮障壁の機能評価

学ぶマウス歯肉免疫細胞の単離と機能解析手法。口腔免疫と歯周病の病態メカニズムを解明し、細胞ネットワーク評価とin vitro研究への応用が可能です。

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

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