サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準

この手法の全体的な目標は、既知の金属タンパク質標準物質の使用に基づいて、複雑な標準物質中のさまざまな金属タンパク質を定量できるようにすることです。この方法は、生物学における金属の役割に関する重要な質問に答えることができます。例えば、タンパク質の金属状態は病気でどのように変化するのでしょうか?

この手法の主な利点は、タンパク質の天然状態の金属状態を測定できることです。この技術を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるAmber Lothianです。まず、組織または細胞培養サンプルを、トリス緩衝生理食塩水を使用して5分間の手動ダウンまたは超音波処理により均質化します。

ホモジネートを16, 000倍Gで5分間遠心分離して清澄化します。得られた上清を収集した後、テキストプロトコルに記載されているようにタンパク質濃度を決定することにより、タンパク質の総量を正規化します。誘導結合プラズマ分光器をウォームアップし、メーカーのプロトコルを使用して調整します。

メタロプロテイン標準物質を希釈して、1パーセントの硝酸を使用して、1リットルあたり0〜500マイクログラムの範囲で落下します。この範囲内の基準を達成するために、1〜20を超える希釈剤を使用しないでください。最初に 7 つのキャリブレーションレベルを分析して、注入の順序を設定します。

濃度は0〜500マイクログラム/リットルで、次いでメタロタンパク質標準が続きます。7つの校正レベルは、0、1、5、10、50、および500マイクログラム/リットルです。次に、目的の要素を選択します。

ここでは、鉄、銅、亜鉛、コバルト、ヨウ素を使用します。それらはタンパク質標準が結合している要素であるためです。取得方法の元素を選択するには、元素セレクタータブを開き、分析対象の元素とそれぞれの同位体質量を追加します。

次に、装置でサンプル分析を行います。装置ソフトウェアは、分析対象の各元素の検量線を自動的に作成します。検量線を使用して、未知サンプル中の金属濃度を測定します。

バルク分析の結果から、銅、スーパーオキシドジスムターゼ亜鉛、およびフェリチンの混合物を使用して、哺乳類組織に最も多く存在する3つの微量元素を含む金属タンパク質標準物質を生成します。hyperformance quick クロマトグラフィーまたは HPLC ポンプを 200 ミリモルの硝酸アンモニウムバッファーで 5 分間パージし、毎分 5 mL の流量でパージします。システムがパージされたら、流量をゼロ点に1ミリリットル/分に設定します。

そして、サイドの除外列を接続します。カラムの反対側の端をUV検出器に接続し、ピークチューブを使用して測定吸光度を280ナノメートルに設定します。カラムの流量をゼロポイント1ミリリットル/分刻みで徐々に増やし、最終流量がゼロポイント4ミリリットル/分に達するまで

これが発生している間、カラムへのチューブ接続に漏れがないか確認してください。このシステムの圧力をモニターし、ソフトウェアのクロマトグラム上の圧力トレースを観察して、カラムの要件を超えないようにします。カラムを放置して、5〜10カラムの容量で必要な流速で平衡化します。

平衡化したら、機器を接続してサンプル分析を行います。HPLC法を設定して、バッファーAをカラム上にゼロポイントで毎分4ミリリットル、15分間ポンプで送ります。ハードウェア設定を変更する前に、ICPMS をスタンバイ モードにします。

スタンバイモードになったら、オートサンプラーの通信をオフにし、サンプル紹介を他のものに変更してください。PEEKチューブを使用して、UV検出器からの流出をICPMSのネブライザーに直接接続します。ICPMSの電源を入れ、機器を10〜20分間ウォームアップします。

プラズマが点火したら、ICPMSからのリモートケーブルをHPLCオートサンプラーの背面に接続します。プラズマが発火したら、これを行います。そうしないと、ICPMS がオンになっていないため、HPLC システムは自動的にシャットダウンします。

LC ICPMS のデータを収集するように ICPMS の方法を変更するには、まず取得方法をスペクトルから時間分解能取得に変更します。次に、解析する要素を選択します。鉄、銅、亜鉛、コバルト、ヨウ素、およびその他の関心のある要素、および設定された積分時間。

目的の元素を選択したら、クロマトグラフィーの実行時間と一致するように取り込み時間を調整します。セシウムとアンチモンをバッファーに含ませたクロマトグラフィーバッファーを使用して、ICPMSの感度とコリジョンセルのヘリウムガス流量を手動で調整します。金属イオン数が安定し、相対標準偏差値が5%を下回ると、システムを使用できるようになります。

HPLCおよびICPMSソフトウェアプログラムの両方でサンプルランリストを作成します。サンプルランリストには、各サンプルが注入される順序が含まれています。また、データが保存される名前も指定します。

リスト内のサンプルの総数が 2 つのプログラム間で一致していることを確認します。HPLCによるサンプルの注入によりICPMSがデータ収集を開始するため、HPLCの前にICPMSのサンプルバッチを開始してください。これを正しい順序で行わないと、データが欠落します。

さまざまな量のスーパーオキシドジスムターゼとフェリチンの混合標準試料を注入することにより、検量線ポイントを生成します。注入量は1マイクロリットルから30マイクロリットルの範囲です。最後に、テキストプロトコルに記載されているようにデータを分析する前に、組織、血漿、細胞培養などの未知のサンプルをそれぞれ分析します。

2000〜60,000ピコグラムの範囲でフェリチンがカラムに注入された錯覚が示されています。回帰分析はピーク面積を用いて行いました。銅、亜鉛、スーパーオキシドジスムターゼの錯視プロファイルは、銅と亜鉛の両方について示されています。

ピーク面積を使用して生成された回帰分析も示されています。回帰分析の結果は、生データをカウント/秒からピコグラム/秒に変換するために使用されます。そのため、タンパク質に関連する金属の量を定量的に決定できます。

この手法は、複雑な生体サンプル中の金属タンパク質の同定に使用できます。ここでは、SEC ICPMSで分離されたヒトの脳が示されています。それぞれが異なる対象金属を表しています。

つまり、銅、亜鉛、または鉄です。ここに示されているのは、この技術にヒトのプラズマをさらしたときに得られる痕跡です。サンプルの複雑さと豊富さは、見られるピークの数に影響を与えます。

予想通り、血漿はセルロプラスミンやトランスフェリンなどのいくつかの金属タンパク質によって支配されています。このビデオを見れば、複雑なサンプル中の金属タンパク質のネイティブ状態を測定するための装置のセットアップ方法について十分に理解できるはずです。一度習得すれば、このテクニックは3〜4時間でうまく適用できます。

これにより、1日で20〜36個のサンプルを分析できます。この手順を試行する際には、銅と亜鉛に興味がある場合は、銅亜鉛SODなどの適切な金属タンパク質標準を使用することが重要です。また、セシウムなどのバッファー内の内部標準物質により、時間の経過に伴う機器のドリフトを補正できます。

この手順に従って、他の形式の質量分析も実装して、重要な質問に答えることができます。例えば、サンプルに含まれる金属タンパク質は何か?これは、消化および質量分析タンパク質ペプチドシーケンシングの標準的なトリップによって行うことができます。

または、タンパク質をそのまま分析することにより、本来の状態で。この技術の開発後、この技術は、プロテオミクスの分野の研究者がアルツハイマー病などの疾患における金属タンパク質の役割を理解するための道を開くことができます。濃硝酸と臨床サンプルを扱うことを忘れないでください。

適切な個人用保護具を着用する必要があります。