Name: サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶサイズ排除クロマトグラフィーとICP-MSを組み合わせたメタロタンパク質の定量分析法。生体試料中のタンパク質の金属状態を測定し、疾患メカニズムの解明に貢献します。

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私たちは、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム、（Agilent Technologies社との）オーストラリアの研究評議会リンケージプロジェクトスキーム、精神保健Neuroproteomicsのためのオーストラリア国立保健医療研究評議会、ビクトリア朝の脳バンク、共同研究センターから支援を感謝したいです施設。

緩衝液および試料の調製<ol><li>緩衝液500mlを、200mMの硝酸アンモニウムpH7.6の調製-セシウム（Cs）及び二律背反（SB）と7.8（水酸化アンモニウム（NH 4 OH）を用いてpH調整）は、10ppbの最終濃度に添加しました。 ICP-MSの応答におけるドリフトを監視するために内部標準としてセシウムと二律背反を使用してください。 0.22μmのフィルターに通して使用する前にバッファをフィルタリングします。 </li><li>試料のタイプに応じて試料を調製液体、組織または細胞培養物。 <ol><li>均質化（ 例えば 、組織または細胞）を必要とするサンプルについては、彼らは洗剤を含まないことを確認してください。サンプル調製のためのトリス緩衝液を使用してください。また、リン酸緩衝液を使用するが、それらは負の時間をかけて、または凍結融解サイクル12でmetalloproteomeに影響を与えることができます。 </li><li>トリスを用いて5分間、手動ダウンスまたは超音波処理によって、組織または細胞培養サンプルを均質化生理食塩水（50mMトリスpH8.0の、150mM塩化ナトリウム緩衝しました（塩化ナトリウム）+エチレンジアミン四酢酸（EDTA）フリープロテアーゼ阻害剤）。 </li><li> 5分間、16,000×gで遠心分離することによってホモジネートを明確にします。得られた上清を収集します。 4°Cでサンプルを保管してください。 注：全てのサンプルは、従来のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムをブロックから微粒子を防止するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）バイアルに装填するために遠心分離されなければなりません。 </li></ol></li><li>サンプル全体のカラムに充填したタンパク質の総量を正規化します。マイクロボリュームUV分光光度計13を用いて280nmでのタンパク質濃度を決定します。 20および150μgタンパク質間の負荷。サンプル濃度に応じて80μlの - 2の範囲の典型的な注入量を使用してください。 <ol><li>サンプルローディング前に蒸留水でマイクロボリュームUV分光光度計のサンプルアームを清掃してください。タンパク質サンプルがロードされるサンプルアームです。 </li><li>第2μlのに対して、ブランク楽器電子サンプルバッファー。そして、アームへの負荷を各サンプルの2μLをし、280 nmの吸光度を測定します。 </li><li>濃度を決定します。粗タンパク質サンプルについて、1のAbs = 1 mg / mlでの吸光係数を使用します。ランベルト・ベールの法則を使用して、試料中のタンパク質の濃度を決定するために、Aは吸光度であるA =εxlxcは、εは吸光係数で、lはセンチメートルおよびcにおける経路長は濃度です。 </li></ol></li></ol>誘導結合プラズマを用いた金属タンパク質基準の2バルク分析 - 質量分析法<ol><li>ウォームアップとチューニング製造業者のプロトコルを使用してインストゥルメント。 </li><li>機器はウォームアップとチューニングされたら、バルクICP-MSを行います。 注：精製された金属タンパク質のストック溶液は、一般的に、測定前に希釈する必要があります。金属stochiometries推定タンパク質concentra：標準の金属濃度は、既知のタンパク質から推定することができまする。この情報は、生成された標準曲線の範囲内にすることが適切であろう希釈を決定するために使用することができます。 <ol><li> 1％の硝酸を用いて、500μg/ Lが-彼らは0の範囲を確認するために、金属タンパク質規格、サイログロブリン、フェリチン、セルロプラスミン、銅/亜鉛SODとビタミンB 12を希釈します。この範囲内で基準を達成するために、必要に応じて前にこれに株式を希釈するために水で連続希釈液を行い20に1を超える希釈液を使用しないでください。 </li><li>注射の順序を設定します。まず、7較正レベルを分析し、0の範囲の濃度 - を500μg/ Lは、金属タンパク質標準続きます。 7キャリブレーションレベルは0、1、5、10、50、100および500μg/ Lがあります。 </li><li>関心の要素を選択します。彼らはタンパク質標準がバインドされている要素であるとしてここでは、鉄、銅、亜鉛、CoおよびIを使用します。要素セレクター]タブを開き、elemeを追加することで、取得方法の要素を選択します<html>国税庁と分析されるそれぞれの同位体の質量。 </li><li>器具とサンプルの分析を実行し、機器のソフトウェアが自動的に分析される要素のそれぞれのための検量線を作成します。検量線は、標準がμg/ Lが中に、含まれていることを意味している金属の量に対して検出された金属のカウント/秒をプロットすることによってソフトウェアで作成されます。未知の試料中の金属の濃度を決定するための検量線を使用。 注記：検量線を使用して、ソフトウェアは、金属タンパク質標準の各々における金属の濃度を決定します。 </li><li>バルク分析結果から、銅の混合物を使用して、哺乳動物組織三最も豊富な微量元素を含む金属タンパク質標準を生成する、亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、最終的に銅と亜鉛とフェリチン（FTN）200μgの/ Lに希釈しました鉄の2,000μg/ Lを集中。 </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3。のHPLCシステムの設定とサイズ排除クロマトグラフィーカラムの平衡化注：彼らは両方とも約1必要なので、このセクションでは、以前に並行して行われるべきである - 完了するために、1.5時間を。 <ol><li>パージHPLCは、ステップ1.1で作製緩衝液ポンプおよび/分5mlを流速で5分間、ポンプをパージ。 </li><li>システムがパージされると0.1 ml /分での流速を設定し、サイズ排除カラム（4.6×300ミリメートル、3ミクロン、150オングストローム）を接続します。 注：チューブと列の間に湿った接続は、カラムの接続中にトラップされる気泡を回避することができます。 </li><li> PEEKチューブを使用して280nmでの吸光度を測定するように設定したUV検出器に列の反対側の端を接続します。 </li><li>徐々に0.05刻みでカラムの流量増加 - 0.4 mlの最終流量まで0.1ミリリットル/分/分に到達します。これが発生している間、任意の漏れの列にチューブの接続を確認してください。圧力を監視これはソフトウェアでクロマトグラムに圧力トレースを観察することによって、カラム容量を超えないようにするシステム。 </li><li> 10カラム容量 - 5の上に、必要な流量で平衡化するために列を残します。それは平衡化された後に、試料の分析が発生することを可能にする器具を接続します。 </li><li> 15分間、0.4ミリリットル/分でカラムを緩衝液AをポンプするためにHPLC法を設定します。 </li></ol> 4.設定とサイズ排除実行 - 誘導結合プラズマ - 質量分析法を注：操作手順は、楽器やモデルの間で異なる場合があります。 ICP-MSが使用されて構成する方法の詳細を学ぶために、機器の技術的な専門家にお問い合わせください。 <ol><li>ハードウェアの設定を変更する前にスタンバイモードにMS - ICPを置きます。 <ol><li>いったんスタンバイモードでは、オートサンプラのための通信をオフにして、「その他」のサンプル導入を変更します。 注：ソフトウェアとハ​​ードに依存試料導入源としてウェア構成の選択「HPLC」は、使用することができます。このオプションが利用可能であるかどうかを学習するための楽器技術専門家にお問い合わせください。 </li></ol></li><li>直接ICP-MS上の噴霧器にUV検出器からの流出を接続するためのPEEKチューブ（ID 0.13ミリメートル）を使用します。 </li><li>電源は、ICPのバックアップ - MSを、機器が10のためにウォームアップすることができます - 20分。 </li><li> HPLCオートサンプラーの背面にMS - プラズマが点火された後、ICPからリモートケーブルを接続します。プラズマが点火した後、これを行います。それ以外の場合はHPLCシステムは自動的にICP以来、シャットダウンします - MSがオンになっていません。 </li><li> LC-ICP-MSのデータを収集するためにICP-MS法を変更します。 <ol><li>スペクトルから時間解決取得（TRA）に取得方法を変更します。 </li><li> （ - 0.3秒、典型的には0.05の間）、鉄、銅、亜鉛、共同、私だけでなく、目的の任意の他の要素、および設定積分時間を分析する要素を選択します。関心aの要素の後選択された再、クロマトグラフィーのための実行時 ​​間に合わせて取得時間を調整する（ 例えば、15分クロマトグラフィーの実行のために900秒）。 </li><li>手動で曲ICP - クロマトグラフィーバッファがCsとのSbを使用して流れると感度との衝突セルヘリウムのためのMS（He）のガス流量は、バッファに含まれています。ヘリウム流量は、典型的には、バルク分析のために使用されるものより約1 ml /分以下です。金属イオン数が安定しており、相対標準偏差（RSD）の値が5％以下であると、システムが使用できるようになりました。 </li></ol></li><li> HPLCとICP-MSソフトウェアプログラムの両方でサンプル実行リストを作ります。サンプル実行リストは、サンプルのそれぞれが、データが保存されることにより、名前だけでなく、注入されるべき順序が含まれています。二つのプログラム間のリストの試合でサンプルの総数ことを確認してください。 </li><li> HPLCによる試料の注入は、ICPをトリガーするように、HPLCの前にICP-MS用のサンプルバッチを開始 - MSが収集を開始しますデータ。これは、正しい順序で行われていない場合には、欠落しているデータをもたらします。 </li><li> 6,000μg/ Lが200μg/ LがよりSODとFTN混合標準の様々なボリュームを注入することにより検量線のポイントを生成したCu＆Znおよび60,000μgの鉄のために/ Lに2,000μg/ Lがアップのためにカラムに注入。注入量は、1から30μlに及びます。 注：これらの濃度範囲は、典型的には、複雑なホモジネートにおいて観察鉄、銅および亜鉛の濃度を包含する。唯一の精製されたタンパク質を含む試料の場合、曲線の最大範囲は、それに応じて調整されるべきです。他の要因からのサンプル中の少ない汚染があるので、タンパク質に関連した金属の量としては小さいまたは大きい範囲を必要とするかもしれません。 </li><li>未知のサンプルの組織、血漿または細胞培養物のそれぞれを分析します。 </li></ol> 5.データ分析、操作と可視化<ol><li>カンマ区切り値（CSV）ファイル形式と負荷私にデータを格納Ntoの処理プログラム必要に応じて。 </li><li>計器ドリフトを制御するために、セシウムまたはSbのいずれかのために、毎秒カウントすることにより、各要素について秒当たりのカウントを分割。 </li><li>各元素の検量線を生成します。 <ol><li>それは好ましいデータ解析ソフトウェアでピーク積分を行うことにより、注射の各々のためにバインドされている金属タンパク質に対応する金属ピーク下の面積を決定します。 </li><li> CuおよびZnの6,000μg/ Lが2,000 - - 60,000μgの/鉄用L 200、各ランでカラムに注入した金属の総量に対する金属ピーク下の面積をプロットします。ソフトウェアプロトコルに従って線形回帰分析を実行します。 </li><li> PG /秒にカウント毎秒に変換する要因として、線形回帰分析からスロープ結果を使用してください。ライン値の勾配によりクロマトグラムを横切る第二のデータポイントあたりのカウントのそれぞれを分割します。 </li></ol></li><li>内のデータのグラフクロマトグラムの時間に対するPG /秒。関心のピーク下面積を決定します。ピークの下の面積は、PGで、タンパク質が結合された金属の合計量を表します。 </li><li>既知の金属タンパク質の分子量及びそれらが溶出した時刻に基づいてキャリブレーションを生成します。複雑なサンプル中のタンパク質のピークの大きさを推定するために使用します。 </li></ol>

<ol><li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li>
<li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Treatment+with+CuII+%28atsm%29+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer%27s+disease+is+due+to+transferrin+desaturation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+CHEM+NEUROSCI%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li>
<li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li>
<li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics%3A+challenges+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li>
<li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection%28SEC-ICP+MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+At.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li>
<li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Cu-%2C+Fe-%2C+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li>
<li>Richarz, A. N., Brätter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer%27s+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li>
<li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+iron%2C+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li>
<li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610(2009).</li>
</ol>

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タンパク質の天然状態を確保することが使用され、サンプルの保存が必要とされるバッファへの特別な注意を意味します。すべてのクロマトグラフィー技術または試料調製技術を用いることができません。サンプル調製およびクロマトグラフィーを通して使用される緩衝液は、生理学的pHと塩濃度を模倣する金属キレート剤と使用バッファを欠いていることが重要です。回避するために、他の条件はタンパク質変性剤（ 例えば 、尿素）のサンプルまたは付加を加熱することが含まれます。凍結融解サイクルの数を最小限にすることが重要です。二価金属を結合するための選択されたバッファの能力もまた重要であり、トリスまたは硝酸アンモニウムバッファは、リン酸ベースのバッファ上で選択されていることが理由です。 クロマトグラフィーの他の形態の低解像度およびサイズ​​排除クロマトグラフィーの相対ピーク容量は、この技術の主要な制限です。しかし、サイズ排除chromatograの、穏やかな性質PHYは、タンパク質の天然状態を維持し、比較的弱い金属 - タンパク質結合を維持することが重要です。タンパク質の天然状態を維持するための要件は、金属キレート剤（ 例えば 、EDTA）またはカオトロピック塩や界面活性剤を避け、凍結融解サイクルの数を制限するなどのサンプルの治療に特別な注意が必要です。 この技術の影響のこの低解像度、それはもっとして一つのタンパク質が含まれています見たピークのような複雑なサンプルである場合、特定のタンパク質と結合した金属の量を定量する能力。したがって、ピーク積分を用いて決定された金属の量は、タンパク質の全てがひとつの特定のタンパク質をこの時点で溶出なく、関連付けられた金属の総量の指標です。この制限を克服するために、目的のタンパク質は、さらに、天然の条件下で精製されなければなりません。これは、の定量化を可能にしますこのタンパク質に関連付けられている金属はcertainity度の高い報告します。この技術の別の潜在的な制限は、カラムへの非可逆的結合にタンパク質の損失になります。カラムから溶出したタンパク質の量は、これは注入量と一致するかどうかを決定するために分析されるこの回復実験が起こっているかどうかを決定するために行われるべきです。同じことは、溶出材料の金属含有量とバルクICP-MSによって出発物質を測定することによって行うことができます。カラム回復は使用条件に応じて異なり得るが、サイズ排除カラムからのタンパク質の完全な回復が9可能であることが示されています。したがって、使用されている動作条件の下で損失があるか否かをチェックすることが重要です。 プロトコルへの変更を解析要素と同様に使用される金属タンパク質標準に関連付けることができます。金属タンパク質の標準的な私たちのタイプedは関心のある要素によって異なります。例えば、Cu、FeおよびZnのタンパク質などの要素については、SODおよびフェリチンが使用されます。 stoichometriesを知られている任意の他の金属タンパク質も使用することができ、いくつかの例がここに示されています。 この技術を使用してから生じ得る一つの主要な合併症は、ICP-MSのトーチで塩結晶の蓄積です。システムを通過したか、トーチを洗浄する必要があることを、目視検査によって判定された場合、バッファ1000mlの - 塩結晶の蓄積を防止するために、トーチは、すべての500の後、蒸留水で洗浄します。発生する可能性があるもう一つの問題は、サンプルと抽出コーンの清潔でより急速な低下です。これらは、製造者のプロトコルに従って、定期的に清掃する必要があります。 初期試料調製プロトコルの中で最も重要なステップです。金属錯体INF - タンパク質に変更がある場合生成されたormationは有効になりません。これは、技術の主要な制限の一つです。加えて、低解像度の使用は、サイズ排除カラムは、生物学における金属タンパク質の真の複雑さの制限された詳細図が得られます。 ここに記載された技術は、生物のmetalloproteomeの知識を拡張することができます。バルク分析は、サンプル内の金属の量の変化の粗製の指標を与えます。考慮する必要がある一般的な考慮事項に加えて、この技術は、得られたトレースを比較することによって、異なるタンパク質、ならびに特定金属タンパク質と関連する金属の量を定量するために使用できるツールを提供します。この技術の使用は、疾患状態の違いを識別するために使用することができます。識別された金属タンパク質は、その後さらに、彼らは疾患プロセスにおいて果たす役割を決定するのを助けるために調査することができます。ハイフネーションされたICP-MSの適用が成長していますICP-MSは、薬物が結合タンパク質を同定するために使用することができるように、白金、ヨウ素または銅などのヘテロ原子を有する薬剤の役割を決定するために将来。

必須金属は、二次メッセンジャー経路、代謝経路と細胞小器官機能を含む通常の生物学的機能、で重要な役割を果たしています。全タンパク質の30％が金属タンパク質1、全ての酵素2の50％であると考えられています。金属酵素は、化学反応を触媒するタンパク質の構造を安定化させるための補因子として、またこのような二次メッセンジャーとして調節の役割のためにこれらの微量金属を使用します。神経変性の点で最も研究微量元素の一部は、銅、鉄、亜鉛3です。これらはdyshomeostasisによって影響悪影響を有することができ、多くの疾患経路に関与すると考えられています。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）に直接影響を与える寿命と筋萎縮性側索硬化症（ALS）4の家族型のトランスジェニックマウスモデルの表現型の金属状態。アルツハイマー病では、metalloproteomics技術は、pにおけるトランスフェリンの金属状態の低下を検出するために使用されていますlasma 5。これらの研究は、金属タンパク質が病気で遊ぶことができる重要な役割を強調表示します。 直接生体組織から金属タンパク質の研究が発展フィールドです。いくつかの金属酵素が特徴づけられているが、大半はまだ特徴付けられていないか、6未知のままです。金属タンパク質を測定する際の主要な課題の一つは、タンパク質7の本来の状態を維持するための必要条件です。古典的なボトムアッププロテオミクス技術は、ペプチドへのタンパク質の消化に依存しています。このプロセスは、金属およびそれらのタンパク質の非共有結合相互作用を破壊します。したがって、タンパク質の金属状態についての情報は得られていません。 質量分析8,9（SEC-ICP-MS） -この問題を克服する一つの方法は、誘導結合プラズマと対にサイズ排除クロマトグラフィーを使用することです。これは、タンパク質のおおよそのサイズに関する情報と同様に連想されている任意の金属を生成し、それ10でiated。また、サイズ排除は、酵素やタンパク質 - タンパク質複合体の本来の状態を維持することができます穏やかなクロマトグラフィー技術です。誘導結合プラズマを使用することの一つの利点 - 質量分析法（ICP-MS）は、技術の定量的な性質です。金属タンパク質標準のセットを使用して、生物学的試料9,11の金属タンパク質の絶対定量を提供することが可能です。これは、金属濃度の範囲にわたって既知の金属タンパク質を注入することによって標準曲線を生成することによって達成されます。 このプロトコルは、これが金属タンパク質標準の様々な達成することができる方法の一例を示しています。本稿では、主に鉄（Fe）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）、ヨウ素（I）、及びコバルト（Co）を含む生物学の分野で研究されている金属のための標準曲線を作成することを目指しています。

<table><tbody><tr><td>Agilent 1290 Infinity バイナリポンプ</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity オートサンプラー</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1200 シリーズオートサンプラー サーモスタット</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity サーモスタット カラムコンパートメント</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity 可変波長検出器</td><td>アジレント</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>アジレント 7700 ICP-MS</td><td>アジレント</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;水酸化アンモニウム微量金属基礎&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;硝酸アンモニウム&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>256064</td><td>実験当日に200mMの溶液を新規に作る</td></tr><tr><td>&nbsp;アンチノミー&nbsp;</td><td>チョイス・アナリティカル&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;セルロプラスミン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;セシウム&nbsp;</td><td>チョイス・アナリティカル&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;EDTAフリーの完全プロテアーゼ阻害剤&nbsp;&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;コンアルブミン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Canavalia ensiformis(ジャックビーン)のConcanavalin A&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Cu, Znスーパーオキシドジスムターゼ&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;フェリチン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ICP-MS多元素校正標準品&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>必要な濃度まで1%硝酸で作られ</td></tr>ました<tr><td>&nbsp;微量紫外線分光光度計&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;65%硝酸&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>100441</td><td>使用のために1%に希釈</td></tr><tr><td>されています&nbsp;ピークチューブ&nbsp;&nbsp;</td><td>アジレント</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;サイズ排除カラム BioSEC-3 PLC. カラム、4.6 x 300 mm、3 &mu;メートル、150&Aring;&nbsp;</td><td>アジレント</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>ケムサプライ</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;トリス塩酸塩&nbsp;</td><td>ICNバイオメディカルズ株式会社&nbsp;</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;サイログロブリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ビタミンB12&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

サイズ排除icp-msを用いた定量metalloproteomic分析のための基準

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

金属は、化学反応を触媒する補因子としてタンパク質の機能に不可欠です。金属の恒常性の破綻は、アルツハイマー病やパーキンソン病など多くの疾患に関与していますが、これらの金属が果たす正確な役割はまだ完全には解明されていません。金属タンパク質の同定には、多くの課題と困難が伴います。ここでは、複雑なサンプル中の金属タンパク質を定量できるアプローチについて報告します。これは、サイズ排除クロマトグラフィーと誘導結合プラズマ質量分析(SEC-ICP-MS)を組み合わせて使用することで達成されます。6種類の既知の金属タンパク質を使用して、サイズ排除カラムをキャリブレーションし、それぞれの微量元素(鉄、銅、亜鉛、コバルト、ヨウ素)を定量に使用できます。SEC-ICP-MSは、ヒトの脳と血漿の痕跡を示しています。これらの金属タンパク質標準物質の使用は、生物学的サンプル間の金属タンパク質存在量を定量的に比較する手段を提供します。この技術は、神経変性疾患における金属タンパク質の役割だけでなく、微量元素の不均衡が関与する他の疾患にも光を当てるのに役立つ態勢を整えています。

金属タンパク質標準を使用することは、サイズ排除カラムの較正を可能にする。 図1Aは標準のチログロブリン、フェリチン、セルロプラスミン、銅/亜鉛SOD及びそれらが結合している金属（鉄、に基づいて、ビタミンB 12の溶出プロフィールを示しますCO、銅、亜鉛、およびI）。 図1Bは、溶出体積の形式で提示分子タンパク質標準の重量およびそれらの溶出時間に基づいて、サイズ排除カラムの較正曲線は、（VE）の空隙容量で割っ示しますカラム（VO）。この標準曲線を生成するために使用されるタンパク質は、A、コンアルブミン、セルロプラスミン、フェリチン、SODとサイログロブリンコンカナバリンされています。 カラムに注入されたFeの60,000 PGおよび図2Dは ​​、回帰分析は、pを使用して実行される- 図2Aは、2,000の範囲にわたってフェリチンの溶出を示しますEAKエリア。 図2Bおよび図2Cは、溶出CuおよびZnのための銅/亜鉛SODのプロファイルと2Eと2Fが回帰がピーク面積を使用して生成された分析されています。回帰分析の結果は、タンパク質に関連した金属の量を定量的に決定することができるように、PG /秒カウント/秒で生データを変換するために使用されます。変換は、線形回帰（銅例えば 、334.6（カウント/秒）×（秒/ PG））の傾きにより、カウント/秒を分割することによって行われます。 述べたように、この技術は、複雑な生物学的試料中の金属タンパク質を同定するために用いることができます。人間の脳および血漿は、この技術に付し、3及び4は 、それぞれ、得られた結果を示しています。 SEC-ICP-MSによって分離人間の脳は、その各々が異なる金属を表し、 図3A-3Cに示されています<html>関心（銅、亜鉛または鉄）が図4A-4Cは、ヒト血漿を、この技術に供されたときに得られたトレースを示します 。サンプルの複雑さと豊かさが見られるピークの数に影響を与えます。予想されたように、プラズマは、セルロプラスミンおよびトランスフェリンを含むいくつかの金属タンパク質によって支配されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> サイズ排除クロマトグラフィーの 図1. キャリブレーション- 。それぞれの金属に基づく金属タンパク質基準で知られる金属タンパク質 （A）の溶出プロファイルを使用した質量分析法-誘導結合プラズマ 。 （B）タンパク質標準サイログロブリン（I）、フェリチン（II）、セルロプラスミン（III）、コンアルブミン（IV）、銅/亜鉛SOD（V）とコンカナバリンA（VI）の分子量校正曲線。&quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> フェリチンおよび金属タンパク質規格であるCu / ZnのSODの図2.使用は、複雑な生物学的サンプル中の金属タンパク質と銅、鉄や亜鉛関連の量を決定するために （A）の溶出プロファイルをフェリチンのための噴射範囲2000の上に- 。60,000μg/ Lが鉄の。それぞれ銅と亜鉛の6,000μg/ Lが、 - 200の噴射範囲で銅/亜鉛SODのための（B）及び（C）の溶出プロファイル。 （D）、（E）及び（F）金属、鉄、銅と亜鉛のための回帰分析の結果を示し、それぞれ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 人間の脳の図3のCu、FeとZnのMetalloproteome。（A）銅トレース（B）鉄トレース（C）亜鉛トレース。各金属のためのタンパク質標準の溶出は、グラフの下に示され、それらの分子量を持つ黒のトレースによって示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> ヒト血漿については、図4のCu、FeとZnのMetalloproteome。（A）銅トレース（B）鉄トレース（C）亜鉛トレース。各金属のためのタンパク質標準の溶出は、それらの分子量を持つ黒のトレース内で示されていますグラフの下にdicated。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)でハイフンでつながれたSize exclusion chromatographyは、生物学的サンプルから直接金属タンパク質の存在量の変化を測定するための強力なツールです。ここでは、未知のタンパク質に関連する分子量と金属量を推定するために使用される一連の金属タンパク質標準について説明します。

サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

この手法の全体的な目的は、既知のメタロプロテイン標準品を用いることで、複雑な標準試料中のさまざまなメタロプロテインを定量できるようにすることです。この方法は、生物学における金属の役割に関する重要な疑問に答えることができます。例えば、疾患によってタンパク質の金属状態がどのように変化するか、といった点です。この手法の主な利点は、タンパク質の金属状態を天然状態で測定できることです。本手法の実演は、私の研究室の博士課程学生であるAmber Lothianが行います。まず、Tris緩衝生理食塩水を用い、手動でのホモジナイズまたは5分間の超音波処理によって、組織または細胞培養サンプルを均質化します。16,000 ×gで5分間遠心分離し、ホモジネートを清澄化します。得られた上清を回収し、テキストプロトコルに記載されている方法でタンパク質濃度を測定して、全タンパク質量を標準化します。メーカーのプロトコルに従い、誘導結合プラズマ質量分析計のウォームアップとチューニングを行います。1%硝酸を用いて、メタロプロテイン標準物質を0から500 µg/Lの範囲に収まるように希釈します。この範囲の標準物質を作成する場合、希釈倍率は1:20を超えないようにしてください。まず7段階の検量線レベルを分析し、注入順序を設定します。0から500 µg/Lの範囲の濃度を設定し、続いてメタロプロテイン標準物質を添加します。7段階の校正レベルは、0、1、5、10、50、100、および500 µg/Lです。次に、目的の元素を選択します。ここでは、鉄、銅、亜鉛、コバルト、およびヨウ素を使用します。これらはタンパク質標準物質に結合している元素であるためです。元素セレクタータブを開き、分析対象となる元素とそれぞれの同位体質量を追加して、取得方法の中でこれらの元素を選択してください。次に、装置を用いて試料分析を行います。装置ソフトウェアによって、分析対象となる各元素の検量線が自動的に作成されます。この検量線を用いて、未知試料中の金属濃度を決定します。バルク分析の結果から、銅、亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ、およびフェリチンを混合し、哺乳類組織に最も豊富に含まれる3つの微量元素を含むメタロプロテイン標準試料を作成します。ハイパフォーマンス高速液体クロマトグラフィー（HPLC）ポンプを、200 millimolar 硝酸アンモニウム緩衝液を用いて、流量 5 milliliters per minute で5分間パージします。システムのパージが完了したら、流量を 0.1 milliliters per minute に設定します。次に、サイズ排除カラムを接続します。カラムの反対側をピークチューブを用いてUV検出器に接続し、吸光度を280 nmに設定します。カラムの流速を0.1 mL/minずつ段階的に上げ、最終的に0.4 mL/minに到達させます。この操作の間、カラムへのチューブ接続部に漏れがないか確認します。ソフトウェア上のクロマトグラムの圧力トレースを観察し、システムの圧力がカラムの規定値を超えないように監視してください。カラムを規定の流量で5〜10カラムボリューム分平衡化させます。平衡状態に達した後、装置を接続してサンプル分析が行えるようにします。HPLCメソッドを設定し、バッファーAを0.4 mL/minの流速で15分間カラムにポンプ注入します。ハードウェア設定を変更する前に、ICPMSをスタンバイモードに設定してください。スタンバイモードになったら、オートサンプラーの通信をオフにし、試料導入を「other」に変更します。PEEKチューブを使用して、UV検出器からの流出路をICPMSのネブライザーに直接接続します。ICPMSの電源を入れ、10〜20分間ウォームアップさせます。プラズマ点灯後、ICPMSからのリモートケーブルをHPLCオートサンプラーの背面に接続します。必ずプラズマが点灯してから行ってください。そうしないと、ICPMSがオンになっていないため、HPLCシステムが自動的にシャットダウンされます。まず、データ収集方法をスペクトラム測定からタイムリゾルブ測定に変更し、ICPMSメソッドをLC-ICPMS用に変更します。次に、鉄、銅、亜鉛、コバルト、ヨウ素、およびその他の関心のある分析元素を選択し、積分時間を設定します。目的の元素を選択した後、取得時間をクロマトグラフィーのランタイムに合わせて調整します。セシウムとアンチモンを含むクロマトグラフィーバッファーを流しながら、感度とコリジョンセルのヘリウムガス流量に合わせてICPMSを手動でチューニングします。金属イオンカウントが安定し、相対標準偏差の値が5%以下になった時点で、システムは使用可能な状態になります。HPLCおよびICPMSの両方のソフトウェアプログラムでサンプルランリストを作成します。サンプルランリストには、各サンプルの注入順序およびデータの保存名を含めます。2つのプログラム間で、リスト内のサンプル総数が一致していることを確認してください。HPLCによるサンプルの注入がICPMSのデータ収集開始のトリガーとなるため、HPLCよりも先にICPMSのサンプルバッチを開始してください。この手順を正しい順序で行わないと、データ欠損が発生します。スーパーオキシドディスムターゼとフェリチンの混合標準液を異なる量で注入し、検量線のプロット点を作成します。注入量は1 µLから30 µLの範囲とします。最後に、テキストプロトコルに記載されているデータ解析を行う前に、組織、血漿、または細胞培養などの未知試料をそれぞれ分析します。カラムに注入された鉄量が 2000 から 60,000 picograms の範囲におけるフェリチンの溶出図を示します。回帰分析はピーク面積を用いて行いました。銅、亜鉛、およびスーパーオキシドディスムターゼの溶出プロファイルについても、銅と亜鉛の両方について示しています。ピーク面積を用いて算出した回帰分析の結果も示します。この回帰分析の結果を用いて、1秒あたりのカウント数で表される生データを1秒あたりのピコグラムに変換します。これにより、タンパク質に結合している金属量を定量的に決定することが可能になります。この手法は、複雑な生物学的試料中のメタロプロテインを同定するために利用できます。ここでは、SEC ICPMSによって分離されたヒト脳の例を示します。それぞれが異なる目的の金属を表しています。具体的には、銅、亜鉛、または鉄です。ここに示されているのは、ヒト血漿にこの手法を適用した際に得られたトレースです。サンプルの複雑さと含有量は、観察されるピークの数に影響します。予想通り、血漿はセルロプラスミンやトランスフェリンなどの少数のメタロプロテインによって支配されています。このビデオを視聴することで、複合試料中のメタロプロテインのネイティブ状態を測定するための装置のセットアップ方法について、十分な理解を得ることができるはずです。この手法を習得すれば、3〜4時間で正常に適用することが可能です。これにより、1日で20〜36検体を分析することが可能です。この手順を行う際は、銅や亜鉛に関心がある場合は銅亜鉛SODなど、適切なメタロプロテイン標準試料を使用することが重要です。また、セシウムなどの緩衝液中の内部標準を用いることで、時間の経過に伴う機器のドリフトを補正することができます。この手順に続き、他の形式の質量分析法を導入することで、重要な疑問を解決することも可能です。例えば、「サンプル中にどのようなメタロプロテインが存在するか」といった点です。これは、標準的なトリプシン消化と質量分析によるタンパク質ペプチドシーケンシングによって行うことができます。あるいは、タンパク質を天然状態でそのまま解析する方法もあります。この技術の開発により、プロテオミクス分野の研究者が、アルツハイマー病などの疾患におけるメタロプロテインの役割を理解するための道が開かれます。高濃度の硝酸および臨床検体を取り扱う際は、十分にご注意ください。適切な個人用保護具を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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プロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための生体液からの細胞外小胞の化学的親和性に基づく単離(英語)

学ぶサイズ排除クロマトグラフィーとICP-MSを組み合わせたメタロタンパク質の定量分析法。生体試料中のタンパク質の金属状態を測定し、疾患メカニズムの解明に貢献します。

サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準

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