RNAiのトリガ配信へ

本手法の総合的な目的は、Anopheles gambiaeにおいてRNA干渉トリガーを導入し、蛹期の発生段階から遺伝子ノックダウンを開始させることです。この手法は、ベクター生物学分野における重要な疑問への回答に寄与し、前成虫期または成虫初期の発生段階で役割を果たす遺伝子の解明に役立ちます。本技法の主な利点は、これまでRNA干渉の注入プロトコルが実施されていなかった発生間隔である蛹期に遺伝子ノックダウンを開始させることで、研究者が迅速な機能ゲノミクス研究を行う機会を提供できる点にあります。

注入工程には高い精度が求められ、またこの発生段階の蛹は非常に繊細であるため、習得が困難な場合があります。したがって、本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。目的の遺伝子を選択した後、オフターゲット効果がないと予測される200から800 base pairの領域を特定し、標準的なPCR増幅を行って、T7プロモーター配列に挟まれた二本鎖RNA合成用テンプレートを取得します。次に、二本鎖RNAを合成し、市販のin vitroキットを用いて生成物を精製します。

最終的なRNA濃度を3 µg/µLに調整します。次に、標準的な2%アガロースゲルを用いて、0.5 µLの二本鎖RNAをテンプレートDNAおよび標準マーカーと比較します。電気泳動後、二本鎖RNAバンドの品質と長さを確認してください。

非特異的な産物は見られないはずです。二本鎖RNAはテンプレートDNAよりも緩やかに移動します。保存には、二本鎖RNAを分注し、-20°Cで保管してください。

Fast Green FCF染料の調製から開始します。まず、RNase-Free waterを用いて、染料を0.1%（v/v）に希釈します。次に、調製した液を1 µLずつ1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

水分を蒸発させるため、試料を入れたチューブを65 °Cで約3時間加熱します。その後、染料固形物を使用する前に、チューブを30分以上冷却します。次に、ホウケイ酸ガラス管からガラス引き伸ばし法を用いて注入針を作製します。

ニードルプラーを、チップ径が10〜30µmになるように設定します。成理化（NARISHIGE）製キャピラリープラーを使用する場合、第1ヒーターを100に、第2ヒーターを70に設定してください。その後、キャピラリーニードルをクランプし、引き伸ばし操作を行います。

次に、注入ステーションを準備します。顕微鏡下で容易に操作できるプラットフォームを選択してください。プラットフォームの上に、まず厚手のろ紙をテープで固定します。

次に、厚手のろ紙の上に薄いろ紙1枚をテープで固定します。続いて、ダイ染料の固形チューブに、注入する各二本鎖RNAを10 µLずつ加え、ダイを再懸濁させます。これらのチューブを氷上で保存してください。

次に、注入に使用する蛹を回収します。直径60mmのペトリ皿に10mLの脱イオン水を満たし、プラスチック製転送ピペットを用いて、淡色の蛹を約50匹皿に移します。中程度から濃い褐色まで硬化が進んだ蛹は、角質層が損傷し生存率が低下するため、色素沈着が少ない蛹のみを使用してください。

マイクロインジェクションの最初のステップは、針の先端を開孔することです。顕微鏡下で、精密ピンセットを用いて針の最先端部を切り離します。次に、30ゲージの針とシリンジを用いて、針にミネラルオイルを満たします。

充填後、マイクロインジェクターを使用して余分なオイルを排出します。マイクロインジェクターを69 nanoliterの容量で吸引するように設定します。その後、準備した注入用RNAで針をフロントフィルします。

二本鎖RNAの分注に問題がないか確認してください。チップの詰まりや針の固定不十分が主な問題の原因となります。インジェクターの準備が整ったら、蛹を1〜3匹選び、フィルターペーパーを敷いたステージに移します。

筆を用いて、蛹の背面クチクラが操作しやすい向きに調整します。ろ紙の上で軽く押さえることで、蛹に付着した余分な水分を吸収させます。濡らした筆で蛹を固定しながら、腹部と胸部の間の背面クチクラに対し、前方から後方への動きで、約30度の角度で針を刺入します。

次に、2本鎖RNAを1〜2パルス分、血リンパに注入します。注入が成功すれば、染料が全身に拡散するのが確認できるはずです。蛹に注入する際は、針で背側の角皮のみを貫通させることが極めて重要です。

針の刺入が腹側の角皮を貫通した場合、蛹の外側に染料でラベル付けされた液体の溜まりが見られるか、あるいは染料がフィルターペーパーに移ります。このような場合は、その蛹を廃棄しなければなりません。染料が血リンパ全体に拡散しない場合は、チップが詰まっている可能性が高いと考えられます。

チップをわずかに動かし、RNAと色素が放出されたかを確認します。色素の放出が認められない場合は、その蛹を廃棄してください。その後、針先を確認し、新しい蛹に対して再度注入を行います。

蛹への注入が成功したら、濡らした筆を使用して針から慎重に外し、発生を完了させるための水が入ったシャーレに移動させます。注入した蛹が入ったシャーレを、通常の飼育条件下で蚊のケージまたは容器内に置きます。成虫の餌として、10% w/vのグルコース溶液を染み込ませた脱脂綿を用意します。

成虫が羽化した後、コントロール群と比較します。例えば、SRPN2のダブルストランド個体については、偽腫瘍の形成がないか毎日評価する必要があります。そのためには、成虫を−20°Cで2〜3分間冷却し、2°Cのコールドプレートに移して観察します。

成虫の観察後、それらを昆虫飼育エリアに戻します。この手法を習得した後、注入した蛹の羽化率は約70%となりました。注入した蛹の一部では、蛹殻からの不完全な羽化が起こり、生存不能な蚊となりました。注入した蚊と注入していない蚊の間で羽化率に遅延は見られず、注入による影響は性別によって差はありませんでした。

羽化から10日後、注入された蚊の生存率に、非注入のコントロール群と比較して顕著な変化は見られなかった。二本鎖RNA注入のポジティブコントロールとしてセリンプロテアーゼ阻害剤であるSRPN2を、ネガティブコントロールとして二本鎖LacZを使用した。羽化から3日後までに、二本鎖SRPN2を注入した成虫において、光学顕微鏡で確認できる偽腫瘍が認められた。

8日後、擬腫瘍が非常に顕著に認められました。成虫期の蚊において、二本鎖SRPN2を注入した個体の大部分では、角皮を通して黒化 pseudotumors が観察されましたが、コントロール群では擬腫瘍は観察されませんでした。注入から5日後、二本鎖SRPN2を注入した蚊におけるSRPN2タンパク質レベルは、二本鎖LacZを注入したコントロール群および非注入コントロール群と比較して、有意に低下していました。

このビデオを視聴することで、新しく開発された注入プロトコルを用いて、Anopheles gambiaeの蛹にRNA干渉トリガーを導入する方法を十分に理解できるはずです。一般的に、この手法に不慣れな人は蛹の予測不可能な動きに苦労します。しかし、蛹の正しい位置決めと固定を練習することで、注入の成功率と注入の質を大幅に向上させることができます。

この手技に習熟すれば、蛹1個あたりの注入時間は約30秒となります。本手法の開発により、ベクター生物学分野の研究者が、マラリア媒介蚊であるAnopheles gambiaeの前成虫期および成虫初期の発生段階における遺伝子機能を探索・評価するための道が開かれました。本手順の後、ウェスタンブロット解析や定量PCRなどの手法を用いることで、標的遺伝子のノックダウン程度を、それぞれタンパク質レベルまたは転写産物レベルで決定することができます。

最終的に、この手法は蚊による寄生虫伝播に不可欠な遺伝子の特定に寄与し、新たな標的の同定および、より効果的な媒介生物管理戦略を構築するための新たな知見を得るのに役立つと考えられます。