Name: RNAiのトリガ配信へハマダラカ蛹 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶRNAiトリガ配信法をAnopheles gambiaeの蛹期に適用し、ベクター生物学における遺伝子機能を解明する。マイクロインジェクション技術により、発生初期段階の遺伝子ノックダウンを実現し、マラリア媒介蚊の制御戦略に新たな知見を提供する。

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この研究で使用されたG3コロニーとLacZテンプレートDNAを私たちの研究室に提供してくださったフラミニア・カッテルッチャ博士と彼女の研究グループ（ハーバード大学公衆衛生大学院、ボストン、マサチューセッツ州)に感謝いたします。昆虫の維持に協力してくれたAdam Jenkins(ボストンカレッジ、マサチューセッツ州チェスナットヒル)に感謝します。ボストンカレッジの生物学部は、この技術の開発に関連する研究に寛大に資金を提供しました。

1.合成と準備のdsRNA <ol><li>何も識別可能なオフターゲット効果を持たないことが予測され、目的の遺伝子内（対応するdsRNAを生成する）200〜800 bpのノックダウンの領域を特定する（ 例えば 、別の遺伝子内の配列相同性≥18BP）および陰性対照（ 例えば 、 、このような大腸菌 lacZ遺伝子などの標的昆虫ゲノム（GenBankの遺伝子ID：945006）内に存在しない異種配列。あるいは、SRPN2 21,22として簡単に観察される表現型を、もたらすポジティブコントロール（ 例えば 、使用、GenBankの遺伝子ID：1270169）を標的とするdsRNA SRPN2の配列は、ミシェルらに定義されている（2005年）21。。 注：E-RNAiは、そのような領域の同定のためおよびオリゴヌクレオチドプライマー23の設計プロセスのために有用であるオープンソースのバイオインフォマティクスリソースです。 </li><li>秒を実行しますT7プロモーター配列に隣接するdsRNA合成テンプレート（5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;）を取得したdsRNA製剤を続行するゲノムDNAまたはcDNAテンプレートを用いtandard PCR増幅（ すなわち 、30〜35サイクルを使用して、Taq DNAポリメラーゼを用いて行った）とクリーンアップ、製造者の指示に従って、商業インビトロ転写キットを用いて。 らに提示されるようSRPN2 PCR増幅条件およびプライマーの情報を使用してください。（2011）22。 </li><li>波長260nmの紫外吸光分光法により精製されたRNAアンプリコンの収量を定量化し、RNaseフリー水で所望の濃度（ 例えば 、3μgの/μl）をに調整します。 <ol><li>低RNA濃度をトラブルシューティングするために、室温で真空遠心でサンプルをスピンダウンしてか、サンプルを凍結乾燥し、水のより少量で再構成することにより液量を減らします。サンプルの凍結乾燥に要する時間が依存して変化します初期試料容積とのdsRNA濃度に。 </li></ol></li><li> 1×TBEまたはTAEを用いて調製し、2％アガロースゲル上でのdsRNAの品質と長さを確認するバッファと転写反応に使用される鋳型DNAと共に、エチジウムブロマイド（EtBrを）で染色しました。 dsRNAは、鋳型DNAよりもゆっくりと移動します。品質および長さには、非特異的なdsRNA産物が存在しない保証することによって、それぞれの標準的なDNAマーカーを用いて製品を比較することによって評価することができます。 注：EtBrを、強力な変異原であり、それに応じて処理されるべきです。 注：/μlの3μgのののdsRNA濃度では、サンプルの0.5μlをEtBrを、染色アガロースゲル上で可視化のために十分以上です。 </li><li>必要になるまで-20℃でのdsRNAを保管してください。アリコートは、dsRNAの大量のために準備される必要がありますので、複数回の凍結/融解サイクルは、劣化を引き起こす可能性があります。 </li></ol> 2.ファストグリーンFCF染料（FGD）チューブを準備します<ol><li>ファストグリーンFCF色素を希釈RNaseフリー水中0.1％（v / v）の（使用液）の原液（≥85％の染料含有量）から。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブの底への色素のピペットで1μlの。 </li><li>約3時間65℃のヒートブロックに入れチューブを使用する前に冷却するために、少なくとも30分間室温で管を配置し、その後、液体蒸発します。この乾燥固体染料は、dsRNAの再懸濁溶液中に再構成します。 </li></ol> 3.プル注射針<ol><li> 10〜30μmでの先端径に加熱されたニードルプラーを使用してホウケイ酸ガラス針を引き出します。ノーヒーター調整：プル設定はに対応しています。 = 100 1、ヒーターの調整なし。 2 = 70。 </li><li>針の先端の細いへの損傷を避けるために、パテを成形するストリップ上のペトリ皿に水平にすべて引っ張ら針を配置します。 注：メソッドを引っ張るキャピラリ針のための追加情報は、マラリア研究およびリファレンス試薬リソースセンターMにさらに詳細に記載されていますR4マニュアル24。 </li></ol> 4.注入ステーションを準備します<ol><li>必要な材料を収集：ガラスマイクロキャピラリー針は、ペトリ皿、転送ピペット、ペイントブラシや光学顕微鏡を解剖、先端の細い、微量注入、薄いフィルター紙や厚手のろ紙に引っ張りました。 </li><li>マイクロインジェクターマニュアルの指示に従ってマイクロインジェクターを用意し、パルス当たりの所望の容量（ 例えば 、パルスあたり69 NLの最大値）に注入量を設定します。 </li><li>顕微鏡下で操縦するのは簡単であるプラットフォームでは（ 例えば 、発泡スチロールのチューブラックの平らな面）は、上に薄い濾紙で2つのフィルタ用紙をスタックし、エッジの周りにテープで固定します。 </li><li>氷の上の各のdsRNA別々の着色染料チューブ内の溶液、および場所の10μLを再懸濁します。 </li></ol> 5.注射用蛹を収集<ol><li>イオン交換水10ミリリットルと小さい60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿を記入し、〜50淡い蛹を収集（ドゥリ使い捨てのプラスチック製トランスファーピペットを用いて、昆虫館トレイから蛹化後の最初の24時間）ngの。 </li><li>ダークキューティクルの日焼けにメディアを持っている任意の蛹を削除します。 注：キューティクルは日焼けし始めると、それは非常に高い死亡率にクチクラ、射出結果を貫通することがより困難になります。 </li></ol> 6. dsRNAをインジェクション<ol><li>解剖顕微鏡下で、微細なピ​​ンセットで注射針の先端を断ちます。 </li><li> （3インチ、30ゲージ針で注射器を用いて）、およびマイクロインジェクターで余分な油を排出鉱物油で針を埋め戻すことにより、注射針を準備します。 </li><li>フロントdsRNAの最大量で注射針を記入し、液体の分配を確保するために、顕微鏡下で1パルスを取り出します。液体が取り込まれていないおよび/または追放された場合には、任意の閉塞のために、針の先端をチェックして、針がしっかりmicroinjectoに固定されていることを確認rを。 </li><li> 1-3蛹を選んで、ろ紙上に置いてください。 </li><li>絵筆を使用して、アクセス可能な背側クチクラでろ紙上の蛹を置き、ろ紙上にプッシュし、余分な水分を吸収するために絵筆を使用しています。 </li><li>絵筆の先端で蛹を安定化し、蛹の背面に関連して約30°の角度で胸部と腹部の間の背側クチクラに針を挿入します。注射は蛹の後端に向かうべきであり、針が前方対後方方向に移動させなければなりません。 </li><li>血リンパに3μgの/μlのdsRNAのソリューションの二つのパルス（パルスあたり69 NL）を注入し、そして体全体の色の分布を確認してください。何色が識別されない場合は、障害物からチップをクリアするためにわずかに注射針の位置を移動し、液体供給を繰り返します。 </li><li>優しく培養のために水の中に針から蛹を移動するために湿らせた絵筆を使用してください。 T彼は軽い接触時に絵筆に固執する必要があり蛹。 </li></ol> 7.ポスト噴射条件<ol><li>適切な空気の流れ（ 例えば 、メッシュケージまたはメッシュふた付き容器）と蚊のケージに注入された蛹でペトリ皿を置きます。蛹の飼育条件は、27±3℃の温度、75±5％の湿度で一貫したままと光の下でなければなりません：8時間：16の明暗サイクル。 </li><li> 10％（w / v）のグルコース溶液を用意し、大人の給電用の蚊ケージメッシュ上にソリューション飽和コットンボールを置きます。 </li></ol> 8.ノックダウンを評価します<ol><li>所望の時間点（s）で、対照と比較して、実験的なdsRNAを注入した昆虫に表現型を評価します。 <ol><li> 、-20℃で約2-3分間大人のダウン冷却する2℃のコールドプレートに転送し、15Xで解剖顕微鏡を利用して任意の擬似腫瘍形成を識別することによって、毎日dsSRPN2とdsLacZ昆虫を評価します明視野照明と倍率。評価後、昆虫館条件（27±3℃、75±5％の湿度）に大人を返します。 注：このプロトコルで用いた実験と対照dsRNAは、それぞれ、dsSRPN2とdsLacZです。コントロールに適した多くのオプションがあります。しかしながら、それが示唆された表現型および/ ​​または発現を容易におよび/ ​​または定量化[ 例えば 、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）、ウェスタンブロット]は使用されるべきである（ 例えば 、顕微鏡解剖によって）視覚化された陽性対照ウエスタンブロットおよび定量RT-PCRを介して、この技術。SRPN2タンパク質および転写物の定量を学習する際に、それぞれ、 ら。（2005）21ミシェルに記載されています。 </li></ol></li></ol>

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蚊に非トランスジェニックRNAiを誘導するための現在の方法は、成人の血体腔12,13またはRNAiトリガーコーティングされたナノ粒子14-17または微細藻類ベースのdsRNAが18を分子の幼虫の摂食へのdsRNAの直接注入を伴います。大人の蚊対象に、非常に貴重な一方で、以前の発育期間中に機能する多数の遺伝子を除外することができます。幼虫の摂食によって開始されたノックダウンは蛹を介して可変タンパク質の持続性の潜在的に、部分的に起因大人の段階で一貫性のない表現型をもたらすことができます。したがって、より完全に成人期の間の遺伝子機能を評価するために、遺伝子予め大人の発達段階の間の機能、ならびに強化された能力を評価するための手段を提供する蛹開発中のRNAiを開始する時に特異的に目的とする付加的な方法を導入します。 dsRNAを注入または発現に基づく遺伝子ノックダウンのアプローチと同様に、遺伝子の持続性はノックダウン予測することはできません。したがって、転写物またはタンパク質のレベルは、関心の発達期間中に目的の遺伝子のために評価されるべきです。我々はSRPN2 dsRNAを注入した動物にSRPN2のために5日目注射後にタンパク質レベルを減少させたの継続を観察しているが、このようなタンパク質の代謝回転および半減期などの要因が異なるターゲットで異なることができます。 dsRNAは、注射のために使用すること、ならびに、確保することが重要であるだけでなく濃縮し、アガロースゲル上でそのまま表示されます。私たちは、ノックダウンの結果が十分でない場合の実験者がこれらの要因を再評価をお勧めします、とdsRNAのそれぞれの濃度は、特定の遺伝子標的のために経験的にテストする必要があります。 我々はアンの蛹中にRNA干渉の開始のための方法を説明します。ハマダラカの開発。この方法は、直接、早期蛹の血体腔へのdsRNAのマイクロインジェクションを介して導入に依存しているとすることにより、注射品質の評価が可能色素標識dsRNAの使用。注射の質を視覚化する能力は、成功したノックダウンを確保するための重要な強化を構成し、成人期に焦点を当て、最も以前に報告されたdsRNAベースのプロトコルでは考慮されていない注入に基づく遺伝子ノックダウンの態様を構成します。この発達期間の開始時に蛹を標的とすることによって、この重要な発達期間中、または成人期の初期段階で役割を果たしている可能性がある遺伝子が機能的に評価することができます。さらに、この方法は、変態中にアクセスされている細胞内のdsRNAの細胞への送達、およびRNA干渉の確立を可能にするかもしれないが、完全に形成された大人の蚊でアクセスしにくいです。 ハーカーらによる最近のマイクロアレイ解析。（2012）560 アンを同定しました。アップレギュレートまたは胚から成人までの範囲の、異なる発生段階の間に少なくとも4倍ダウンレギュレートされたハマダラカ転写物。 56の0転写物が同定され、309のセットは、蛹の開発27の間にアップレギュレートされました。これらの知見は、蛹の段階で発生するもの、生物が変態を受け、その間に間隔を含む蚊の開発を通じてディファレンシャル遺伝子発現のための多くの要件が存在することを示唆しています。 アン含む多くの昆虫種、で。ハマダラカ 、このような開発（ すなわち 、蛹クチクラとキチン結合タンパク質）27-31、免疫応答のようなプロセスに関与する遺伝子（ すなわち 、トール受容体様タンパク質）27,32-34が非常に蛹の段階の間に発現されています。完全に形成された成体が出現したら、環境および生理学的に35の変化に応答して遺伝子発現が継続されます。特に、初期の大人の開発中に、発生遺伝子（ すなわち 、大人のクチクラと筋タンパク質）36、の発現の増加だけでなく、他の重要な遺伝子が存在する（ すなわち、 </em&gt;、精子特異的タンパク質およびシトクロムP450代謝酵素）27,36。 このプロトコル、SRPN2の開発に使用される陽性対照は、 アンです。ハマダラカセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）。 SRPN2は昆虫メラニン、昆虫21,22における幅広いスペクトル先天性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしています。擬似腫瘍形成21,22、容易に光学顕微鏡を使用することによって観察される表現型の大人の蚊結果のSRPN2のノックダウン。この明確な表現型は簡単に生昆虫で得点することができることを考えると、我々は初期の蛹のRNAiの注射のためにSRPN2を使用していました。また、SRPN2により早期成人蛹のRNAi注入と機能の評価のための良好な標的を提供し、すべての発育段階37の間に発現されます。我々は、我々が開発した方法は、同様の成人黒色偽のを誘導することができることを実証します<html>開発の蛹中に実行するdsRNA注射の結果としてのo-腫瘍形成。このプロトコルを開発する際に、我々は（ すなわち 、幼虫、蛹の脱皮後の最初の24時間）は、最適な羽化を得るために重要である早期蛹の開発時に、その注射を観察しています。貧しい出現は、注射後に得られた場合には、我々はあまり大規模なキューティクルの強化で蛹を取得し、早期蛹注入が達成される保証するために、より高い精度で幼虫をステージングすることをお勧めします。さらに、最適な出現率のキューティクル結果へのダメージを最小限に抑え、注入中に倍率を大きくすると、動物の唯一の意図した領域がパンクしていることを確認することができます。針が腹キューティクルまで穿刺した場合は、色素で標識された液体のプールは蛹の外側には明らかであろうか、ろ紙を飽和さ。非常に複数のキューティクル穿刺を持つ任意の蛹を破棄することをお勧めします。 大人の蚊注射の性能に多くの研究室の豊富な経験とjove_content &quot;&gt;、以前に同定されたマイクロインジェクションのアプローチは蛹RNAi実験で使用するための単純なプロトコルの変更に適合させることができる。全体的に、この方法の目的は、研究者の能力を提供することです遺伝的分析は、さらに新たなベクトル制御戦略の開発を支援する研究を可能にする、実行することができ、逆その間の時間枠を展開します。興味深いことに、このようなRhodniusのprolixusおよびヨトウガのような他の種での実験は、サイレンシング効果はあまりになる傾向があり、その遺伝子を明らかに前成体は38,39段の間に大きいとき、開発のあらゆる段階で、RNAiを介した遺伝子ノックダウンは、遺伝子サイレンシング、および標的遺伝子がコードするタンパク質の安定性の迅速性と持続性に関する考慮事項に従うものとします。開始。理想的なRNAi標的遺伝子はproteiをコードするものとなる傾向がありますnまたは短い半減期と高い離職率11,40を有しているRNA。 トランスジェニックRNAiの戦略はまた、前成体期中速さとRNAiの持続性に関する考慮事項に対処するために使用することができるが、遺伝子組換え技術は、昆虫を生成するために、蚊の交配のための多くの欠点（ 例えば 、トランスジェニック系統の生成に必要な時間、実験時間フレームを持っています規制dsRNA発現、およびトランスジェニック株のメンテナンス）で。これとは対照的に、我々のプロトコルは、蛹、開発中および発信や変態中にアクセス可能ですが、大人にはあまりアクセス可能な細胞型において遺伝子ノックダウンを開始するための簡単​​かつ迅速にする方法を提供します。色素標識のdsRNA懸濁液の使用は蛹内導入物質の注入の成功と分散の容易な評価が可能になります。大人のように注射した動物と比較して、蛹注入成人における腫瘍形成の発症に関する我々のデータは、初期化と一致しています蛹の段階でのRNAi媒介ノックダウンのiation。私たちのG3蚊ラインを使用して、私たちの昆虫館の条件下で、私たちは早くも10日のような大人の注射後の成人黒色擬似腫瘍形成を観察すると、3〜5日後に出現注入。早期蛹段噴射を行うことにより、我々は、早ければ5日後に注射（ すなわち 、3〜4日が出現後）として目に見える黒色擬似腫瘍形成を観察します。これらのデータは、この方法は以前の下で研究された発育期間（ すなわち 、蛹の開発）の間に遺伝子ノックダウンの開始を可能にすることを示唆しています。我々の色素標識法はまた、すべての幼虫齢時に表皮の半透明の性質に起因する新たな幼虫の注入プロトコルの開発に有用であろう。本研究で用いた制御は、ノックダウンの表現型を表示するには、成人期への進行を必要とするが、早期蛹の注射後の蛹特有の表現型を評価するための将来の実験が提供されますこのような後半蛹の開発など、追加の発育期間中に、この方法の拡張に関する貴重な洞察。要約すると、この方法は、RNAi媒介遺伝子ノックダウンの蛹開始のための貴重なRNAiのプロトコルを提供し、ベクトル昆虫研究コミュニティ内で使用可能な機能ゲノムツールを拡張します。

マラリアは毎年、個人の何百万人に影響を与える蚊が媒介する感染症です。世界保健機関（WHO）は2013年に5年1歳未満の子供に発生した78パーセントそのうちのマラリアによる約584000人の死亡があったことを報告しています。人間のマラリアを引き起こす病原体は、属マラリア原虫内アピコンプレクサ寄生虫であり、メスのハマダラカによって、その人のホスト間で伝送されます。蚊が感染している個体からの血液食事をとり、その後、堆積物は、その後の血液の食事に感染していない個体に寄生虫を感染性ときに送信が発生します。属ハマダラカの中では、 ハマダラカは最大ベクトル容量を持つ種で、サハラ以南のアフリカ1-3で最も著名なマラリアベクトルです。 現在、殺虫剤の展開によって蚊のベクトル制御は、bに続け人間のマラリアの負担を軽減するために採用の主要な方法を電子。 1960年代からの殺虫剤の使用は、非常に成功することが証明されたが、殺虫剤抵抗性の上昇は、新規な殺虫剤及び代替ベクトル制御戦略4-7の開発の必要性が駆動しています。 2010年に、WHOへの報告49 63の国の合計は、マラリアベクトル1の殺虫剤抵抗性の発生を示しました。さらに、Afrotropical地域における抵抗データを評価するための査読論文を利用IRマッパー・ツールは、2001年と2012年の間に、それぞれ7ピレスロイドとジクロロジフェニルトリクロロエタン（DDT）のに抵抗が46％と27％増加するが、そこにあったことを報告しています。 RNA干渉（RNAi）はペチュニア植物8,9及び真菌アカパンカビ 9,10中の遺伝子を不活性化するために利用することができる技術として1990年代初期に同定されました。その後まもなく、1998年に、RNAiは、最初の注射または給紙方法9,11を介してアンチセンスまたは二本鎖RNA（dsRNAを）の導入によって動物モデルにおける遺伝子発現を減少させる手段として、 線虫（Caenorhabditis elegans）に記載されていました。その発見以来、RNAiは、研究者が急速に高度に選択的な転写後遺伝子サイレンシング機構を介して目的の遺伝子の機能的役割を調査するために、逆遺伝学を利用できるようにすることで、機能ゲノミクスの追求に革命をもたらしました。このようなキイロショウジョウバエなどのいくつかの生物では、干渉RNAコンストラクトを発現するトランスジェニック生物の使用は、遺伝子ノックダウン（KD）のために広く成功しています。 アンでの導入遺伝子の使用が。 RNAiのためのハマダラカが利用されてきた大規模なスクリーンのため有用であることが判明し得る、トランスジェニック蚊株の生成は、労力と時間がかかり、一般generatiに関心のある遺伝子の同定から行くために2〜3ヶ月を取ることもあります適切なトランスジェニック株12の上。現在、 アンにおける遺伝子KDの主要な方法。ハマダラカは、dsRNAの、大人の段階で、血リンパへの注射によって与えられた遺伝子12,13に特異的です。このプロセスは、典型的には、はるかに迅速なトランスジェニック法12よりであることを証明し、遺伝子KDの評価に関心のある遺伝子の同定から行くために1ヶ月程度かかります。幼虫期のRNAiのための方法は、 アンで最近確立されています。ナノ粒子供給14-17を経由して、または微細藻類ベースのdsRNAの経口送達によるハマダラカとネッタイシマカは、開発の初期段階で機能的ゲノム解析を実行するための機会を提供し、18を分子。直接給電注射、およびナノ粒子の送達方法において、dsRNAは、標的細胞によって自律的に取り、21-25ヌクレオチド長の「短い干渉RNA」（siRNAの）19,20に酵素ダイサーによって切断します。これらのsiRNAは、その後ですincorporated RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）、一方の鎖は、RNA結合RISC複合体が結合し、標的mRNAを切断し、それによって、そのレベルを低下させ、その翻訳19,20を阻害することができ、廃棄されるから。 基本的な蚊の生物学の多くの本質的な特徴は、ホストの嗜好（ 例えば 、嗅覚、味覚）、交配、繁殖や免疫力を含め、ベクトルの容量を調節します。これらの生物学的プロセスの重要性を考えると、遺伝的または薬理学的なレベルで彼らの変調が殺虫剤抵抗性の回避を含む、ベクトル制御のための新たな機会を提供し、ベクトル管理に対するより広範に統合されたアプローチのための新しいツールを提供する可能性があります。これらの本質的な生物学的機能の根底にある遺伝子の役割を評価するための機能ゲノミクスの使用は、新しい標的の同定を可能にし、我々は効果的に新しい、より効果的な制御strategを作成することができますどのように新たな洞察を提供しますIES。我々はアンの蛹の段階でRNAiを開始するための迅速な注入方法の開発と使用を記載しています。ハマダラカ 。我々は、RNAiトリガーの蛹注入が早くノックダウン遺伝子が出芽後成人で開始された場合に観察されるよりも出芽後、 すなわち 、初期段階の成人で、得られた表現型の観察を可能にすることを確認します。この方法は蛹の発育期間中に始まると大人の段階に伸びる遺伝子ノックダウンを可能にし、蛹の開発中に開始ノックダウンなど、その遺伝子は、変態血リンパ-アクセス以上ある早期成人血リンパアクセス可能な細胞型、ならびに細胞型を持続し、影響を与えることができます出現を以下の成人付属で見つかったような感覚ニューロンのような大人、中より。

<table><tbody><tr><td>MEGAscript RNAi kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II インジェクター</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II フットスイッチ</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>ガラスマイクロピペットプーラー</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>シグマ</td><td>F7258</td><td>無毒の食品染料で代用できます。</td></tr><tr><td>プラスチック製トランスファーピペットThermo</td><td>Scientific</td><td>1371150</td><td>&frac14;先端からインチカットして開口部を広げます。</td></tr><tr><td>何男"薄い」ろ紙&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>1001-090</td><td>直径9cmのグレード1ですが、インジェクションパッドのサイズによって変更することができます。</td></tr><tr><td>ウェスタンブロット」厚い"濾紙</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>一般的にウエスタンブロットに使用される濾紙です。</td></tr><tr><td>ペトリ皿(60mm×15mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ(サイズ0)</td><td>Michael's Art</td><td>10474940</td><td>ブラシのサイズとブランドは、在庫状況やユーザーの好みによって異なります。</td></tr><tr><td>解剖用光学顕微鏡</td><td>&nbsp;----&nbsp;</td><td>-----</td><td>これは、可用性とユーザーの好みによって異なる場合があります。</td></tr></tbody></table>

rnaiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

真核生物に自然に発生する現象であるRNA干渉(RNAi)は、機能ゲノム研究のための研究室で活用できる非常に価値のあるツールです。この逆遺伝学的手法によって個々の遺伝子を選択的にノックダウンする能力により、多くの研究者は、機能喪失型の表現型を評価することにより、多くの生物内の多数の遺伝子の生物学的役割を迅速に明らかにすることができました。主要なヒトマラリア媒介生物であるハマダラカでは、標的遺伝子の機能を低下させる主な方法として、成虫の蚊のヘモコエルに二本鎖(dsRNA)を注入する方法が主流となっています。この方法は成功していますが、成体における遺伝子ノックダウンでは、成虫の段階で発現し、役割を果たす可能性のある遺伝子や、成虫の蚊の限られた数の細胞で発現する遺伝子の機能評価が除外されます。蛹の初期段階でのセリンプロテアーゼ阻害剤2(SRPN2)dsRNAの注入方法について説明し、SRPN2ノックダウン成虫の蚊における標的タンパク質レベルの低下とメラニン性偽腫瘍の形成を観察することにより、SRPN2タンパク質のノックダウンを検証します。この明らかな表現型は、SRPN2機能の成体期ノックダウンについて以前に説明されており、蛹の発育中に開始されるSRPN2ノックダウンによってこの成体表現型を再現しました。色素標識dsRNA溶液と組み合わせて使用すると、この技術は、ヘモコエル内のdsRNAの注射品質と分布を簡単な光学顕微鏡で簡単に視覚化できます。

遺伝子KD利回り注入が早い蛹の段階で行われ、最適な結果、キューティクル日焼けレベルが低いとき（ 図1Aは 、左、および1B）のための蛹の注射。注射（図1A、中央、右）後に増加蛹の死亡の結果は、一般的に24時間後に、キューティクルの日焼けと硬化を増加します。蛹の開発速度は昆虫館条件および動物密度24,25に依存して変化し得ます。したがって、それは視覚的に色素沈着を評価するのが最善です。 注入プロセスの間に、キャピラリ針は後方方向（ 図2A）の前方に約30°の角度で背側クチクラ中に挿入されます。針が挿入されたdsRNA + 0.01％された後（w / v）のFGDが分配され、染料の分布は（体液を通じてFigu明らかです）2B再。 FGD（w / v）の0.01％を注射した蛹のための羽化の評価は、非注射対照の96.7パーセントの出現（ 図3A）に比べ、70％の出現の平均レートを明らかにしました。注目すべきは、蛹のケースから部分的な出現は、非生存蚊（ 図3B）の多数の観察されました。注射された動物は、出現時間の遅延なし（ 図4A）またはいずれかの性別（ 図4B）に偏った影響を示しません。大人の生存の追加の評価は、10発芽後は、発芽後の大人の生存（ 図4C）には明らかな影響を示さない日まで実施しました。 KD品質の検証はノックダウンとの陽性対照として21,22をノックダウンSRPN2に関連付けられた黒色の疑似腫瘍（濃く着色された組織のクラスタ）表現型によって評価しました<html>ネガティブコントロールとしてdsLacZ注入に関連した表現型の不在。登場大人蚊が後8日目の注射（日6-7出芽後）で採点しました。黒色擬似腫瘍（ 図5Aおよび5B）は dsSRPN2対の93.5パーセントのクチクラを通して観察されましたdsLacZ大人の蚊（ 図6A）の0％。暗くメラニン組織のクラスタは、着色されたパッチ（ 図5C）の解剖時に同定されました。擬似腫瘍が早くも3日目発芽後のような大人のキューティクルに表示されていたともdsSRPN2体液や腸組織のサブセットに存在した（データは示さず）。 5ポスト噴射（早期成人期）では、有意dsSRPN2にSRPN2レベルの低下はなく、dsLacZまたは非注射体液タンパク質単離物を、（ 図6B）が観察されました。 ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：蛹のdsRNAを注入するための発達ステージング大人の段階に最適な生存および進行中のdsRNA結果の早期蛹注入。表皮の色素沈着（A、左、及びB）の低いレベルは、蛹化後の最初の0~24時間以内に観察することができます。貧しい人々の生存に中等度で蛹クチクラ前回の噴射（A、中央、右）結果の日焼け。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> 図2：前方に約30°の角度で注入位置と背側クチクラへの色素で標識されたdsRNAの色素標識のdsRNA（A）キャピラリ針注射の分布は 、方向を後方します。 （B）染料は可視蛹体液に分布しています。 0.01％Fで標識された138 NLのdsRNAの注入量、GD（W / V）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> 図3：ポスト噴射羽化 （A）非注射対照（N = 60）の96.7パーセントと比較して0.01％のFGD（w / v）の成功した出現（N = 60）、を注射した蛹の70％。三つの生物学的複製を行いました。蛹ケースから（B）部分的出現は、非生存蚊多数観察されました。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> 図4：出現率、性別の評価と大人の生存率 （A）非注射蛹と比較して、同等の出現時間は、0.01％のFGD（24時間= 80％と48時間= 20％）と蛹の注射後に観察された（24。時間= 83％と48時間= 17％）。 （B </strオング&gt;）とほぼ等しいオスとメスの成体出現は0.01％FGD注入蛹（女性= 48％と男性= 52％）と非注射蛹（女性= 52％と男性= 48％）が観察されました。 （C）生存分析は0.01％FGDの注射は10日出芽後まで評価し、大人の生存に影響を与えないことが明らかになりました。結果は、0.01％FGD注射した（n = 60）および非注入（N = 60）蛹（男性と女性の同数）との3つの独立した実験からのデータを表します。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> 図5：擬似腫瘍陽性対照表現型は、成功したノックダウンを反映した疑似腫瘍は、（A）腹部と-injected dsSRPN2の（B）胸部キューティクルに観察されたが、8日目、注入後に-injected大人の蚊をdsLacZされませんでした。（C）高倍率（400X）キューティクルや色素性パッチの解剖のイメージング（a）が （b）は暗くメラニン細胞のクラスターを明らかにしています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> 図6：擬似腫瘍形成の定量とSRPN2タンパク質レベルを減少させた （A）蛹ステージ注射はdsSRPN2の成人の93.5パーセントに擬似腫瘍形成をもたらす（N = 21）dsLacZコントロールの0％と比較した（n = 19）。 。結果は、8日目、注入後に得られます。 （B）ウェスタンブロット（左）のショーはdsSRPN2にSRPN2レベルの低下はなく、dsLacZまたは非注射体液タンパク質分離（5日目注射後）。 3つの独立した実験に基づく結果。アンチSRPN2 21及び使用される抗SRPN3 26抗体希釈液1であった：1000〜1：2000、それぞれ。ヤギ抗RA5000：BBITのIgG-HRP（製品SC-2004、サンタクルスバイオテクノロジー、ダラスTX）を1で使用しました。すべてのタンパク質レベルは、 対応のないt検定により比較して統計的にSRPN3にバンド強度（ImageJのソフトウェア、NIH、ベセスダ、MD）、正規化によって（右）定量化、およびされました。 P &lt;0.05：*、P≥0.05：NS（有意ではありません）。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表します。

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles gambiaeでは限られています。蛹の発生中に直接注射によって遺伝子機能を低下させるRNAiプロトコルについて説明します。

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

本手法の総合的な目的は、Anopheles gambiaeにおいてRNA干渉トリガーを導入し、蛹期の発生段階から遺伝子ノックダウンを開始させることです。この手法は、ベクター生物学分野における重要な疑問への回答に寄与し、前成虫期または成虫初期の発生段階で役割を果たす遺伝子の解明に役立ちます。本技法の主な利点は、これまでRNA干渉の注入プロトコルが実施されていなかった発生間隔である蛹期に遺伝子ノックダウンを開始させることで、研究者が迅速な機能ゲノミクス研究を行う機会を提供できる点にあります。注入工程には高い精度が求められ、またこの発生段階の蛹は非常に繊細であるため、習得が困難な場合があります。したがって、本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。目的の遺伝子を選択した後、オフターゲット効果がないと予測される200から800 base pairの領域を特定し、標準的なPCR増幅を行って、T7プロモーター配列に挟まれた二本鎖RNA合成用テンプレートを取得します。次に、二本鎖RNAを合成し、市販のin vitroキットを用いて生成物を精製します。最終的なRNA濃度を3 µg/µLに調整します。次に、標準的な2%アガロースゲルを用いて、0.5 µLの二本鎖RNAをテンプレートDNAおよび標準マーカーと比較します。電気泳動後、二本鎖RNAバンドの品質と長さを確認してください。非特異的な産物は見られないはずです。二本鎖RNAはテンプレートDNAよりも緩やかに移動します。保存には、二本鎖RNAを分注し、-20°Cで保管してください。Fast Green FCF染料の調製から開始します。まず、RNase-Free waterを用いて、染料を0.1%（v/v）に希釈します。次に、調製した液を1 µLずつ1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。水分を蒸発させるため、試料を入れたチューブを65 °Cで約3時間加熱します。その後、染料固形物を使用する前に、チューブを30分以上冷却します。次に、ホウケイ酸ガラス管からガラス引き伸ばし法を用いて注入針を作製します。ニードルプラーを、チップ径が10〜30µmになるように設定します。成理化（NARISHIGE）製キャピラリープラーを使用する場合、第1ヒーターを100に、第2ヒーターを70に設定してください。その後、キャピラリーニードルをクランプし、引き伸ばし操作を行います。次に、注入ステーションを準備します。顕微鏡下で容易に操作できるプラットフォームを選択してください。プラットフォームの上に、まず厚手のろ紙をテープで固定します。次に、厚手のろ紙の上に薄いろ紙1枚をテープで固定します。続いて、ダイ染料の固形チューブに、注入する各二本鎖RNAを10 µLずつ加え、ダイを再懸濁させます。これらのチューブを氷上で保存してください。次に、注入に使用する蛹を回収します。直径60mmのペトリ皿に10mLの脱イオン水を満たし、プラスチック製転送ピペットを用いて、淡色の蛹を約50匹皿に移します。中程度から濃い褐色まで硬化が進んだ蛹は、角質層が損傷し生存率が低下するため、色素沈着が少ない蛹のみを使用してください。マイクロインジェクションの最初のステップは、針の先端を開孔することです。顕微鏡下で、精密ピンセットを用いて針の最先端部を切り離します。次に、30ゲージの針とシリンジを用いて、針にミネラルオイルを満たします。充填後、マイクロインジェクターを使用して余分なオイルを排出します。マイクロインジェクターを69 nanoliterの容量で吸引するように設定します。その後、準備した注入用RNAで針をフロントフィルします。二本鎖RNAの分注に問題がないか確認してください。チップの詰まりや針の固定不十分が主な問題の原因となります。インジェクターの準備が整ったら、蛹を1〜3匹選び、フィルターペーパーを敷いたステージに移します。筆を用いて、蛹の背面クチクラが操作しやすい向きに調整します。ろ紙の上で軽く押さえることで、蛹に付着した余分な水分を吸収させます。濡らした筆で蛹を固定しながら、腹部と胸部の間の背面クチクラに対し、前方から後方への動きで、約30度の角度で針を刺入します。次に、2本鎖RNAを1〜2パルス分、血リンパに注入します。注入が成功すれば、染料が全身に拡散するのが確認できるはずです。蛹に注入する際は、針で背側の角皮のみを貫通させることが極めて重要です。針の刺入が腹側の角皮を貫通した場合、蛹の外側に染料でラベル付けされた液体の溜まりが見られるか、あるいは染料がフィルターペーパーに移ります。このような場合は、その蛹を廃棄しなければなりません。染料が血リンパ全体に拡散しない場合は、チップが詰まっている可能性が高いと考えられます。チップをわずかに動かし、RNAと色素が放出されたかを確認します。色素の放出が認められない場合は、その蛹を廃棄してください。その後、針先を確認し、新しい蛹に対して再度注入を行います。蛹への注入が成功したら、濡らした筆を使用して針から慎重に外し、発生を完了させるための水が入ったシャーレに移動させます。注入した蛹が入ったシャーレを、通常の飼育条件下で蚊のケージまたは容器内に置きます。成虫の餌として、10% w/vのグルコース溶液を染み込ませた脱脂綿を用意します。成虫が羽化した後、コントロール群と比較します。例えば、SRPN2のダブルストランド個体については、偽腫瘍の形成がないか毎日評価する必要があります。そのためには、成虫を−20°Cで2〜3分間冷却し、2°Cのコールドプレートに移して観察します。成虫の観察後、それらを昆虫飼育エリアに戻します。この手法を習得した後、注入した蛹の羽化率は約70%となりました。注入した蛹の一部では、蛹殻からの不完全な羽化が起こり、生存不能な蚊となりました。注入した蚊と注入していない蚊の間で羽化率に遅延は見られず、注入による影響は性別によって差はありませんでした。羽化から10日後、注入された蚊の生存率に、非注入のコントロール群と比較して顕著な変化は見られなかった。二本鎖RNA注入のポジティブコントロールとしてセリンプロテアーゼ阻害剤であるSRPN2を、ネガティブコントロールとして二本鎖LacZを使用した。羽化から3日後までに、二本鎖SRPN2を注入した成虫において、光学顕微鏡で確認できる偽腫瘍が認められた。8日後、擬腫瘍が非常に顕著に認められました。成虫期の蚊において、二本鎖SRPN2を注入した個体の大部分では、角皮を通して黒化 pseudotumors が観察されましたが、コントロール群では擬腫瘍は観察されませんでした。注入から5日後、二本鎖SRPN2を注入した蚊におけるSRPN2タンパク質レベルは、二本鎖LacZを注入したコントロール群および非注入コントロール群と比較して、有意に低下していました。このビデオを視聴することで、新しく開発された注入プロトコルを用いて、Anopheles gambiaeの蛹にRNA干渉トリガーを導入する方法を十分に理解できるはずです。一般的に、この手法に不慣れな人は蛹の予測不可能な動きに苦労します。しかし、蛹の正しい位置決めと固定を練習することで、注入の成功率と注入の質を大幅に向上させることができます。この手技に習熟すれば、蛹1個あたりの注入時間は約30秒となります。本手法の開発により、ベクター生物学分野の研究者が、マラリア媒介蚊であるAnopheles gambiaeの前成虫期および成虫初期の発生段階における遺伝子機能を探索・評価するための道が開かれました。本手順の後、ウェスタンブロット解析や定量PCRなどの手法を用いることで、標的遺伝子のノックダウン程度を、それぞれタンパク質レベルまたは転写産物レベルで決定することができます。最終的に、この手法は蚊による寄生虫伝播に不可欠な遺伝子の特定に寄与し、新たな標的の同定および、より効果的な媒介生物管理戦略を構築するための新たな知見を得るのに役立つと考えられます。

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

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このビデオでは、胚マイクロインジェクション技術を通じて、ハマダラカの蚊の胚への遺伝子ドライブ構築物の送達を実演します。この手順により、相同組換えを通じて送達されたDNAコンストラクトを生殖細胞に統合し、形質転換された蚊の集団を生成することができます。...

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地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis...

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このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。...

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

ここでは、 ナソニアビトリペンシス での効率的なプパルおよび成人注射を胚微小注射の代替手段として説明し、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9ゲノム編集によるRNAサイレンシングまたは遺伝子ノックアウトのいずれかを使用して目的の遺伝子の機能解析を可能にする。...

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

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アノフェレスガンビア胚の微小注入法

細菌によって産生されるdsRNAの経口投与は、 カエノラブディティス・エレガンス...

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

学ぶRNAiトリガ配信法をAnopheles gambiaeの蛹期に適用し、ベクター生物学における遺伝子機能を解明する。マイクロインジェクション技術により、発生初期段階の遺伝子ノックダウンを実現し、マラリア媒介蚊の制御戦略に新たな知見を提供する。

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