Name: ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ ex vivoライブイメージング法でマウス肺転移における腫瘍細胞と間質細胞の動的相互作用を可視化する方法です。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて少なくとも4時間の生細胞観察が可能です。

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技術的な支援をしてくださったNguyen H. Nguyenさんと、Zeiss Cell Observer回転ディスク共焦点顕微鏡のサポートを提供してくださったAudrey O'Neillさんに感謝します。この研究は、国防総省のポスドクフェローシップ(W81XWH-11-01-0139)とワイツマン科学研究所-科学における女性の地位向上のための全米ポスドク賞プログラム(V.P.)の支援を受けました。

記載されているすべての手順は、地域の施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）による事前の承認を含め、脊椎動物の使用に関するガイドラインおよび規制に従って実施する必要があります。
1. Ex vivo生体イメージングのための肺転移の作製（トランスジェニックまたは尾静脈注射）
注：肺転移は、遺伝子組換えマウスモデルを利用するか、またはがん細胞を静脈内（i.v.）投与することで作製できます。
<ol>
	<li>遺伝子組換え腫瘍マウスモデルとトランスジェニック・レポーターマウスを交配させ、イメージング用の肺転移を誘発する。 例：、乳癌マウスモデルであるマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復配列-ポリオーマ中間T抗原（MMTV-PyMT)11 に ACTB-ECFP マウスモデル12. 
	注：ACTB-ECFPモデルは、β-アクチンプロモーターの下で強化シアニン蛍光タンパク質（ECFP）を発現するため、すべての細胞がCFPチャネルで青色に蛍光を発します。しかし、がん細胞が圧倒的に顕著であり、顕微鏡下ではECFP陽性細胞の集塊として観察されます。MMTV-PyMTマウスモデルでは進行性の疾患が発症し、乳腺腫瘍の増大に伴い、がん細胞が周辺組織、特に肺へと播種されます。FVB/n背景のMMTV-PyMTマウスでは、生後10〜11週頃に微小転移が観察されます。一般的に、これらは生後14週頃に巨大転移へと進行します。13. 
	または</li>
	<li>原細胞または同系細胞株を用いて、実験的転移を誘導する。使用して in vitro 操作された原発腫瘍細胞または細胞株（例（導入、形質導入）に続き、静脈内注射を行う14.
	<ol>
		<li>簡潔に述べると、本プロトコルでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する(+)を注入し、 MMTV-PyMT 蛍光レポーターマウスへの細胞株の導入（ACTB-ECFP) または野生型マウス。その後、VO-PyMT細胞と呼ばれるこれらの細胞を可視化する。15 緑色のGFPチャネルを使用して。 
		注：元のVO-PyMT細胞株は、テネシー州ナッシュビルのVanderbilt Orthopaedicsで樹立されました。VOはVanderbilt Orthopaedicsの略称です。</li>
		<li>10の投与後、6 細胞（内 200 µl）、がん細胞の血管外遊出を注射直後から数時間後まで観察し、注射後1〜3週間に微小転移を観察し、注射後3週間に巨視的転移を検出する15. 
		注：注入から転移性の増殖までの期間を延長させるには、注入する細胞数を少なくします。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 転移微小環境における目的成分の標識（トランスジェニックおよび/または注入可能物質）
注：ラベル付けは、トランスジェニックマウスおよび／またはさまざまな注入剤によって行うことができます。異なる細胞種類のラベル付けには、必ず異なる蛍光色を使用してください。
<ol>
	<li>トランスジェニックマウスを用いて、転移性微小環境の構成要素を標識する。前述のマウス腫瘍モデル（例：MMTV-PyMT x ACTB-ECFP）を、目的のストローマ細胞がECFP以外の蛍光タンパク質で標識されているトランスジェニックマウスモデル（例：c-fms-EGFP）4,16と交配させる。 
	注：これにより、CFPチャネルでのがん細胞の可視化に加えて、GFPチャネルでの骨髄系細胞の可視化が可能になる4。 
	および／または</li>
	<li>トランスジェニック蛍光レポーターマウスまたは（非蛍光）野生型マウスへの注入可能な試薬を用いて、転移性微小環境のさまざまな構成要素を標識する。 
	注：転移性微小環境のさまざまな構成要素を標識するために、いくつかの化合物を注入することができる。例えば、ここでは好中球および一部の単球を標識するためにAF647結合Gr-1抗体を使用し13、肺毛細血管を標識するために異なる分子量のデキストランを使用する。これらの注入薬の調製については、ステップ4を参照すること。</li>
</ol>
3. 解剖前の材料準備
<ol>
	<li>2% アガロース
	<ol>
		<li>0.2 gのアガロースを量り取り、10 mlの1 x PBSに加える。溶液を加熱してアガロースを溶解させる。アガロースはRTで凝固するため、膨張に使用するまで37 °Cのウォーターバスで保持する。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CO2および温度コントローラー
	<ol>
		<li>加湿チャンバー内のddH2Oを確認し、必要に応じて補充する。構成プレートを温度ステージプレートホルダー（クライメートチャンバー）に挿入する。CO2コントローラーの電源を入れ、CO2を5%に設定する。空気流量が0.4 Nl/minに設定されていることを確認する。</li>
		<li>空気バルブとCO2バルブを開く。温度コントローラーの電源を入れる。クライメートチャンバーと蓋の温度が37 °Cに設定されていることを確認する。</li>
		<li>CO2メーターの空気圧を放出する。CO2が上昇しているか確認し、平衡に達するまで最大30分かかる場合がある。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回転円盤共焦点顕微鏡 
	注：顕微鏡のセットアップの詳細は既報である4,17。
	<ol>
		<li>レーザー（488 nm励起用のアルゴンレーザー、および固体405 nm、561 nm、640 nmレーザー）の電源を入れる。顕微鏡、カメラ、回転円盤制御ユニット、AOTF、レーザー制御ユニット、およびカメラコントローラーの電源を入れる。</li>
		<li>顕微鏡のシャッターを開き、顕微鏡を動作させるコンピューターの電源を入れてソフトウェアを起動する。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器具および解剖プラットフォームの準備
	<ol>
		<li>ホットビード滅菌器の電源を入れ、250 °Cに到達させる。手術用鋏とピンセットをそれぞれ2ペア、水と石鹸で洗浄する。器具を少なくとも30秒間滅菌する。器具を冷却させる。ポリスチレン製の蓋を解剖プラットフォームとして使用し、その上にラボソーカーを敷く。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 注射液の調製
注：半減期および期待される反応に応じて、蛍光標識抗体および/または蛍光分子を、動物の殺処分直前、あるいは数時間から数日前に注入してください。
<ol>
	<li>Gr1陽性の好中球および単球をイメージングするために、クリーンベンチ内で、ストックのAF647標識Gr-1抗体（1 mg/ml）7 µlを滅菌PBS 100 µlに混合し、シリンジに準備する。シリンジに27 G ½の針を装着する。</li>
	<li>肺毛細血管をイメージングするために、70 kDローダミン標識デキストラン（4 mg/ml）または10 kD AF647標識デキストラン（4 mg/ml）を100 µlずつ入れた2本目のシリンジおよび3本目のシリンジを準備する。シリンジに27 G ½の針を装着する。</li>
	<li>肺の摘出の5時間前に、AF647標識抗体溶液を静脈内投与（i.v.）する。</li>
	<li>肺の摘出の直前に、一方または両方のデキストラン溶液を静脈内投与（i.v.）する。</li>
</ol>
5. Ex vivoライブイメージングのための肺の調製
注：肺内の免疫細胞に不必要な刺激を与えないよう、可能な限り無菌的に、かつ慎重に作業を行ってください。
<ol>
	<li>IACUCによって承認された動物実験プロトコルで許可されている麻酔薬の致死量を、マウスの腹腔内（i.p.）に投与する。 例：2.5% Avertinを1 ml投与する。マウスの呼吸が停止し、有害刺激（後肢のつまみ）に対して完全に反応しなくなるまで待機する。 
	注意：頚椎脱臼および二酸化炭素による安楽死は、肺細胞の生存率に悪影響を及ぼす可能性があるため、避けてください。</li>
	<li>マウスを解剖台に固定し、70%エタノールで滅菌する。</li>
	<li>外科用剪刀を用い、まず皮膚に上腹部横切開を加え、続いて腹膜に同様の切開を加える。解剖ボードを垂直に保持した状態で下行大動脈を切断し、血液が胸腔ではなく腹腔内に溜まるようにする。</li>
	<li>真空を解除するため、横隔膜に小さな切り口を入れます。第10肋骨および第12肋骨に沿って切開し、横隔膜を摘出することで、肺を視覚的に確認できるようにします。</li>
	<li>外科用剪刀を用いて、肋骨の上に沿って気管まで皮膚を切開しますが、肋骨はそのまま残してください。皮膚を肋骨から剥離します。気管自体を損傷しないよう注意しながら、周囲の結合組織を除去して気管を露出させます（図1A).</li>
	<li>露出した気管の、喉頭にできるだけ近い位置に、軟骨輪と平行に直径約1 mmの小さな開口部を作ります（図1B）。気管を完全に切断しないよう注意してください。</li>
	<li>20 G針を用い、反作用をかけないように注意しながら、気管内に4～5 mmゆっくりと刺入します（図1D）。針の先端が気管を通して見えるようにします（図1C）。ピンセットを使用して、気管内の針を固定します。あるいは、縫合糸を気管に結んで針を固定しても構いません。 
	注意：挿入しすぎると、気管分岐部を損傷させたり、片肺のみが膨張したりする可能性があります。</li>
	<li>シリンジに～を満たします。 400 µl の 37 °C 2%低融点アガロース（恒温槽から直接取り出したもの）。解剖板が直立していることを確認し、温かいアガロースを針を通して肺にゆっくりと注入します。約400 µl 肺を膨張させるため。 
	注意：肋骨の中で肺が膨らむ様子を確認してください。肺が破裂するため、膨らませすぎないように注意してください。</li>
	<li>肺を膨張させ、胸郭の約3分の2を満たしたら、シリンジを取り外します。このとき、アガロースの漏出を防ぐため、針は気管内に保持したままにします。</li>
	<li>約50 mlの～を注ぎます。 20 °C 膨張させた肺の上にPBSを注ぎ、肺内部のアガロースを凝固・固化させます。針をゆっくりと抜き、未凝固のアガロースが漏れ出さないよう、鉗子で気管を閉じます。</li>
	<li>胸骨切開を行い、肺を露出させた後、肺を摘出します。肺を摘出する際は、気管を保持しながら気管を完全に切断します。気管をそっと上に引き上げ、結締組織と食道を切り離しながら、肺がマウスから完全に分離するまで胸腔から肺を引き出します（図1E).</li>
	<li>肺を温めたRPMI-1640に浸して過剰な血液を洗い流し、肺門部で各葉の主気管支をハサミとピンセットで切断して、各葉を慎重に分離します（図1F).</li>
	<li>撮像面積を最大化するため、葉の平坦な面を下にして24ウェルイメージングプレートのウェルに配置します（図1G）。添加してください。 100 µl の 37 °C 葉の上にRPMI-1640を添加します。葉が浮き上がるのを防ぐため、その上に15mmの円形カバーガラスを数枚置きます。</li>
	<li>RPMI-1640培地の蒸発を防ぐため、周囲のウェルに加温したPBSを注入します。24ウェルプレートを平衡化したクライメートチャンバーに入れ、肺葉を以下の状態で維持します。 37 °C 空気および5% $\text{CO}_2$とともに2クライメートチャンバーを共焦点顕微鏡のステージに設置してください。 
	注意：その他の混合ガス（例：5% O₂2, 5% CO22 Nにおいて2 （低酸素状態における細胞挙動を調べることも検討し得る。） </li>
</ol>
<img alt="気管手術アクセス図：剥離ステップ、組織抽出方法、生物学的分析。" src="/files/ftp_upload/53741/53741fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 1"> 
図 1. 生体イメージング用肺準備プロトコル。 (A) マウスの処置後、気管を露出させる。 (B) 露出した気管の軟骨環に平行に小さな切開を入れる。 (C) 20 G 針を気管に 4-5 mm 挿入する。 (D) 2% 低融点アガロース 400 µl を肺内に注入する。 (E) 膨張した肺をマウスから切り離す。 (F) 膨張後、肺葉を分離させる。 (G) 肺葉を 24ウェルイメージングプレートのウェルに配置する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53741/53741fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
6. 画像の取得と解析
注意：画像は、さまざまなソフトウェアプログラムでサポートされている多様な回転ディスク共焦点顕微鏡を用いて取得できます。本プロトコルでは、画像の取得に、カスタムメイドの回転ディスク共焦点顕微鏡とµManager、または市販の回転ディスク共焦点顕微鏡とZenのいずれかを使用し、動画の編集および解析にはImarisを使用します。
<ol>
	<li>µManagerを使用して画像を撮影します。µManagerソフトウェアを用いた画像撮影の詳細なステップ・バイ・ステップ・プロトコルは、既報されています18。 
	または</li>
	<li>Zenなどの画像解析ソフトウェアを使用して画像を撮影します（図 S1を参照）。
	<ol>
		<li>「Locate」タブをクリックし、「Light Path」ツールで対物レンズ（10xまたは20x）を選択します（図 S1A、赤枠）。続いて、「Eyes – DAPI」をクリックし、接眼レンズを通してCFPチャンネルを確認します（図 S1A、青枠）。顕微鏡を用いて手動でサンプルを定位させます。組織が視野の中心に位置したら、「All Off」をクリックします。</li>
		<li>「Acquisition」タブをクリックし、画像撮影のすべてのパラメータを設定します。</li>
		<li>「Channels」ツールで「+」ボタンをクリックします（図 S1B、赤枠）。ポップアップメニューが表示されるので、「Dye Database」からサンプルに含まれる染料を検索します（図 S1B）。染料を選択し、「Add」をクリックします。 
		注意：プログラムによってすべてのフィルターが最適に設定されます。染料を削除する場合は、当該染料を選択してからゴミ箱ボタンをクリックします（図 S1B、黄枠）。</li>
		<li>「Acquisition Mode」メニューで、「Binning」を5x5に設定します。チャンネルメニューのECFPをダブルクリックして選択します。画像撮影パラメータの設定中にサンプルが退色しないよう、レーザー出力を20%まで下げます。</li>
		<li>「Experiment Manager」セクションの「Tiles」ボックスにチェックを入れると、「Multidimensional Acquisition」ツールグループにタイルツールが表示されます（図 S1C）。「Advanced Setup」ボタンをクリックして、カメラからのライブ画像を表示します。「Positions」セクションの「Add」ボタンをクリックし、実験に4〜6箇所のポジションを追加します。ポジションを削除するには、そのポジションを選択してゴミ箱ボタンをクリックします。</li>
		<li>「Acquisition Parameter」ツールグループで「Focus Strategy」ツールを開き、ドロップダウンリストから「Absolute Fixed Z-position」を選択します。</li>
		<li>「Experiment Manager」セクションのZ-Stackボックスにチェックを入れると、「Multidimensional Acquisition」ツールグループにZ-Stackツールが表示されます（図 S1D）。「Positions」セクションのポジションのいずれかをダブルクリックし、「Live」を押します。撮像領域の開始位置と終了位置を手動で設定します。間隔は4 µmに設定します。 
		注意：選択した範囲と間隔に基づき、プログラムがスライス数を決定します。十分な可視化と迅速な画像撮影を両立させるには、5-7スライスが最適です。</li>
		<li>「Experiment Manager」セクションの「Time Series」ボックスにチェックを入れます。「Multidimensional Acquisition」ツールグループに表示された「Time Series」ツールで、任意の「Duration（期間）」と「Interval（間隔）」を設定します（図 S1E）。</li>
		<li>「Acquisition Mode」メニューで、「Binning」を2x2に設定します。チャンネルメニューの蛍光色素をダブルクリックして選択し、レーザー出力を100%に上げます。「Live」を押し、「Exposure Time（露光時間）」を調整します。これをすべての蛍光色素について繰り返します。</li>
		<li>「Enable Auto Save」ボックスにチェックを入れます。フォルダを選択し、ファイル名を入力します。撮影されたすべての画像はこのフォルダに自動的に保存されます。</li>
		<li>「Experiment Manager」セクションの「Start Experiment」をクリックして、画像撮影を開始します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>画像撮影後、Imarisソフトウェアで生データをコンパイルします。画像を.imsファイルに変換し、調整を行います。Imarisを用いたファイルの変換、調整、および動画保存の詳細なステップ・バイ・ステップ・プロトコルは、既報されています18。</li>
	<li>動画を保存する際、「Frame Rate（フレームレート）」を5 frames per second (fps)に設定します。</li>
</ol>

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著者には開示すべき利益相反はありません。すべての動物実験は、IACUC 承認プロトコルである UCSF に従って実施されました。

この原稿では、転移のマウスモデルにおける肺転移の ex vivo ライブイメージングの詳細な方法について説明しています。このイメージングプロトコルは、肺微小環境内の動的および空間的な腫瘍細胞と間質の相互作用を直接視覚化します。これは比較的簡単で迅速な方法であり、少なくとも 4 時間の肺転移の信頼性の高いイメージングを可能にします。これらの実験から得られたムービーは、細胞運動性や細胞相互作用などの動的プロセスを追跡するために使用できます。
肺転移の発生のための2つの方法、すなわち遺伝子操作マウスモデルと操作された細胞株の使用が説明された。 MMTV-PyMT マウスモデルは、乳がんの進行と自然肺転移を要約しています。転移の広がりを再現する他の技術、 例えば、乳腺における細胞の同所性移植も利用可能である20。静脈内注射された VO-PyMT 細胞株を使用して、乳がん転移の播種と増殖を模倣します。VO-PyMT細胞増殖の時間許容は、肺転移の段階に対する実験的好みに依存します。注入細胞数にもよりますが、VO-PyM...

癌の最も致命的な側面は転移であり、これは癌関連の罹患率と死亡率の90%以上を占めています1。転移は多段階のプロセスであり、その複雑さのために、転移の播種と成長を支配する正確な細胞および分子メカニズムはまだとらえどころのないものです。転移するには、原発腫瘍の腫瘍細胞が隣接する細胞や基底膜から剥離し、細胞外マトリックスを通過し、血管内投与を行い、血管やリンパ管を介して移動し、二次部位で血管外漏出を行い、最後に生存して二次腫瘍を確立する必要があります。腫瘍細胞の特性に加えて、隣接する間質とがん細胞の正常な対応物を含む微小環境からの寄与は、転移性病変の播種と確立にとって重要です2。
転移性播種と成長を研究する伝統的な方法は、組織を切除し、組織学のために切片化する静的な状態を調べます。これらのデータは、この非常に動的なプロセスのスナップショットを生成するだけです。これらの研究からいくつかの有用な情報を得ることができるが、転移形成中に腫瘍細胞と間質細胞が相互作用する複雑な過程は、これらの方法では十分に評価できない。さらに、遠隔部位にコロニーを確立するために重要な腫瘍や間質細胞の移動パターンについての洞察を得ることはできません。転移過程を効果的に研究するためには、がん細胞とその微小環境との間の様々な相互作用を連続的かつリアルタイムに可視化することが不可欠です。
肺は、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、黒色腫、肉腫などの固形腫瘍からの転移の一般的な部位です。生体内イメージングは、以前にさまざまな原発腫瘍および転移モデルにおける細胞間相互作用の研究に使用されていました4,5。マウスにおける肺イメージングの方法には、生体内イメージング、肺切片イメージング、ex vivo肺転移アッセイなどが発表されています6–9。マウス肺の生体内イメージングは、胸部吸引窓を利用して肺を安定させます6。この方法は、肺の微小循環と肺胞腔のタイムラプスイメージングに使用されます。肺の解剖学的位置は、生体内イメージングに課題をもたらします。肺にアクセスするためには、胸腔を開かなければならず、陰圧が失われ、肺が虚脱します。この方法では、肺のごく一部しか視覚化できず、技術的に要求が厳しいです。血流に依存しないプロセスを調べる研究では不必要な合併症です。さらに、この方法では、呼吸によって引き起こされる動きをゲートアウトする必要もあります。これは、呼吸と呼吸の間に画像を収集することによって、または画像取得後の分析10中に行われる。代替のex vivo肺切片イメージングは、安定性と深さを提供し、免疫染色のための肺実質の準備も行います7。しかし、切片化プロセスが長いため、動物の犠牲からイメージングセッションの開始までの間に大幅な遅延が生じます。さらに、マウスの肺を切片化するプロセスは、かなりの量の細胞死8を引き起こし、したがって、イメージングサンプルの質と量を妨げ、おそらく腫瘍と間質の相互作用を不必要に変化させる。生体内イメージングと肺切片イメージングの方法を技術的に橋渡しするために、2つの技術の利点を活用しながら、ex vivo肺イメージングのための比較的迅速で簡単な方法が開発されました。この方法は、切開されていない全肺葉のイメージングによって達成されました。この手法を用いると、がん細胞の運動性や、がん細胞と間質細胞の微小環境における相互作用を数時間にわたってリアルタイムに可視化することができます。

<table><tbody><tr><td>MMTV-PyMT/FVB マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td>雌マウス</td></tr><tr><td>ACTB-ECFP/FVB マウス</td><td>UCSF Werb lab</td><td></td><td>雌マウス</td></tr><tr><td>c-fms-EGFP/FVB マウス</td><td>UCSF Werb 研究室</td><td></td><td>雌マウス</td></tr><tr><td>FVB マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>1800</td><td>雌マウス</td></tr><tr><td>GFP+ VO-PyMT 細胞</td><td>UCSF Werb 研究室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70,000 kDaデキストラン、ロダミン標識</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td> 1 <td>x PBSで4mg/mLに希釈し、-20°Cで保存します。1匹あたり0.4mgを使用してください。</td></tr><tr><td>10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td> 1 <td>x PBSで4mg/mLに希釈し、-20°Cで保存してください。1匹あたり0.4mgを使用してください。</td></tr><tr><td>抗マウスGr-1抗体 Alexa Fluor 647</td><td>UCSF モノクローナル抗体コア</td><td></td><td>ストック 1mg/ml. 1匹あたり7μgを使用してください。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>IACUCによって承認された麻酔麻酔、麻酔および/または安楽死に使用</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>UCSF 細胞培養施設</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS、USP 滅菌&nbsp;</td><td>Amresco INC</td><td>K813-500ML</td><td>超純高等級 静脈内注射</td></tr><tr><td>用発泡スチロールプラットフォーム</td><td></td><td></td><td>用 解剖板として使用されます</td></tr><tr><td>細かいはさみ シャープ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ロボズ外科用ストア</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-45</td>使用<td>の30分前にオンにします</td></tr><tr><td>空気</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>針なし1mLシリンジ&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G×1/2針&nbsp;&nbsp;</td><td>点滴注射用</td><td>BD</td><td>305109</td></tr><tr><td>20G×1本針、ショートベベル&nbsp;&nbsp;</td><td>BD</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>50111</td><td>10 mlの溶液を作るには、0.2 gのアガロースを秤量し、1 x PBSを10 mlに加え、加熱して溶解します。アガロースは室温で固まるため、37°Cに維持してください。Cウォーターバスは、インフレーションに使用されるまで。</td></tr><tr><td>RPMI-1640 フェノールレッドなし媒体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11835-030</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルイメージングプレート&nbsp;</td><td>E&K scientific</td><td>EK-42892</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースライド、15 mm&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-031-144</td><td></td></tr><tr><td>デジタル CO2 および温度コントローラー</td><td>Okolab</td><td>DGTCO2BX</td><td>http://www.oko-lab.com</td></tr><tr><td>気候チャンバー</td><td>Okolab</td><td></td><td>http://www.oko-lab.com</td></tr><tr><td>Cell Observer スピニングディスク共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Inc Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal scan-head</td><td>横河電機株式会社</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mManager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>オープンソースソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

転移は、癌関連の罹患率および死亡率の主要な原因です。転移は多段階プロセスであり、その複雑さのために、転移性播種と成長を支配する正確な細胞および分子プロセスはまだとらえどころのないです。ライブイメージングは​​、細胞とその微小環境の動的なと空間の相互作用の可視化を可能にします。固形腫瘍は、一般的に肺に転移します。しかし、肺の解剖学的位置は、生体イメージングへの挑戦を提起します。このプロトコルは、肺転移内の腫瘍細胞とその周囲の間質間の動的相互作用の ex vivoライブイメージングのための比較的単純かつ迅速な方法を提供します。この方法を使用して、癌細胞の運動性ならびにそれらの微小環境中の癌細胞と間質細胞の間の相互作用は、いくつかの時間をリアルタイムで可視化することができます。トランスジェニック蛍光レポーターマウスを用いて、蛍光細胞株は、注射可能な蛍光標識分子および/または抗体は、肺の微小環境の複数のコンポーネントは、血管及び免疫細胞のように、可視化することができます。異なる細胞型の画像に、迅速な、四色の画像取得との長期の連続撮影を可能にする回転ディスク共焦点顕微鏡が用いられています。複数の位置と焦点面上で収集した画像からコンパイルタイムラプスムービーは、少なくとも4時間のライブ転移性および免疫細胞間の相互作用を示しています。この技術はさらに、化学療法または標的療法を試験するために使用することができます。また、この方法は、肺の微小環境に影響を及ぼし得る他の肺関連病理の研究のために適合させることができます。

回転円盤共焦点顕微鏡、さまざまなマウスモデルシステムおよび注入剤を用いることで、転移性の微小環境を可視化し、経時的に追跡することが可能です。MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP三重トランスジェニックマウスモデルを用いることで、異なる細胞成分を蛍光標識できます（Figure 2A、Movie 1）。すべての細胞がβ-アクチンプロモーターの下でECFPを発現しているため、CFPチャネルで肺実質の典型的な構造を可視化できます。大規模または多細胞の肺転移巣は、組織化された肺構造内の細胞塊として現れるため、容易に識別できます。骨髄系細胞は、CSFR-1のトランスジーンであるc-fms-EGFPの発現を通じて、GFPチャネルで可視化されます12。骨髄系細胞は、撮像視野全体を移動するため、非常にダイナミックに変動します。c-fms-EGFP陽性細胞は、肺転移巣に密接に接触している細胞に比べて、肺実質においてより豊富に存在し、遊走性が高いことがわかります。骨髄系細胞のダイナミクスと肺...

マウスの蛍光レポーターを利用して、肺転移内の腫瘍細胞間質相互作用のex vivoライブイメージングのための比較的簡単な方法について説明します。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いたこの技術は、少なくとも4時間にわたる生細胞の可視化を可能にし、他の炎症性肺疾患の研究にも適応できる可能性があります。

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

この手順の全体的な目標は、肺転移内の動的な腫瘍細胞間質の相互作用を視覚化することです。この方法は、転移がどのように確立されるのか、微小環境内のどの細胞タイプがこのプロセスに関与しているのかなど、がん転移分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術が提供する主な利点は、これがex vivo肺イメージングの迅速で簡単な方法であり、少なくとも4時間生きた細胞を視覚化できることです。この技術は、肺転移の治療のためのさまざまな標的治療薬の作用機序の理解をさらに深めた可能性があります。私たちがこの方法を思いついたのは、肺切片イメージングによる転移を調べていて、この手順の結果として広範囲の細胞死に苦しんでいたときにした。ex vivoライブイメージングのために肺を準備するには、まず、ソーカーで覆われた発泡スチロールの蓋にマウスを固定し、70%エタノールで動物を滅菌します。次に、外科用ハサミを使用して、皮膚から横方向の心窩部切開を行い、続いて腹膜から同様の切開を行います。次に、解剖ボードを垂直位置に移動し、下行する大動脈を切断して、血液が胸腔ではなく腹部に溜まるようにします。ダイヤフラムの小さな開口部を切り取って、真空を解除します。次に、胸郭に沿って切断して横隔膜を切除し、肺を視覚化します。手術用ハサミを使用して、肋骨を無傷のままに、胸郭の上の気管まで皮膚を切ります。次に、胸郭から皮膚を分離し、気管自体を傷つけないように注意しながら、周囲の結合組織を切除して気管を露出させます。露出した気管の直径約1ミリメートルの小さな開口部を切り取り、気管を完全に切断せずに、軟骨リングに平行にできるだけ喉頭の近くで切り取ります。次に、20ゲージの針を4〜5ミリメートルの空気圧に反力なしでそっと挿入します。針の端は気管を通して見えるはずです。シリンジに400マイクロリットルの37°Cの2%低融点アガロースを入れ、次に鉗子で針を安定させます。解剖ボードを垂直に保ちながら、温かいアガロースの全量を針を通して肺にゆっくりと注入します。肺が膨らんだら、針を気管内に保持したままシリンジを取り外し、20°CのPBSを肺に約50ミリリットル注ぎ、アガロースをセットします。アガロースが固まったら、針を取り外し、鉗子を使用して気管を閉じ、固化していないアガロースの漏れを防ぎます。次に、胸骨切開術で胸をさらに開き、鉗子で気管をつかみます。次に、外科用ハサミを使用して、気管を完全に切り抜きます。肺を摘出するには、気管をそっと引き上げ、結合組織と食道を切り取り、肺を胸腔から完全に引き出します。組織を摂氏37度のRPMI1640に浸して、余分な血液を洗い流します。はさみと鉗子を使用して、葉を切ります

ex-vivo-live-imaging-of-lung-metastasis-and-their-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能に...

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

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乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

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ラットの肺転移における微小循環血流速度の自動測定

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定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

このプロトコルは、真空安定化イメージングウィンドウを使用して、無傷の肺の長期高解像度シングルセルイメージングをリアルタイムで行うための多光子顕微鏡の使用を説明しています。...

真空安定化撮像窓と肺における長期高分解能生体顕微鏡

このプロトコルでは、イメージの居住者腫瘍浸潤 CD8 T 細胞ひと肺腫瘍スライス内結合蛍光抗体で標識する方法について説明します。この手法は、共焦点顕微鏡を用いた CD8 T...

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS)...

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。...

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

ここでは、肺の高解像度の生体内イメージングを可能にするマウス胸郭用の永久に留置された光学窓の外科的移植のためのプロトコルを提示する。ウィンドウの永続性は、肺の動的細胞プロセス、特に播種された腫瘍細胞の転移進行など、ゆっくりと進化している細胞プロセスの研究に適しています。...

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。...

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

学ぶ ex vivoライブイメージング法でマウス肺転移における腫瘍細胞と間質細胞の動的相互作用を可視化する方法です。スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて少なくとも4時間の生細胞観察が可能です。

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

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