軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

この手順の全体的な目標は、ニューロン、エキソサイトーシス、小胞、フシオン、および軸索の分岐の時間的および空間的発生を定量化可能な観察を行うことです。この方法は、ニューロンの発達中に小胞融合がいつ、どこで拡張する原形質膜に膜材料を挿入するかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ライブセルイメージングを組み合わせて単一細胞で高い空間分解能と時間分解能を取得し、生化学的アプローチで集団ベースの情報を取得できることです。

プロトコルテキストに従って、Netrin-1またはコントロールで皮質ニューロンを培養およびシミュレートした後。条件の最初のウェルからPBSを吸引し、250マイクロリットルの均質化バッファーと交換します。氷上で5分間インキュベートし、セルリフターを使用して氷上で細胞を均質化します。

同じ条件の次のウェルからPBSを吸引し、最近均質化した混合物をウェルに追加すると、タンパク質濃度が増加します。次に、均質化された溶液を氷上の予冷された1.6ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、20%Triton X-100を添加して最終濃度を1%にし、1,000マイクロリットルのピペットで、泡を最小限に抑えながら混合物を10回粉砕します。チューブを氷上で2分間インキュベートし、タンパク質を可溶化します。

次に、6, 010 RCFで摂氏4度で10分間遠心分離し、非可溶化材料をペレット化します。嘘の状態の上清を氷上の新しい冷却1.6ミリリットルチューブに移します。次に、Bradfordアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。

次に、1%Triton X-100およびBMEを添加した5Xサンプルバッファーを添加したホモジナイズバッファーを使用して、サンプルを最終濃度3〜5ミリグラム/ミリリットルに希釈します。各実験サンプルを2本のチューブに均等に分けます。次に、1つのサンプルを摂氏37度で30分間インキュベートし、もう1つのサンプルを摂氏100度で30分間インキュベートします。

チューブを断続的に反転させて、サンプルを溶液に保持します。その後、テキストプロトコルに従ってSDSページとウェスタンブロッティングを行います。TIRF顕微鏡とサンプルをセットアップし、テキストプロトコルに従ってニューロンの焦点面を見つけた後。

レーザーソフトウェアを起動し、レーザー制御ソフトウェアに接続します。照明を広視野に設定し、対物レンズを選択します。次に、サンプルの屈折率を設定し、491レーザーのTTLのチェックを外してレーザー強度を調整します。

イメージングパラメータの最適化は、床の無傷のエキソサイトーベシクルのイメージング中に重要であり、フォーカスドリフトと光毒性を回避しながら、分析に十分な高い信号対雑音比の画像を生成します。スライダーを 100 に調整してから、20 から 40 の間の値に戻します。次に、TTL を再確認します。

次に、透過光照明でサンプルに再度焦点を合わせます。次に、イメージングソフトウェアで、491レーザー照明を選択し、シャッターを開きます。レンズを傷つけないように、コンデンサーを逆さまにして光学ベンチに置きます。

レーザーの焦点を天井に微調整し、コンデンサーを取り外した状態で、閉じたフィールドダイヤフラムの中心にポイントを中央に配置します。次に、コンデンサーを交換し、TIRFソフトウェアで浸透深さを110ナノメートルに送信しました。その後、広視野照明からTIRF照明モードに切り替えてイメージングします。

次に、広視野落射蛍光を使用して、接眼レンズを通じて細胞を発現するVAMP2蛍光性物質を見つけます。次に、光退色と光毒性を低減するために、イメージングパラメータを調整して、最小限の露光時間とレーザー強度を使用して、信号対雑音比とダイナミックレンジを最大化します。セルごとに連続オートフォーカスを設定します。

次に、0.5秒ごとに5分間取得が行われるタイムラプス画像セットを取得します。層流フード内のネトリン-1刺激状態では、細胞の皿にネトリン-1の最終濃度を500ナノグラム/ミリリットルに加え、イメージングの1時間前に皿をインキュベーターに戻します。細胞の領域と時間ごとに正規化されたエキソサイトーシスイベントの頻度を定量化します。

ImageJ では、ファイルをウィンドウにドラッグするか、[ファイル]、[開く]、[ファイル名] の順に選択して、イメージスタックを開きます。小胞融合イベントを表さない安定した蛍光シグナルを除去するには、Image、Stack、Z Project、Projection type Average Intensityを使用します。スタック全体の平均 Z 投影を作成します。

プロセス、画像計算機、画像1、スタック、操作、減算画像2を使用して、タイムラプス内の各画像から結果の平均画像を減算します。その結果、Z プロジェクションが新しく作成されます。これはエキソサイトーシスイベントを強調します。

次に、VAMP2フルオレンが原形質膜内で拡散するにつれて急速に拡散する回折限定蛍光シグナルのスポットとして識別できるエキソサイトーシスフションイベントを目視でカウントします。画像、調整、しきい値で最初の画像を強調表示し、セル全体がしきい値が強調表示されるまでスライダーを調整します。次に、[分析] で [測定値の設定] を選択し、領域と表示ラベルを確認します。

ワンドトレースツールを使用して、しきい値のセルラー領域を設定し、Mを押して測定します。収集したデータをテキストプロトコルに従ってスプレッドシートに転送します。in vitroで2日間、トランスフェクションされていないニューロンを含むガラス底のイメージングディッシュを、予め温めた湿潤環境チャンバーに入れます。

6つのDXプランアポクロマート、1.4NA DIC対物レンズ、高開口コンデンサーを装備した顕微鏡を使用して、最高の画質と解像度を実現します。次に、透過光照明を使用して、焦点面を調整して、接眼レンズを通じてニューロンを見つけます。軸索分岐のDICイメージングでは、画像の最適化には低温照明の適切な設定が不可欠であり、分析可能な結果を生成するために重要です。

次に、視野内に目的のニューロンを配置した状態で、イメージングソフトウェアのマルチエリア取得機能を使用して、少なくとも6つの細胞のXYZ位置を見つけて保存します。次に、最終濃度をネトリン-1または他の対象因子の1ミリリットルあたり250ナノグラムに添加して、細胞をシミュレートし、マルチエリア取得を開始します。24時間、20秒ごとに各位置で画像を順次取得します。

取得を一時停止し、必要に応じてフォーカスを合わせ直します。イメージングソフトウェア内で、[アプリ]、[多次元データの確認]の順に選択して画像を確認し、目的のファイルを開きます。イメージングセッション中に形成された安定した軸索枝を特定します。

トレース領域ツールを使用して、軸索の基部から先端までの安定した軸索枝を測定します。ニューロンをネトリンおよびボツリヌス毒素で治療し、固定および免疫染色した後、テキストプロトコルに従ってβ-3ツボリンおよびアクチンの免疫染色を行います。倒立顕微鏡を使用して、広視野落射蛍光画像を収集します。

ImageJで画像スタックを開き、分岐を使用してライン、セグメント化されたラインを手動で分析し、体細胞から伸びる最長の神経突起として定義されている軸索をトレースします。Analyze、Tools、ROI Managerを使用して、軸索トレーシングを関心領域として保存します。次に、長さが20マイクロメートル以上の神経突起として定義される各軸索枝をトレースして保存します。

分析には 1 次ブランチのみを含めます。ここに示されているのは、SDS耐性SNAREコンプレックスアッセイの完了後のウェスタンブロットです。SNAP25、Syntaxin 1A、VAMP2 をプローブ。

ここには、SNAREタンパク質が複合体を形成し、識別可能なモノマーが示されています。皮質ニューロンで経時的に発生するVAMP2フルロエン媒介性エキソサイトーシスイベントの例をここに示します。ズームされた挿入図は、体細胞、軸索枝、および軸索成長円錐を示し、このアッセイの空間的有用性を示しています。

円は単一のエキソサイト融合イベントを爆発させ、これはTIRF顕微鏡で見ることができます。このタイムラプスDICイメージングは、ネトリン刺激による軸索枝の形成をリアルタイムで示しています。これらの位置は、分岐サイトからの最初の突起を示します。

これらは、主軸索から枝の先端まで測定された少なくとも20マイクロメートルの完全に形成された安定した枝を表しています。この実験では、3 DIVの皮質ニューロンを、分岐を刺激するネトリン-1で処理するか、SNARE複合体の構成要素であるSNAP25を切断してエキソサイトーシスをブロックするボツリヌスA毒素で処理しました。結果は、SNARE媒介性エキソサイトーシスがネトリン依存性分岐に必要であることを示しています。

一度習得すれば、DICイメージングは1回の夜間イメージングセッションで完了できます。個々のエキソサイトーシスイベントのTIRFイメージングは、4〜5時間で管理できます。SNARE複合体形成生化学プロトコルは、2時間で実行できます。

これらの手順を試みるときは、一歩も急がず、自分のペースで進めることを忘れないでください。各手順では、最良の結果を得るために注意と忍耐が必要です。この手順に続いて、タグ付きベシクル成分とタグ付き候補カーゴのコトランスフェクションなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。

エキソサイトーシス小胞の貨物は何ですか?開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が、解離した神経細胞培養における神経突起形成、軸索分岐、およびその他の形態形成段階を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ニューロンの形態形成の変化に対応するニューロンのエキソサイトーシス小胞融合イベントの空間的および時間的性質を観察し、定量化する方法を十分に理解できるはずです。

ボツリヌス毒素や高出力レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、適切な安全服の着用や顕微鏡の安全ロック機構の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。