軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

この手順の全体的な目的は、ニューロンの開口分泌小胞の融合および軸索分岐の時空間的な発生について、定量的な観察を行うことです。この手法は、ニューロンの発達過程において、小胞融合がいつ、どこで拡大する細胞膜に膜材料を挿入するかという、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞における高い空間分解能と時間分解能の両方を同時に取得できるライブセルイメージングと、集団ベースの情報（ポピュレーションデータ）を取得する生化学的アプローチを組み合わせている点にあります。

プロトコルの手順に従って、Netrin-1またはコントロールを用いて皮質ニューロンを培養および刺激した後、各条件の1番目のウェルからPBSを吸引し、250 µLのホモジナイズ緩衝液と交換します。氷上で5分間インキュベートし、その後、セルリフターを用いて氷上で細胞をホモジナイズします。

同じ条件の次のウェルからPBSを吸引し、そこに先ほどホモジナイズした混合液を加えてタンパク質濃度を高めます。次に、ホモジナイズした溶液を氷上の予め冷却した1.6 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、最終濃度が1%になるように20%Triton X-100を加えます。その後、1,000 microliterピペットを用いて、気泡が入らないように注意しながら混合液を10回トリチュレーションします。タンパク質を可溶化させるため、チューブを氷上で2分間インキュベートします。

次に、非可溶化物質をペレット化するため、4 °Cで6,010 RCFで10分間遠心分離します。上清を氷上の新しい冷却済み1.6 mLチューブに移します。続いて、ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を測定します。

次に、1% Triton X-100を含むホモジナイズ緩衝液とBMEを添加した5Xサンプルバッファーを用いて、試料を最終濃度3-5 mg/mLになるように希釈します。各実験試料を2本のチューブに等量ずつ分注します。その後、一方の試料を37 °Cで30分間、もう一方の試料を100 °Cで30分間インキュベートします。

サンプルを溶液中に保持するため、チューブを断続的に転倒混和します。その後、本文のプロトコルに従ってSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを行います。TIRF顕微鏡とサンプルのセットアップを行い、本文のプロトコルに従ってニューロンの焦点面を特定します。

レーザーソフトウェアを起動し、レーザー制御ソフトウェアに接続します。照明をワイドフィールドに設定し、対物レンズを選択します。次に、サンプルの屈折率を設定し、491レーザーのTTLのチェックを外してレーザー強度を調整します。

床に固定されたエキソサイトーシス小胞のイメージングにおいて、フォーカスのドリフトや光毒性を回避しつつ、解析に十分な高SN比の画像を得るためには、イメージングパラメータの最適化が重要です。スライダーを100に調整した後、20から40の間の値まで戻してください。その後、TTLを再確認します。

次に、透過光照明で再びサンプルに焦点を合わせます。その後、イメージングソフトで491 nmレーザー照明を選択し、シャッターを開きます。レンズに傷がつかないよう、コンデンサーを光学ベンチの上に逆さまに置いてください。

天井におけるレーザーの焦点位置を微調整し、コンデンサーを取り外した状態で、その点を閉結像絞りの中心に合わせます。次にコンデンサーを再度取り付け、TIRFソフトウェアで浸透深さを110 nanometersに設定します。その後、ワイドフィールド照明からTIRF照明モードに切り替えてイメージングを行います。

次に、広視野エピ蛍光顕微鏡を用いて、接眼レンズからVAMP2蛍光発現細胞を探します。その後、光退色と光毒性を低減するため、最小限の露光時間とレーザー強度を用いて、SN比とダイナミックレンジを最大化するようにイメージングパラメータを調整します。細胞ごとに連続オートフォーカスを設定してください。

次に、0.5秒間隔で5分間、タイムラプス画像セットを取得します。層流クリーンベンチ内でのNetrin-1刺激条件では、細胞の入ったディッシュにNetrin-1を最終濃度500 ng/mLになるように添加し、イメージングの1時間前にディッシュをインキュベーターに戻します。これにより、細胞面積および時間あたりに正規化したエキソサイトーシスイベントの頻度を定量化します。

ImageJで、ファイルをウィンドウにドラッグするか、「File」、「Open」からファイル名を選択してイメージスタックを開きます。小胞の融合イベントを表さない安定した蛍光信号を除去するには、「Image」、「Stack」、「Z Project」を選択し、「Projection type」で「Average Intensity」を使用します。これにより、スタック全体の平均Z投影（Z Projection）が作成されます。

Process、Image Calculatorを選択し、Image 1にスタック、OperationにSubtract image twoを指定して、タイムラプス画像の各画像から得られた平均画像を減算します。これにより、新たにZ Projectionが作成されます。この操作で、エキソサイトーシス事象を強調することができます。

次に、目視でエキソサイトーシスの融合イベントを数えます。これは、VAMP2蛍光が細胞膜内で拡散するにつれて急速に拡散する、回折限界の蛍光シグナルのスポットとして識別できます。[Image]、[Adjust]、[Threshold]で最初の画像をハイライトし、細胞全体が閾値ハイライトされるまでスライダーを調整します。その後、[Analyze]から[Set Measurements]を選択し、[area]と[display label]にチェックを入れます。

マジックワンドツールを使用して、閾値処理された細胞領域を指定し、Mキーを押して計測します。収集したデータをテキストプロトコルに従ってスプレッドシートに転送してください。in-vitroでの2日目に、非トランスフェクションニューロンを含むガラスボトムイメージングディッシュを、あらかじめ加温した加湿環境チャンバー内に配置します。

最高の画質と解像度を得るため、60倍 DXプランアポクロマート 1.4 NA DIC対物レンズと高開口数コンデンサーを備えた顕微鏡を使用します。次に、透過光照明を用いて、接眼レンズを通してニューロンを探しながら焦点面を調整します。軸索分枝のDICイメージングにおいて、適切な照明設定は画像の最適化に不可欠であり、解析可能な結果を得るために極めて重要です。

次に、目的のニューロンが視野内にある状態で、イメージングソフトのマルチエリア取得機能を使用して、少なくとも6個の細胞のXYZ位置を特定して保存します。ここで、細胞を刺激するために、Netrin-1またはその他の目的の因子を最終濃度250 ng/mLとなるように添加し、マルチエリア取得を開始します。24時間にわたり、各位置で20秒ごとに連続して画像を撮影します。

必要に応じて、撮影を一時停止して再フォーカスを行います。イメージングソフトウェア内で、[Apps] から [Review Multi Dimensional Data] を選択して画像をレビューし、目的のファイルを開きます。イメージングセッション中に形成された安定した軸索分枝を特定します。

トレース領域ツールを使用して、軸索の基部から先端まで、安定した軸索分枝を計測します。テキストのプロトコルに従い、ニューロンをNetrinおよびボツリヌス毒素で処理し、固定およびβ-3 tubulinとactinの免疫染色を行った後、倒立顕微鏡を用いて広視野エピ蛍光画像を取得します。

ImageJでイメージスタックを開き、ラインツール、セグメント化ラインツールを使用して、細胞体から伸びる最も長い神経突起として定義される軸索を手動でトレースして解析します。「Analyze」、「Tools」、「ROI Manager」を使用して、トレースした軸索を関心領域（ROI）として保存します。次に、長さが20 µm以上の神経突起として定義される各軸索分枝をトレースし、保存します。

解析には一次分枝のみを含めてください。ここに示すのは、SDS耐性SNARE複合体アッセイ完了後のウェスタンブロットです。SNAP25、Syntaxin 1A、およびVAMP2について検出しています。

複合体を形成したSNAREタンパク質が示されており、個別のモノマーが識別可能です。ここでは、皮質ニューロンにおいて時間経過とともに発生するVAMP2フルオレン介在性のエキソサイトーシス現象の例を示しています。拡大挿入図は、細胞体、軸索分枝、および軸索成長円錐を示しており、本アッセイの空間的な有用性を提示しています。

円は、TIRF顕微鏡で観察される単一のエキソサイトーシス融合イベントを示しています。このタイムラプスDICイメージングでは、Netrinによって刺激された軸索分岐の形成をリアルタイムで示しています。これらの箇所は、分岐部位からの初期の突出を示しています。

これらは、主軸索から分枝先端までで20 µm以上と測定された、完全に形成された安定した分枝を表しています。本実験では、3 DIVの皮質ニューロンに対し、分枝を促進するNetrin-1、またはSNARE複合体の構成成分であるSNAP25を切断しエキソサイトーシスを阻害するボツリヌスA毒素のいずれかを投与しました。その結果、SNARE介在性のエキソサイトーシスがNetrin依存的な分枝に必須であることが示されました。

習熟すれば、DICイメージングは1回のオーバーナイト撮影セッションで完了させることができます。個々のエキソサイトーシスイベントのTIRFイメージングは4～5時間で管理可能です。SNARE複合体形成の生化学プロトコルは2時間で実施できます。

これらの手順を行う際は、ペースを配分し、個々のステップを急がないことが重要です。最善の結果を得るためには、各手順において細心の注意と忍耐が必要です。本手順に続き、タグ付き小胞成分とタグ付き候補貨物の共導入などの他の手法を用いて、さらなる疑問を検証することができます。

開口分泌小胞のカーゴとは一体何でしょうか。この技術の開発により、神経科学分野の研究者が、任意の解離神経細胞培養において、神経突起形成や軸索分枝、および形態形成におけるその他の段階を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、神経形態形成の変化に伴う神経細胞の開口分泌小胞融合イベントの空間的および時間的特性を観察し、定量化する方法を十分に理解できるはずです。

ボツリヌス毒素や高出力レーザーを取り扱うことは非常に危険であるため、本手順を実施する際は、適切な安全衣の着用や顕微鏡のセーフティロック機構の使用など、常に十分な予防措置を講じてください。