Name: 軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 学ぶ神経細胞の軸索分岐におけるSNARE媒介エキソサイトーシスの分子メカニズム。Netrin-1刺激下での生細胞イメージングと生化学アッセイを組み合わせた手法で、神経発達における膜物質の動態を定量的に解析する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RO1-GM108970（SLG）とF31-NS087837（CW）：この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていました。

<ol><li>Drachman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+we+have+brain+to+spare%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Do we have brain to spare?</a> Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+Is+Required+for+Commissural+Axon+Guidance+in+the+Developing+Vertebrate+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+netrin-1+in+the+guidance+of+cortical+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents.</a> Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins%3A+versatile+extracellular+cues+with+diverse+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions.</a> Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).</li>
<li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+expansion%3A+a+neuron%27s+Herculean+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).</li>
<li>Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Netrin-1-sensitive+mechanism+promotes+local+SNARE-mediated+exocytosis+during+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+membrane+fusion+complex%3A+action+of+clostridial+neurotoxins+on+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly.</a> The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Centonze Frohlich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Contrast+and+Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Blasi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+selectively+cleaves+the+synaptic+protein+SNAP-25%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25.</a> Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

軸索の分岐は基本的な神経発達プロセスであり、哺乳類の神経系の広大な神経接続を支えています。局所的な原形質膜拡張に関与するメカニズムを理解することは、正常な神経発達と病理学的神経発達の両方を理解するために不可欠です。集団レベルと単一細胞レベルの両方の方法論を組み込んだ多面的なアプローチを使用すると、集団レベルの分析を損なうことなく再現性が向上し、空間的および時間的分解能が向上します。単一細胞レベルでは、固定細胞アプローチと生細胞アプローチの両方を利用してネトリン依存性軸索分岐を調べることで、複数の実験にわたって大きなサンプルサイズを収集できること、DICイメージングによる時間分解能、TIRF顕微鏡を使用したエキソサイトーシス融合の時空間分解能という3倍の利点が得られます。 
SDS耐性SNARE複合体アッセイは、培養中の皮質ニューロンの不均一性を説明するSNARE活性の測定を可能にします。SNARE複合体は非常に安定しています。一方、他のほとんどのタンパク質複合体は、SDSの添加によって解離します。SNARE複合体はSDS耐性がありますが、耐熱性はありません。この特性により、SNAR...

最近の推定では、人間の脳には1011のニューロンと1014のシナプス結合が含まれていることが示唆されており、生体内での軸索分岐の重要性が強調されています。ネトリン-1などの細胞外軸索誘導手がかりは、軸索を適切なシナプスパートナーに導き、軸索の分岐を刺激し、それによってシナプス容量を増加させます2-5。ネトリン-1依存性軸索分枝化には、かなりの原形質膜拡張6が関与し、SNARE複合体依存性エキソサイトーシス小胞融合7を介した追加の膜成分の送達が必要であると仮定しました。
ネトリン-1依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの役割の調査は、いくつかの要因によって複雑化しています。まず、皮質ニューロンの不均一性は、有意な影響を特定するために必要なサンプルサイズを増加させ、イメージングのようなシングルセル技術を複雑にします。第二に、生化学的手法は集団レベルで発生する変化の観察を可能にしますが、軸索分岐の時間枠で軸索への原形質膜の拡大を局在化するために必要な時間的および空間的解像度を欠いています。最後に、軸索の枝は数時間で形成されますが、軸索の伸展に寄与する細胞の変化は数分以内に始まり、数秒のオーダーで発生する可能性があるため、実験的検討の時間的範囲が広がります。
私たちは、これらの多様な時間的および空間的なスケールのエキソサイトーシスと軸索分岐に対処するためのマルチテクニックアプローチを概説し、したがって基本的な細胞メカニズムの理解を深めます。これらのアプローチを利用することで、軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの重要な役割を裏付ける証拠が得られます。

<table><tbody><tr><td>6ウェル組織培養処理プレート</td><td>オリンパスプラスチック</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; 硝酸を24時間処理し、脱イオン水で2回すすぎ、使用前に乾燥させる必要があります。1 mg/mLのポリ-d-リジンでコーティングし、細胞をプレーティングする前にすすぐ必要があります。</td></tr><tr><td>Amaxaヌクレオフェクション溶液</td><td>ロンザ</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/トランスフェクション</td></tr><tr><td>アマクサヌクレオフェクター/エレクトロポレーター</td><td>ロンザ</td><td></td><td>プログラム O-005</td></tr><tr><td>35 mm ガラス底 ライブセルイメージングディッシュ</td><td>マテックコーポレーション</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>1mg/ml ポリ-d-リジンでコーティングし、細胞をめっきする前にすすぐ必要があります</td></tr><tr><td>オリンパス IX81-ZDC2 倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラムダ LS キセノンランプ</td><td>サッターインスツルメンツ カンパニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>環境ステージ トップインキュベーター</td><td>東海ヒット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF 対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンドール iXon EM-CCD</td><td>アンドール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オデッセイ リコー 赤外線イメージングシステム</td><td>LI-COR</td><td>オデッセイ CL-X</td><td>スキャニングブロットに使用</td></tr><tr><td>画像スタジオソフトウェアスイート</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Infraredシステムでのスキャンに使用されます。</td></tr><tr><td>オリンパス</td><td>モレキュラー デバイス、LLC</td><td>バージョン7.7.6.0</td>のブロットのオフライン解析に使用される画像スタジオライト <td>DICタイムラプスの全てのイメージングと解析に使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td>CELL TIRF制御ソフトウェア</td> オ<td>リンパス</td><td></td><td>TIRFイメージング用レーザー制御に使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td>フィジー(画像J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Version 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA プラン アポクロマート対物</td>レンズ <td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニューロバサル培地</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>無血清およびトリプシン消光培地の両方のためのベース溶液</td></tr><tr><td>サプリメント B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml 無血清培地およびトリプシンクエンチング培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml 無血清培地</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>バイオベーシックインボルテーテッド</td><td>9048-46-8</td><td>10%溶液、1x PBS含有、ブロッキングカバースリップ用、TBS-T含有5%溶液、ニトロセルロース膜のブロッキング用。</td></tr><tr><td>10x&nbsp; トリプシン</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>フィッシャー科学</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>フィッシャー科学</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-没食子酸プロピル</td><td>MP Biomedicals 102747</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール測光グレード</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール(非光学グレード)</td><td>フィッシャー科学</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-メルカプトエトナール</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td> 滅菌<td>水に 1 mg/mL</td></tr><tr><td>ボツリヌス菌 A 毒素 BoNTA</td><td>リスト 生物学研究所</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ ポリクローナル抗ヒト VAMP2</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>マウス モノクローナル抗ラット Syntaxin1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>ヤギのポリクローナル反人間SNAP-25</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-7538</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗ヒト&β;III-チューブリン&nbsp;</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 および Alexa Fluor 488 ファロイジン、または Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-色素二次抗体</td><td>LI-COR</td><td>P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 ロバ アンチマウス, 680 ロバ アンチ ウサギ, 680 ロバ アンチ ヤギ</td></tr><tr><td>0.2 &#956;m孔径ニトロセルロース膜</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fisher 科学</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>ブロムフェノールブルー</td><td>シグマ</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Fisher 科学</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー 科学</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% ビスアクリルミド</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>strongコメント</strong</td></tr><tr><td>>Alternative Validated Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;マウスモノクローナルシナプトレビン2(VAMP2)</td><td>シナプスシステム</td><td>104-211</td><td></td></tr>マウス<tr><td>モノクローナルSNAP25</td><td>シナプスシステム</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

神経発達中、成長する軸索は軸索枝を精緻化することにより、複数のシナプスパートナーに広がります。軸索の分岐は、ネトリン-1のような細胞外誘導の手がかりによって促進され、軸索原形質膜の表面積が劇的に増加します。ネトリン-1依存性軸索の分岐には、原形質膜の膨張の時間的および空間的制御が含まれている可能性が高く、その成分はエキソサイトーシス小胞融合を通じて供給されます。これらの融合事象は、VAMP2(小胞関連膜タンパク質2)などのv-SNAREと、原形質膜t-SNAREであるシンタキシン-1およびSNAP25(シナプトソーム関連タンパク質25)を含むSNARE複合体の形成に先行します。本明細書で詳述されているのは、軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの役割を調べるために使用される多面的なアプローチである。この組み合わせたアプローチの強みは、個々のニューロンにおける単一の小胞融合イベントのダイナミクスから、培養ニューロン集団におけるSNARE複合体の形成や軸索の分岐まで、さまざまな空間的および時間的分解能でデータを取得できることです。このプロトコルは、pH感受性GFP(VAMP2-pHlourin)でタグ付けされたVAMP2を発現する皮質ニューロンの内因性SNARE複合体および全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法のアッセイレベルに対する確立された生化学的アプローチを利用して、個々のニューロンのエキソサイト活性におけるネトリン-1依存性の変化を特定します。ネトリン-1依存的な分岐のタイミングを解明するために、単一ニューロンの時間単位にわたるタイムラプス微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡法が利用されます。固定細胞免疫蛍光法と、SNARE機構を切断し、エキソサイトーシスをブロックするボツリヌス神経毒との組み合わせは、ネトリン-1依存性軸索分岐がSNAREを介したエキソサイトーシス活性を必要とすることを示しています。

神経細胞の集団におけるSDS耐性SNARE複合体の量を測定するためにインビトロ生化学的手法に活用。 図1は、SNAP-25、syntaxin1AとVAMP2についてプローブSDS耐性SNARE複合体アッセイの完了後、得られたウエスタンブロットを示しています。 基底細胞膜にTIRF顕微鏡法は、単一のセル内の個々のエキソサイトーシス融合事象の高解像度の画像を提供する。 図2Aは、VAMP2-phluorin媒介エキソサイトーシスイベントを識別するための画像解析手法を示します。小胞の融合が起こるように挿入図は、単一のエキソサイトーシスイベントを示し、VAMP2-phluorinは、原形質膜中に拡散するように。 図2Bは、皮質ニューロンの時間（秒）に発生したエキソサイトーシスイベントの例を示しています。ズームインセットはソー...

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

この手順の全体的な目的は、ニューロンの開口分泌小胞の融合および軸索分岐の時空間的な発生について、定量的な観察を行うことです。この手法は、ニューロンの発達過程において、小胞融合がいつ、どこで拡大する細胞膜に膜材料を挿入するかという、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞における高い空間分解能と時間分解能の両方を同時に取得できるライブセルイメージングと、集団ベースの情報（ポピュレーションデータ）を取得する生化学的アプローチを組み合わせている点にあります。プロトコルの手順に従って、Netrin-1またはコントロールを用いて皮質ニューロンを培養および刺激した後、各条件の1番目のウェルからPBSを吸引し、250 µLのホモジナイズ緩衝液と交換します。氷上で5分間インキュベートし、その後、セルリフターを用いて氷上で細胞をホモジナイズします。同じ条件の次のウェルからPBSを吸引し、そこに先ほどホモジナイズした混合液を加えてタンパク質濃度を高めます。次に、ホモジナイズした溶液を氷上の予め冷却した1.6 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、最終濃度が1%になるように20%Triton X-100を加えます。その後、1,000 microliterピペットを用いて、気泡が入らないように注意しながら混合液を10回トリチュレーションします。タンパク質を可溶化させるため、チューブを氷上で2分間インキュベートします。次に、非可溶化物質をペレット化するため、4 °Cで6,010 RCFで10分間遠心分離します。上清を氷上の新しい冷却済み1.6 mLチューブに移します。続いて、ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を測定します。次に、1% Triton X-100を含むホモジナイズ緩衝液とBMEを添加した5Xサンプルバッファーを用いて、試料を最終濃度3-5 mg/mLになるように希釈します。各実験試料を2本のチューブに等量ずつ分注します。その後、一方の試料を37 °Cで30分間、もう一方の試料を100 °Cで30分間インキュベートします。サンプルを溶液中に保持するため、チューブを断続的に転倒混和します。その後、本文のプロトコルに従ってSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを行います。TIRF顕微鏡とサンプルのセットアップを行い、本文のプロトコルに従ってニューロンの焦点面を特定します。レーザーソフトウェアを起動し、レーザー制御ソフトウェアに接続します。照明をワイドフィールドに設定し、対物レンズを選択します。次に、サンプルの屈折率を設定し、491レーザーのTTLのチェックを外してレーザー強度を調整します。床に固定されたエキソサイトーシス小胞のイメージングにおいて、フォーカスのドリフトや光毒性を回避しつつ、解析に十分な高SN比

utilizing-combined-methodologies-to-define-role-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは利用してニワトリ胚脊髄の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路を可視化する方法を示しています...

活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

齧歯類の脊髄への感覚求心性のステレオタイプの予測は、単一の軸索のトレースを通して軸索分岐を研究するために簡単にアクセス可能な実験系を提供する。...

マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するDRGニューロンのDII -標識

神経管における遺伝子発現は、細胞型特異的、トレーサブルな方法でダウンレギュレートすることができる方法が記載されている。我々はどのように実証する...

オープンブックの準備におけるDiIを注入による開発神経管と表現型の評価におけるmiRNAベースのプラスミドのインオボエレクトロで

出典: Winkle, C. C., et al. 軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。(2016年)このビデオでは、示差干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡を使用して、皮質ニューロンの軸索分岐をリアルタイムで観察するライブ...

マウス皮質ニューロンにおける軸索分岐のリアルタイム in vitro イメージング

ここでは、pH感受性緑色蛍光タンパク質変異体pHluorinを用いて、細胞表面における軸索誘導受容体の密売の時空間的ダイナミクスを研究する。pHluorinタグ付き受容体は、細胞培養と...

細胞培養およびひよこ胚における軸索誘導受容体のダイナミクス評価におけるpHluorinの使用

このプロトコルは、ラットから分離された後根神経節(DRG)ニューロンの単離と、軸索の整列を強化するための静的なプレストレッチ細胞培養システム上でのDRGニューロンの培養、そしてその後のシュワン細胞(SC)の共培養による髄鞘形成を促進することを説明しています。...

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

この手順は、神経突起の伸長を誘導するマイクロピペットに固定されたポリ-D-リシン被覆ビーズを使用して、マイクロ流体チャンバーに組織化された神経突起を迅速に開始、伸長および連結する方法を記載する。...

ニューロン回路の再学習：速い神経突起伸長と機能的ニューロン結合の新しい方法

縦一直線に並べられたアストロ...

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

このプロトコルでは、視床皮質軸索分岐およびシナプス形成の脊髄共培養系における視床と大脳皮質の同時イメージング法について説明します。個々 の視床皮質軸索とその神経終末は、下流と GFP タグ...

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

学ぶ神経細胞の軸索分岐におけるSNARE媒介エキソサイトーシスの分子メカニズム。Netrin-1刺激下での生細胞イメージングと生化学アッセイを組み合わせた手法で、神経発達における膜物質の動態を定量的に解析する方法を解説します。

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

さらに動画を探す