Name: ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚全体のリン酸化エピトープ免疫染色法。Danio rerioを用いて一次繊毛におけるタンパク質活性化の位置と動態を可視化し、発生生物学と細胞生物学の重要な課題を解明します。

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この作品は、国立科学財団の助成金IOS-0817658によってサポートされていました。

このプロトコルでのゼブラフィッシュの手順は、バージニア・コモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 試薬の調製<ol><li> 4％PFA / PBS。ドラフト内でパラホルムアルデヒドの8グラム（PFA）を秤量します。まだドラフト中ながら、50℃まで撹拌しながら加熱し、H 2 Oを蒸留〜80ミリリットルで乾燥PFAを溶解します。 PFAが完全に溶解され、溶液が明確になるまで新鮮な1NのNaOHの10滴 - 攪拌しながら、3を加えます。暑さから削除し、100ミリリットルの2×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。蒸留H 2 Oで200ミリリットルにボリュームをもたらしますRTに冷却し、使用前に7.4のpHを確認します。 4℃で暗所に保管したが1週間以内に使用します。 </li><li>任意のサプリメントなしで、100％メタノールを使用してください。任意のサプリメントなしで、95％エタノールを使用してください。 </li><li>リン酸緩衝トゥイーン（PBT）を準備します。 0.1％のTween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を補います。 0を追加します。PBS 1×100mlに20％のTween-20のストック溶液5ml。室温で保管してください。 </li><li>リン酸緩衝トリトンX（PBTx）を準備します。 0.1％トリトンX-100を含むPBSを補います。 100mlのPBSに20％トリトンX-100株の0.5ミリリットルを追加します。室温で保管してください。 </li><li> 10％NGS / PBTxを準備します。正常ヤギ血清（NGS）ブロック非特異的結合部位。 -20℃で分量を保存NGS。使用するには、9ミリリットルPBTxに1ミリリットルを追加します。 </li><li> 50％グリセロール/ PBSを準備します。 2×PBSおよび100％グリセロールの徹底的に等しい部分を混ぜます。室温で保管してください。 </li></ol> 2.胚の固定<ol><li> 繁殖 、野生型（ABおよびWIK）またはトランスジェニック（ 例えば 、βアクチン。：CAAX-GFP）を取得します。自然交配を通じて胚を。必要であれば、説明したように、構築物またはモルホリノで胚を注入する。15,16 </li><li> 胚を上げる。胚を収集し、説明したように色素沈着をブロックするために28.5°C 0.003％の1-フェニル-2-チオ尿素の存在下で（PTU）でインキュベートする。17 </su<html> P&gt; </li><li>胚は、所望の発達段階、18に達したとき。修正 、 &#160; MESABを使用して胚を麻酔、できるだけ多くのシステムの水を除去し、3のために、新鮮な4％PFA / PBSを追加 - RTで4時間。注：時々未満20時間後に受精（HPF）、前dechorionationに固定します。 20 HPF後の回では、解剖顕微鏡下で細かい点鉗子の2ペアを使用して固定する前にdechorionate。 </li><li> ソリューションを変更する。説明したように、ワイドボアピペットを用いて胚を移す。17変更ソリューションを1.5ミリリットルキャップされたマイクロ遠心チューブに、単に胚は、遠心分離することなく、重力によって沈降させることによって。 </li><li> ポスト固定剤 3の後- 。4時間、少なくとも48時間、-20℃で100％のメタノールとストアと置き換え、PFA / PBSを削除します。注：最大P-のCaMK-II免疫反応性については、1週間に合計メタノール蓄積時間を制限します。 </li></ol>&quot;&gt; 3。免疫染色胚全体<ol><li>キャップされた1.5ミリリットルのマイクロチューブに各実験条件について10胚の最小値を置き、それらにラベルを付けます。 </li><li>胚が解決することができます。削除し、メタノールを破棄し、次のステップに示すように、エタノールの濃度を減少さ0.5 mlを含有する進行性の洗浄で再水和します。各ステップは、ロッキングで5分間の洗浄です。 </li><li>次第にこれらの5の溶液で再水和：66％エタノール/ 33％PBTx、33％エタノール/ 66％PBTx、100％PBTx、100％PBTx（これはPBTxの最初の繰り返しである）、100％PBTxは（これは、第二の反復でありますPBTx）。 </li><li>最後PBTx洗浄を削除してください。 0.5ミリリットル10％NGS / PBTxを追加します。緩やかに揺り動かしながら、室温で少なくとも1時間インキュベートした後、溶液を除去し、廃棄します。 </li><li> 10％NGS / PBTxで希釈することにより、一次抗体溶液を準備します。共免疫染色した場合、最初のより高い親和性の抗体を使用しています。 500：この研究のために、1を希釈したマウス抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体とインキュベートします。 examplのためeは、10個のサンプルがある場合、10％NGS / PBTx 3 mlのストック抗体溶液の6マイクロリットルを結合し、各チューブに、この0.3 mlで分配します。 </li><li>すべての胚を浸漬する各チューブに希釈した一次抗体の0.5ミリリットル - 0.2を追加します。 RTで穏やかなロッキングO / Nでインキュベートします。 </li><li>午前中は、抗体溶液を除去し、廃棄します。過剰の一次抗体を洗い流すために0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。 </li><li>頭上の照明を暗くし、各条件は、少なくとも0.5ミリリットルを含むように、10％NGS / PBTxに適切な蛍光結合二次抗体を希釈します。マウス抗アセチル化チューブリン一次抗体と、緑色蛍光色素のヤギ抗マウスIgG 1で使用：500希釈。 </li><li>穏やかに暗闇の中で室温で揺らしながら4時間二次抗体をインキュベートします。今から、プロセスのサンプル淡色表示灯の下で、暗い容器にまたはアルミホイルで包むことによってインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの終了時に、二次抗体溶液を除去し、廃棄します。洗浄するために0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。 </li><li>共免疫染色した場合、最初の一次抗体とは異なる種から第二の一次抗体を得ます。これらの研究では、赤色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体によってウサギ抗ホスホのCaMK-II抗体に従います。 </li><li>ウサギ抗リンのCaMK-II抗体1:20に希釈します。胚の各チューブについて、その後、0.3ミリリットル10％NGS / PBTxにサスペンドストック抗体溶液の15μlを添加します。 </li><li>胚が浸漬され、ライトが淡色表示されていることを確認してください。暗闇の中で、室温で穏やかにロッキングO / Nでインキュベートします。 </li><li>薄暗い照明の下で午前中は、抗体溶液を除去し、廃棄します。 0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。 </li><li>薄暗いオーバーヘッドライトを保ち、適切な蛍光conjuを十分に希釈します各条件は、少なくとも0.5ミリリットルを含むように、二次抗体をゲーティング。 500 10％NGS / PBTx：本研究では、赤色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体（赤色チャンネル）1を希釈。 </li><li>穏やかに暗闇の中で室温で揺らしながら4時間第二の二次抗体をインキュベートします。 </li><li>このインキュベーションの終わりと薄暗い照明の下で、二次抗体溶液を除去し、廃棄します。 0.5ミリリットルPBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。撮像手順に応じてPBTxまたは50％グリセロール/ PBSのいずれかに保管してください。 </li></ol> 4.共焦点イメージングと処理<ol><li>イメージングのためのマウント胚。スライドガラス上に5胚 - 1を配置します。メインカバースリップとチャンバーの両側にカバースリップの断片を使用してスライド間のチャンバを作成します。典型的には、4つの＃1カバーガラスをシールすることなく、これらのスペーサ・スタックを作るために使用されます。 注：いいえマウンティング培地は必要ありません。 </li><li> 100Xの油浸を使用します目的は、透過光を用いて、焦点に単一胚をもたらすために。ライトをオフにします。共焦点顕微鏡をオンにします。適切なレーザー（緑色および/または赤色）がオンし、リモートフォーカスアクセサリーが締結されていることを確認してください。 </li><li>共焦点プログラムをオンにします。 「獲得バー、「適切な目的を選択します。 「XY基本」バーでは、1024ボタンをクリックすることで、1024に画像サイズを設定します。 </li><li> 「レーザーおよび検出器」バーでは、各チャネルのレーザーおよび検出器をオンにするために、赤488ボックスと緑の568のボックスをクリックしてください。培地にピンホール設定し、可視化するために、各チャネルの「ゲイン」バーのゲインを調整します。 </li><li> 「取得設定」バーでは、画像の収集を開始するために「ライブ」をクリックします。 「表示設定」バーで、「ライブ」ウィンドウの中央に「インテグラズームを強制」チェックボックスをオフにします。 </li><li> 「設定の取得」バーで、「Z」タブで、画像のレイヤーをステップ。 NUを選択した後光学切片のmberは、画像に組み込むz平面の「中心」にいくつかのポイントに移動します。 </li><li> 「Z」タブの下で、小さな赤い「リファレンス」ボックスをクリックします。これは、「センター」として選ばれた時点で、RFAをゼロにします。 （0.25ミクロンと2.0ミクロンの間に理想的である）、「ステップサイズ」と表示されたボックスで、層の厚さを選択します。 「ファイルサイズ」ボックスに注意を払い、1ギガバイトに制限しよう。 注：典型的には、0.5の最大40光学切片 - 1.0μm以下が得られるが、セクションの数は、経験的に決定することができます。 </li><li>画像の上部極端を見つけるには、次の「トップ」に丸をクリックして、zの層を通って移動します。今すぐ次の「下」に丸をクリックして、コンピュータはセンターバックとして層に画像を撮影します。再度、画像の下極端を見つけるために、層を通って移動します。 </li><li>レーザーを停止するには、「取得設定」ボックスに再び「ライブ」をクリックします。取得。このパネルでは、平均およびZスタックをラベルされた赤のボックスをクリックします。これらのボックスは緑色に変わります。 </li><li> 「取得設定」ボックスで、画像のシリーズ全体を取得するために「シングル」をクリックします。それは両方のチャネルで、全体のzスタックを走査のように進行状況を監視することができます。 </li><li> 、保存ボリュームウィンドウをクリックし、クリックして「名前を付けて保存」で、ファイルに名前を付けます。 「.ids」ファイルとして保存します。 zスタックがまだ開いている間のボリュームにファイルをレンダリングし、メニューをプルダウンして「ボリュームレンダリング」をクリックしてデータを選択します。 TIFFファイルとしてレンダリングされたファイルを保存します。これは、このマニュアルに示されている投影された画像です。 </li></ol>

<ol><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li>
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<li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li>
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<li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

PFA /メタノール法は、ゼブラフィッシュの開発中に、ホスホT 287 -CaMK-IIエピトープの免疫局在を最適化する第一の目的と本研究室で開発されました。このメソッドは、正常にゼブラフィッシュKV、12内耳14と腎臓を含むいくつかの繊毛器官の形成時にP-のCaMK-IIをローカライズ。13、特にKV段階で、この技術が必要でした。この方法の成功は、b）は、リン酸化のCaMK-IIエピトープ及びc）の保存が抗体にエピトープのアクセシビリティを向上し、原因自家蛍光のa）の最小化との組み合わせに起因する可能性が高いです。 このアプローチの主要な制限は、メタノール中の記憶の時間です。 P-のCaMK-IIの免疫反応性は、-20℃でメタノール中で2日後に最大​​であるが、このエピトープの反応性は、メタノール中で1週間保存後に失われています。なお、この時点でリン酸基がHYであるかどうかは明らかではありませんdrolyzedまたは更なる変性はそれが免疫反応性を低下させるが発生します。 -20℃でメタノール...

>jove_content<ここで述べられている技術は、受精、原腸陥入、体節形成、体幹、目、脳、臓器の形成など、初期発生中に発生するイベント中のCa2+シグナルの下流ターゲットを定義しようとした研究の結果です。1-3 胚性Ca2+シグナル伝達の当初の発見は、イクオリン4やフラ-2などの天然および人工のCa2+指標の使用に依存していました。5 現在の技術でも、Ca2+の過渡的な上昇を検出するには面倒な分析ツールが必要であり、そのようなCa2+信号のターゲットは明らかになりません。
この研究室では、CaMK-IIとして知られるCa2+/カルモジュリン依存性(多機能)プロテインキナーゼを介して作用するCa2+シグナルを調査しています。この酵素は、中枢神経系に豊富に存在し、もともと長期増強の調節因子として同定されています。6 CaMK-IIは脳特異的ではなく、無脊椎動物を含む動物界全体の種の全生涯および体全体にわたって広く発現し、高度に保存されています。7,8 CaMK-IIは、Thr287で自己リン酸化する能力により、Ca2+レベルが低下した後でも自身の活性を維持する独自の能力を持っています。この自己リン酸化状態では、CaMK-IIは脱リン酸化されるまで、Ca2+/CaM非依存的に活性を維持します。6 したがって、リン酸化CaMK-II(Thr287)の局在化により、自然で関連性のあるCa2+の上昇が発生した細胞を特定できます。
自己リン酸化(P-Thr287)哺乳類CaMK-IIに対する抗体は十分に特徴付けられており、当初は脳組織に活性化されたCaMK-IIを局在させるために使用されました。9 ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は7つのCaMK-II遺伝子10,11を持ち、そのタンパク質産物はこの領域にMHRQE[pT287]VECLKの配列を含んでいる。10,11 この配列は、このウサギポリクローナル抗体(MHRQE[pT]VDCLK;Upstate/Millipore)であるため、この抗体がゼブラフィッシュCaMK-IIと交差反応したことは完全な驚きではありませんでした。この研究室では、この抗体がゼブラフィッシュのCaMK-IIと自己リン酸化およびCa2+/CaM非依存的な活性に比例して反応することを示しました。12 さらに、パン特異的なCaMK-II抗体もゼブラフィッシュのCaMK-IIと交差反応することが示されています。13名
この抗体は、ゼブラフィッシュのCaMK-IIが、左右の非対称性の確立に必要な繊毛器官であるゼブラフィッシュクッパー小胞（KV）の片側の細胞で優先的に活性化されることを実証するために使用されてきました。12 この抗体を用いて、CaMK-IIがKVの左側にある4つの隣接する細胞において、臓器の位置が決定されるのと全く同じ発生段階で一過性に活性化されることを実証するために使用されました。12 クッパー小胞(KV)に加えて、自己リン酸化(P-T287)は、腎臓、ニューロマスト、内耳などの他の繊毛組織の特定の細胞内部位にも存在していました。12,13ゼブラフィッシュの腎臓では、P-T287-CaMK-IIは繊毛管細胞の頂端境界に沿って、および総排泄腔繊毛内で濃縮され、そこでそれらの組み立てに影響を与えます。13 最後に、発達中の内耳では、P-T287-CaMK-IIは繊毛の基部に強く集中しており、Delta-Notchシグナル経路を介して細胞分化に影響を与えます。14 要約すると、活性化CaMK-IIの検出は、細胞内Ca2+放出の部位を特定し、潜在的な新しいシグナル伝達経路を明らかにしました。
これらの発見は、活性化された(P-T287-自己リン酸化)CaMK-IIを局在する高感度で正確な方法の開発に完全に依存していました。ゼブラフィッシュのKV、腎臓、内耳を固定し、免疫染色する方法が記載されています。この手法の制限事項についても説明します。これらの技術は、脊椎動物の初期の発達において、リン酸化エピトープだけでなく、任意のエピトープの2つの蛍光チャネルで高解像度の画像を取得しようとする研究者にとって有用であるはずです。

<table><tbody><tr><td>1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU)</td> <td>Sigma</td><td>P-7629</td><td>0.12% ストック溶液。システム水で1:40を希釈します</td></tr><tr><td>Alexa488 抗マウス</td><td>IgG ライフテクノロジー</td><td>ズ A11001</td><td>ヤギポリクローナル、1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 抗ウサギ IgG</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11008</td><td>ヤギポリクローナル、1:500</td></tr><tr><td>で使用 Alexa488 ファロイジン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A12379</td><td>F-アクチンに優先的に結合</td></tr><tr><td>Alexa568 アンチマウス IgG</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11004</td><td>ヤギのポリクローナル、1:500で使用</td></tr><tr><td>Alexa568 抗ウサギIgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>ヤギのポリクローナル、1:500で使用</td></tr><tr><td>抗アセチル化 &#945;-チューブリン</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>マウス モノクローナル、1:500</td></tr><tr><td>で使用 抗リン酸化T287 CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>ウサギ ポリクローナル、1:20</td></tr><tr><td>抗総 CaMK-II</td><td>BD Biosciences で使用</td><td>611292</td><td>マウスモノクローナル、1:20エ</td></tr><tr><td>タノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーS96857</td><td>ラボグレード、95%変性</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td>デュ<td>モン#5</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップVWR</td><td></td><td>16004-330</td><td>#1&nbsp;厚さ</td></tr>ガラス<tr><td>顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャー12-550-15</td><td>標準ガラススライド</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーA411</td>冷凍<td>庫に保管</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>キャップ付きチューブ、無菌ではない</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 16210-064</td><td>アリコート1mlチューブ、冷凍庫に保管</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>P-6148</td><td>試薬グレード、結晶性</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>品質 生物学的</td><td>119-069-131</td><td>10xストック溶液またはラボで作られ</td></tr>ました <tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ</td><td>BP-151</td><td>水中の10%溶液、RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>で保存 ライフテクノロジー</td><td>ズ85113</td><td>水中の10%溶液、</td></tr><tr><td>RTで保存 化合物顕微鏡</td>ニ<td>コン</td><td>E-600</td><td>振動のないテーブルC1</td></tr><tr><td>プラスにマウント 2レーザースキャン共焦点</td><td>ニコン</td><td>C1プラス</td><td>EZ-C1プログラムによって実行されますが、アップグレードは「エレメント」</td></tr></tbody></table>

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

細胞の急速な増殖は、遺伝子の組織特異的発現およびシグナル伝達ネットワークの出現は、すべての脊椎動物の初期胚発生を特徴付けます。動態および信号の場所 - であっても、単一の細胞内 - 胚では、重要な発達遺伝子の同定を補完します。免疫染色技術は、一次繊毛のように小さな構造に細胞内および動物全体の信号の速度を定義することが示されているが記載されています。レーザー走査型共焦点複合顕微鏡を用いた定着、撮像処理画像のための技術は、わずか36のような時間で完了することができます。 ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、手頃な価格とヒト疾患に関連する脊椎動物種の研究を行うことを求める研究者のための望ましい生物です。遺伝的ノックアウトまたはノックダウンは、実際のタンパク質産物の損失によって確認されなければなりません。タンパク質損失のような確認ここに記載された技術を用いて達成することができます。シグナル伝達経路への手がかりはまた、翻訳後リン酸化によって修飾されたタンパク質と反応する抗体を使用して解読することができます。エピトープのリン酸化状態を維持し、最適化することは、この決意することが重要であり、このプロトコルによって達成されます。 本研究では、開発の最初の72時間と共局在クッパーの小胞（KV）における繊毛と関連する様々なエピトープ、腎臓および内耳中に胚を固定するための手法について説明します。これらの技術は、切開を必要としない、単純であり、比較的短時間で完了することができます。単一の画像に共焦点画像スタックを投写することは、これらのデータを提示する有用な手段です。

ホスホ-エピトープを可視化するための最適な条件 ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質エピトープの免疫学的局在を記述する方法は、in situハイブリダイゼーションを介してmRNAをローカライズするためのものに比べて比較的疎でした。ゼブラフィッシュ胚の繊毛細胞におけるタンパク質のエピトープを局在化に使用される固定剤は、メタノールとDMSOの混合物である、4％PFA / PBSとデントの固定液が含まれている。RNAの19ローカライズ全体in situハイブリダイゼーション （WISH） に取り付けることによって、典型的にはPFAを用いて達成されます100％メタノールでストレージが続く。20,21我々の研究は、WISH固定剤の組み合わせは、2〜7日後にメタノール中で時間を制限するとき、P-のCaMK-II抗体を用いた免疫学的局...

技術は全体のゼブラフィッシュ胚におけるホスホ - エピトープを免疫染色した後、一次繊毛のように小さな細胞構造の二色の蛍光共焦点の局在化を行うことが記載されています。固定およびイメージングのための技術は、特定のタンパク質の出現または活性化の位置と速度を定義することができます。

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚で活性化されたタンパク質を免疫局在化させることです。この手法は、胚全体におけるリン酸化タンパク質の局在や活性化など、発生生物学および細胞生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、カルシウムによって活性化されたタンパク質を免疫染色することで、胚全体におけるカルシウム依存性シグナル伝達を局在化できる点にあります。テキストのプロトコルに従って野生型またはトランスジェニック胚を得た後、色素沈着を抑制するためにシステム水中の胚に0.003% PTUを添加し、目的の発達段階までインキュベートします。胚が適切な段階に達したら、魚を麻酔させるためにディッシュにMESABを添加します。魚が麻酔状態になったら、システム水を可能な限り取り除き、新鮮な4% PFAとPBSを加えて室温で3〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、PFAを除去し、100% methanolに置換します。その後、胚を-20°Cで少なくとも48時間保存します。免疫染色を行うために、各実験条件につき最低10個の胚を、ラベルを貼った1.5 millimeterマイクロ遠心チューブに入れます。胚がチューブの底に沈殿したら、メタノールを除去して廃棄し、PBTxで希釈したエタノールを用いて段階的に濃度を下げながら洗浄し、胚を再水和させます。最後のPBTx洗浄液を除去し、10%正常ヤギ血清（NGS）を含むPBTxを0.5 milliliters加えます。その後、緩やかに揺らしながら室温で1時間以上インキュベートします。次に、溶液を除去し、マウス抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体の1/5希釈液（10% NGSおよびPBTx含有）を0.2～0.5 mL添加します。胚を室温で緩やかに揺らしながら一晩インキュベートします。翌朝、抗体液を除去して廃棄し、2% NGSおよびPBTx 0.5 mLを用いて、緩やかに揺らしながら5分間ずつ3回洗浄します。室内の照明を暗くし、10% NGSおよびPBTxで500倍に希釈した蛍光標識二次抗体溶液を、各サンプルに500 microlitersずつ加えます。緩やかに揺らしながら、室温・暗所で4時間インキュベートします。インキュベーション後、胚を3回洗浄します。共免疫染色を行うには、抗phospho CaMKII抗体を20倍に希釈して加えます。緩やかに揺らしながら、暗所で一晩インキュベートします。翌朝、胚を2% NGSおよびPBTxで3回洗浄した後、赤色568蛍光標識ヤギ抗ウサギIgGを5倍に希釈したものと、10% NGSおよびPBTxを加えます。室温の暗所で4時間インキュベートした後、胚を3回洗浄し、イメージングの手順に応じてPBTxまたはPBS含有50%グリセロールに保存します。イメージング用に胚をマウントするには、1〜5個の胚をガラススライド上に配置します。魚の両側に1番のカバーガラス片を4枚ずつ積み重ねて配置し、チャンバーを作成します。その上にカバーガラスを載せます。100倍油浸レンズと透過光を用いて、単一の胚に焦点を合わせます。その後、照明を消します。適切なレーザーを点灯させて共焦点顕微鏡の電源を入れ、リモートフォーカスを有効にします。共焦点顕微鏡のプログラムを開き、取得バーで適切な対物レンズを選択します。次に、XY基本バーの1024ボタンをクリックして画像サイズを設定します。レーザーおよび検出器バーで、赤色の488および緑色の568のボックスをクリックして各チャネルのレーザー検出器をオンにし、ピンホールをmediumに設定します。次に、ゲインバーで、各チャネルのゲインを調整して可視化します。その後、取得設定バーでliveをクリックして、画像の取得を開始します。ビュー設定バーで、「force integral zoom」のチェックを外し、ライブウィンドウの中央に配置します。取得設定バーのZタブで、画像のレイヤーを順に確認します。画像に組み込むレイヤー数を選択した後、Z平面の中央の任意の点に移動してください。Zタブの下にある小さな赤い参照ボックスをクリックします。これにより、中心として選択した地点でRFAがゼロに設定されます。「step size」と表示されたボックスで、層の厚さを選択してください。ファイルサイズのボックスに注意し、ファイルサイズを1GB以内に抑えるようにしてください。画像の最上端を見つけるには、「top」の横にある円をクリックし、Zレイヤーを移動します。次に、「bottom」の横にある円をクリックすると、コンピューターが画像をセンターのレイヤーまで戻します。次に、取得設定ボックスで、再度「live」をクリックしてレーザー取得を停止します。このパネルにある、「average」および「Z stack」と表記された赤いボックスをクリックしてください。これらのボックスは緑色に変わります。［acquire settings］ボックスで［single］をクリックし、一連の画像をすべて取得します。両方のチャネルおよびZスタック全体のスキャンが進む様子を確認してください。保存するには、ボリュームウィンドウをクリックし、［save as］をクリックしてファイル名を指定します。Zスタックを開いたまま、データプルダウンメニューから「volume render」を選択して、ファイルをボリュームレンダリングします。レンダリングされたファイルを.tif形式で保存してください。この図は、ゼブラフィッシュのクップファー小胞（Kuppfer's vesicle; KV）における繊毛の標準的なマーカーである、P-CaMKIIおよびアセチル化チューブリンの免疫染色の結果を示しています。拍動する一次繊毛は液体の円状の流れを生成し、それがKVの内壁にある繊毛細胞内のカルシウム濃度の上昇と、ここに見られるような特定の部位でのCaMKIIの活性化を引き起こします。これらの図は、受精後24時間から72時間（HPF）における、腎周囲管の特定領域に並ぶ繊毛細胞の頂端面に現れるP-CaMKIIを示しています。発生1日目のゼブラフィッシュ胚の耳をPFAおよびメタノールで固定しても構造が保持されており、キノシリウムの基部および全長に沿ったCaMKII染色の検出が可能です。72 HPFにおいて、内耳をAlexa 488 phalloidinおよびAlexa 568標識抗アセチル化チューブリンで対比染色しました。PFAおよびメタノールによる固定では、F-actinとtubulinの両方が保存されました。この30 HPFの魚は膜標的型GFPを発現していましたが、これはメタノール固定によって消失します。PFAのみによる固定では、PFAとメタノールの併用固定と比較して、P-CaMKIIのシグナルが減衰しました。しかし、開発のこの段階では、メタノールを使用しなくても検出可能な十分に強い信号が得られます。この手法に習熟し、適切に実施すれば、2日間で完了させることができます。この手順を行う際は、新鮮な胚と新鮮なフリーエージェントを使用することが重要です。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚におけるリン酸化タンパク質の局在化方法について十分に理解することができます。

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

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ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

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マウス臓器に印加される高精度の亜鉛同位体測定

学ぶゼブラフィッシュ胚全体のリン酸化エピトープ免疫染色法。Danio rerioを用いて一次繊毛におけるタンパク質活性化の位置と動態を可視化し、発生生物学と細胞生物学の重要な課題を解明します。

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

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