ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚で活性化されるタンパク質を免疫局在化することです。この方法は、全胚におけるリン酸化タンパク質の局在化や活性化など、発生生物学および細胞生物学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、カルシウムによって活性化されたタンパク質を免疫染色することにより、全胚におけるカルシウム依存性シグナル伝達を局在化できることです。

テキストプロトコルに従って野生型またはトランスジェニック胚を取得した後、システム水中の胚に0.003%PTUを添加して色素沈着をブロックし、所望の発達段階までインキュベートします。胚が正しい段階に達したら、MESABを皿に追加して魚に麻酔をかけます。魚に麻酔をかけたら、できるだけ多くのシステム水を取り除き、新鮮な4%PFAとPBSを加えて、室温で3〜4時間インキュベートします。

インキュベーション後、PFAを除去し、100%メタノールを使用して置換します。次に、胚を摂氏マイナス20度で少なくとも48時間保存します。免疫染色を行うには、各実験条件で最低10個の胚を標識された1.5mmマイクロ遠心チューブに入れます。

胚がチューブの底に落ち着いたら、メタノールを取り出して廃棄し、PBTx中のエタノール濃度の低下を漸進的に洗浄して胚を再水和します。最後のPBTx洗浄液を取り出し、PBTxに0.5ミリリットルの10%正常ヤギ血清またはNGSを追加します。.その後、室温で少なくとも1時間、穏やかに振盪しながらインキュベートします。

次に、溶液を取り出し、1/5希釈のマウス抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体と10%NGSおよびPBTxを0.2〜0.5ミリリットル加えます。午前中に抗体を取り出して廃棄し、0.5ミリリットルの2%NGSとPBTxをそれぞれ5分間穏やかに揺さぶりながら3回の洗浄を行います。

頭上の照明を暗くし、10%NGSおよびPBTxで1/500に希釈した蛍光標識二次抗体の各サンプルに500マイクロリットルを加えます。暗所で室温で4時間、穏やかに揺さぶってインキュベートします。インキュベーション後、胚を3回洗います。

共免疫染色には、20分の1希釈の抗リン酸化CaMKII抗体を添加します。暗闇の中で静かに揺れながら一晩インキュベートします。翌朝、胚を2%NGSとPBTxで3回洗浄した後、赤568蛍光標識ヤギ抗ウサギIgGと10%NGSおよびPBTxの1/5希釈液を加えます。

室温で暗所で4時間インキュベートした後、胚を3回洗浄し、イメージング手順に応じてPBTxまたはPBS中の50%グリセロールに保存します。イメージング用に胚をマウントするには、スライドガラス上に1〜5個の胚を置きます。魚の両側に4つのナンバーワンスタックカバースリップフラグメントを使用して、チャンバーを作成します。

そして、その上にカバースリップを置きます。100倍油浸レンズと透過光により、1つの胚にピントを合わせます。ライトを消します。

適切なレーザーで共焦点顕微鏡の電源を入れ、リモートフォーカスを合わせます。共焦点プログラムを開き、取得バーで適切な対物レンズを選択します。次に、XY基本バーで、1024ボタンをクリックして画像サイズを設定します。

レーザーと検出器バーで、赤の488と緑の568ボックスをクリックして、各チャネルのレーザー検出器をオンにし、ピンホールを中に設定します。次に、ゲインバーで、各チャンネルのゲインを調整して視覚化します。次に、取得設定バーで、[ライブ]をクリックして画像の取得を開始します。

ビュー設定バーで、ライブ ウィンドウの中央に整数ズーム ボックスを強制するチェック ボックスのチェックを外します。[Z]タブの下の取得設定バーで、画像のレイヤーをステップスルーします。画像に組み込むレイヤーの数を選択したら、Z平面の中心のある点に移動します。

[Z] タブで、小さな赤い参照ボックスをクリックします。これにより、中心として選択したポイントでRFAがゼロになります。[ステップ サイズ] というラベルのボックスで、レイヤーの厚さを選択します。

ファイルサイズのボックスに注意を払い、ファイルを1ギガバイトに制限してみてください。画像の上端を見つけるには、上の横にある円をクリックして、Zレイヤー間を移動します。次に、下部の横にある円をクリックすると、コンピューターが画像をレイヤーの中心に戻します。

次に、取得設定ボックスで、もう一度ライブをクリックしてレーザー取得を停止します。このパネルで、「average」と「Z stack」というラベルの付いた赤いボックスをクリックします。これらのボックスは緑色に変わります。

取得設定ボックスで、単一をクリックして一連の画像全体を取得します。両方のチャネルとZスタック全体をスキャンする際の進行状況を監視します。保存するには、ボリュームウィンドウをクリックし、[名前を付けて保存]をクリックして、ファイルに名前を付けます。

ファイルをボリュームレンダリングするには、Zスタックがまだ開いている間に、データプルダウンメニューを選択し、ボリュームレンダリングをクリックします。レンダリングしたファイルをドットTIFファイルとして保存します。この図は、P-CaMKIIと、ゼブラフィッシュKuppferの小胞またはKVの繊毛の標準マーカーであるアセチル化チューブリンの免疫染色を示しています。一次繊毛を摂食すると、循環的な体液の流れが発生し、KVの内側を覆う繊毛細胞内のカルシウムが上昇し、ここで見られるように、個別の場所でCaMKIIが活性化されます。

これらの図は、受精後24時間から72時間後またはHPFの間に、腎周囲管の特定の領域を覆う繊毛細胞の頂端表面に現れるP-CaMKIIを示しています。発生の1日で、PFAとメタノールで固定されたゼブラフィッシュの胚の耳はその構造を保持し、基部およびキノシラムの長さに沿ったCaMKII染色の検出を可能にします。HPF が 72 の場合、内耳を Alexa 488 ファロイジンで対比染色し、抗アセチル化チューブリンを Alexa 568 で対比染色しました。

PFAメタノール固定では、F-アクチンとチューブリンの両方が保存されました。この30 HPF魚は、メタノール固定で失われる膜標的GFPを発現しました。PFA固定では、PFAとメタノールによる固定と比較して、P-CaMKIIシグナルが減少しました。

しかし、開発のこの段階では、シグナルはメタノールなしで検出できるほど強力です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。この手順を試みるときは、新鮮な胚と新鮮な遊離剤を使用することを忘れないでください。

このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚におけるリン酸化タンパク質の局在化方法について十分に理解できるはずです。