構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

この実験の全体的な目標は、全反射、構造化照明イメージング、または芝生シミュレーションによる取得後の画像相関分光法によって皮質アクチンのダイナミクスを定量化することです。この方法は、免疫学的シナプスでの相互作用の調節に皮質アクチンの流れがどのような役割を果たしているかなど、生物物理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ナノメートルスケールの分解能とライフスタイルの互換性を兼ね備えているため、従来のインスタンス顕微鏡技術と比較して、より小さなスケールのプロセスを観察および分析できることです。

この手法を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるGeorge Ashdownです。試験サンプルの場合は、直径100ナノメートルのサブ回折蛍光マイクロスフェアストック溶液を5マイクロリットルを、コーティングされていない新しいカバースリップの表面に加えます。次に、マイクロスフィア溶液をピペットチップでカバースリップに広げ、乾燥させます。

テストカバースリップに200マイクロリットルの封入剤を追加してイメージングを開始する準備をし、芝生SIMシステムのステージヒーター用のインキュベーターをオンにし、リザーバーを蒸留水で満たして発熱体のベースを完全に覆います。水を摂氏37度に平衡化させます。ヒーティングカラーを対物レンズに接続し、摂氏37度に設定します。

次に、芝4 88と互換性のあるグラデーションブロックを顕微鏡の光路に固定して、正しい光路がかみ合っていることを確認します。レーザーベッドのチャンネルモードをシングルポジションに切り替えます。顕微鏡ステージのファイバーケーブルに対してこの操作を繰り返します。

これらの手順を実行しないと、ソフトウェアウィンドウにエラーが表示されることが予想されます。モードを設定したら、対物レンズを最も低いZ平面に下げ、その上にオイルを一滴垂らします。蛍光マイクロスフィアと一緒にテストサンプルカバースリップを顕微鏡ステージに置きます。

次に、顕微鏡本体の完璧なフォーカスシステムまたはPFS機能を選択します。対物レンズをZ平面を徐々に上に動かし、PFSボタンの点滅が止まったら停止します。これは、制御ソフトウェアの焦点面に到達したことを示します。ライブビューに切り替えて、画面上のマイクロスフィアを画像化します。

PFSマイクロマニピュレーターホイールを使用してピントを微調整します。75ナノメートルの香り波より上に焦点が合っていない蛍光の入射なしで、均一な照明を観察します。最後に、T細胞刺激用の蛍光マイクロスフェアサンプルからの変動する照明パターンを観察することにより、構造化照明が達成されることを確認します。

200マイクロリットルの抗CD 3抗体と抗CD 28抗体混合物でスリップをしっかりと覆い、カバースリップを摂氏37度で2時間インキュベートします。テキストプロトコルに記載されているようにカバースリップを洗浄した後、顕微鏡ステージに置き、芝の焦点面を見つけます。次に、トランスフェクションしたT細胞200マイクロリットルをカバースリップ上のウェルの1つに静かにピペットで移します。

エピ蛍光を使用して、GFPアクチントランスフェクト細胞がカバースリップに着地するのを追跡します。セルが落ち着いたら、N SimPadを使用してライブモードに変更し、モニター上のセルに焦点が合っていることを確認します。タイムコースを記録するには、ND取得ウィンドウを開き、時間タブを選択します。

次に、[追加] をクリックし、間隔を遅延なしに設定します。期間を 10 分に設定します。最後に、ND取得ウィンドウで[今すぐ実行]を選択して、データの記録を開始します。

画像を再構築するには、まず、正しい解析モジュールを含む解析ソフトウェアを開きます。[アプリケーション]をクリックし、[終了シミュレーションの表示]ウィンドウを選択します。照明変調コントラストと高解像度ノイズ抑制を 1 に設定し、芝 SIM データ セットを再構築して、イメージ ステータス バーから完全な SIM イメージを生成します。

ピクセルサイズが30ナノメートルであることを確認してから、スティック分析用のTIFファイルとしてデータをエクスポートします。スティックMATLABソフトウェアパッケージをダウンロードして抽出した後、スクリプトを開きます。次に、不動除去フィルターのテキストプロトコルで説明されているように、入力パラメーターを定義します。

23 行目でフィルタリング パラメーターを移動平均に設定し、24 行目で移動平均パラメーターとして 21 を使用して 1 つのベクトル マップを生成します。31 行目の時間的部分領域を最大フレーム数 (この場合は 63) に設定します。次に、32 行目で、33 行目から 35 行目までで時間シフトを 1 に設定します。

出力ファイルの名前、出力ベクトルマップのタイトル、および出力ディレクトリパスを入力します。次に、ベクターマップ画像を保存する形式を定義します。この場合は png です。

MATLAB エディター ウィンドウで、スクリプトを開きます。1つのチャンネルスティックを実行し、スクリプトの1行目から23行目までを実行して画像シリーズをロードします。次に、ラン1チャンネルスティックのライン29から35を実行します。

スティック解析を開始するには、プロンプトに従ってポリゴンを選択し、必要に応じて関心領域または ROI を定義します。ベクトル マップを表示するには、38 行目から 52 行目を実行します。次に、53行目から72行目までを実行して、ここに示されている速度マグニチュードヒストグラムをプロットします。これは、ターフシムプロトコルでイメージングされたGFPを発現するOT T細胞です。

この細胞が免疫学的シナプスの形成を刺激することを目的とした抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングされたカバースリップに導入された5分後にテキストで説明されています。fアクチンの分子の流れを可視化するために、時間経過を経ました。その後、このスティックプログラムを用いてこれらのデータを解析した結果、シナプス周辺の一部を表す左の細胞の枠型領域に対応するこのベクトルマップで示されるFアクチン分子流の定量化が可能になりました。

このマップとT細胞サブ領域をさらに拡大すると、ベクトルの長さから決定できるアクチンの流れの方向性と速度が明確になり、色分けされた速度データをヒストグラムにプロットして統計分析を行うこともできます。まとめると、これらの結果は、免疫学的シナプスにおいてFアクチンが末梢から細胞中心に向かって対称的に流れることを示しています。このビデオを見れば、データからtsを取得し、画像相関分光法を使用して皮質アクチンダイナミクスを解析する方法についてよく理解できるはずです。

この方法は、T細胞遊走中のアクチンの流れに関する洞察を得るために使用できますが、細胞遊走を行うなど、分子の流れが重要であると考えられる他のシステムでも使用できます。