Name: 単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぶ単核レベルでのLINE-1レトロ転位の可視化と解析法。FISHを用いてHepG2細胞におけるレトロ転位率とパターンを正確に評価する手法を解説。ゲノム安定性の理解に貢献します。

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この作業は、国立環境衛生科学研究所（ES014443およびES017274）およびアストラゼネカからのKSRへの助成金によって部分的に支援されました。

注：特に指定のない限り、すべてのステップは室温で実施されるべきです。個々の試薬を準備する方法の詳細については、試薬のセクションを参照してください。 1.ラベリングL1プローブ注：プローブは、化学的またはPCRの標識によって標識することができます。 <ol><li> 化学的標識 <ol><li>臭化エチジウム（0.5μgの/ ml）を追加し溶融するまで、電子レンジでトリス - 酢酸-EDTA（TAE）バッファー、暑さの中で0.7から1パーセントアガロースゲルを作成したゲルを冷却することを可能にする、と。ゲルトレイに注ぎ、コームを追加し、ゲルは室温で固化することができます。 </li><li>製造者のプロトコルに従って、37℃で1時間Cy3またはFITCでSNeoプローブ（1-2μgのを）ラベルを付けます。 注：SNeo Sは ネオマイシン遺伝子は、レトロ転位の完全なサイクル後に発現pliced ​​意味します。プローブのサイズは〜千塩基対です。 SNeoは、任意のベクターから、またはGENOMからPCR増幅することができますIC DNA。ストレプトアビジンCY3 / FITC標識試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 </li><li>各ウェルに1×DNAローディング緩衝液、負荷とラベルされたSNeoプローブ溶液を混合し、15〜20分間75-100ボルトで実行します。 </li><li>ウルトラバイオレット（UV）照明装置を用いたプローブバンドを可視化します。 SNeoプローブの大きさを調整し、ロック核酸（LNA）も（ 図2）を加えることができることができることに留意されたいです。 </li><li>きれいな刃でゲルからSNeoの標識プローブの切断は、製造業者のプロトコルに従ってPCRクリーンアップキットを用いてゲルからSNeoプローブを可溶化し、精製します。 注意：カバー保護シールド（ すなわち、実験室のコートとUVクリアなフェイスマスク）との体のあらゆる露出部分のゲルを表示して切断。 PCR産物を精製したゲルへの情報のための材料および試薬の表を参照してください。 </li><li>再実行SNeoの5μlを0.7％アガロースゲル上の未標識SNeoプローブで標識プローブコンする（1.1.1を参照）企業規模の増大や信号強度の損失（ 図2）。 </li><li> 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈分注して-20℃で保管。 </li></ol></li><li> PCRラベリング（プローブ標識のための代替方法） <ol><li>単一のチューブにPCR試薬とSNeo特異的プライマー（5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;および5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;）を組み合わせる：13.6μlのヌクレアーゼフリーのH 2 O; 0.1μlののdATP、dCTPを、dGTPを（10 nM）を、 0.05μlのdTTPの（10 nM）を、 0.05μlのdUTPをビオチン/ dUTPを-FITC / CY3（10 nM）を、 4μlのバッファ5倍タグを移動します。 0.4μlのタグポリメラーゼを行きます。 1μlのSNeoテンプレート（10 NG）。 PCR試薬の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 </li><li>サンプルの総数を乗じて各試薬の量を調整します。 </li><li>以下のPCRサイクルパラメータを使用しますsが増幅し、ラベルSNeoプローブする：2分、95℃; 30秒、30秒、62℃、60秒間72℃、95℃の35サイクル; 2分間72°C;無期限に4℃で保持します。 注：アニーリング温度を調整することができるか、勾配PCRは、他のプローブのための最適なアニーリング温度を決定するために完成させることができます。 </li><li>セクション1.1.1、負荷のように0.7から1パーセントゲルを作成し、セクション1.1.4のようにプローブのバンドを可視化します。 </li><li>セクション1.1.5のようにラベルされたSNeoプローブをカットし、精製します。 </li><li> SNeoの再ラン5μlを（ 図2を参照）信号強度の大きさが増加し、損失を確認するために、未標識SNeoプローブで標識プローブ。 </li><li> 260nmの吸光度を測定することにより、標識SNeoプローブの量を定量し、ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に10ng /μlのアリコートにSNeoプローブを希釈</li></ol></li></ol> 2.準備染色体スプレッド<ol><li>ベクター骨格を発現する安定なクローンを生成します（制御L）または標準的な選択方法を使用してレトロ転位コンピL1。12,16非エピソームレポーターは、転写の研究で結果を関連付けるために使用されたが、エピソームベクターを使用することもできます。安定的に制御またはL1ベクトル完全増殖培地中で（必要に応じて作られたプレートサイズの調整と10cmプレートあたり1×10 6個の細胞を、）を発現する細胞を増殖させます。 HepG2細胞は、RPMI-1600、10％FBSおよびハイグロマイシン200μg/ mlのを使用します。 37℃で70％コンフルエンスに培養を成長させ、5％のCO 2。 注：成長培地の選択は、細胞型に依存します。ここで使用されるプラスミドは、ハイグロマイシンおよびネオマイシン両方の選択カセットを運ぶことを指定された、クローンの安定した選択はまた、ハイグロマイシンでの選択の後にネオマイシンを用いて行うことができるが、ネオマイシンの量は、各細胞型のための許容レベルを確立するために最適化する必要があります。 </li><li>培養培地にコルセミド（0.4μgの/ ml）を追加し、metaphで細胞を停止させるために90分間インキュベートASE。異なる種類の細胞を使用している場合は、経験的に最適な中期停止のためのコルセミドと露光時（60、90、および120分）の最適濃度を決定します。 </li><li>洗浄細胞は、細胞に0.25％トリプシン溶液を3-5 mlで添加することによりトリプシン処理し、細胞を分離するために5分間インキュベートし、1×ダルベッコPBS（DPBS）10mlで2倍。 10％FBSを含む培地の等量とトリプシンを不活性化します。 </li><li> 4℃、1,000×gで2分間遠心分離細胞は、細胞ペレットから培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄します。細胞を再懸濁するためにDPBSの200μLを残して吸引し、すべてのDPBS、。確認した細胞を十分に混合され、すべての塊が分散していること。ミックスと塊を分散し、ボルテックスを回避するために、ちらつきや穏やかなピペッティングを使用してください。 </li><li>低張溶液5mlを加える（ すなわち、75 mMの塩化カリウム）で水平15mlチューブを回転させながら37℃滴下する前に温め、20分間37℃でインキュベートします。材料とReagenの表を参照してください。取得し、低張液を作成する方法の詳細については、TS。 </li><li>各洗浄後の細胞を再懸濁するために低張液の約200μLを残して2.5 3X - 5 4℃で分間繰り返し、120×gで遠心分離した細胞は、2.4を繰り返します。 3回の洗浄の最後に、ペレットは目に見えて白と腫れであることを確認してください。 </li><li>カルノア固定液溶液200μlでペレットを再懸濁し、1にする：2、1：4、1：8を、カルノア固定液溶液中で1：16の希釈。上記の約1cmからドライクリーンスライド上に各希釈液10μlを削除し、すぐに30秒を沸騰水から熱い蒸気に広がりのない側を露出させます。カルノア固定剤溶液を作成する方法については、材料および試薬の表を参照してください。 </li><li> 、室温でスプレッドを乾燥コプリンジャーで15-20分間の浸漬によっては0.1μg/ mlのヘキスト33342で染色し、DPBSで3回洗浄します。ヘキスト33342溶液を作製する方法については、材料および試薬の表を参照してください。 </li> &lt;李&gt;表示は40倍の倍率で蛍光/位相差顕微鏡に広がります。スプレッドの準備を最適化した後、スプレッドはヘキスト33342で染色する必要はありません 。ビューは、結果セクションで概説されるように広がり、品質と分離を決定するために10倍の倍率で位相差顕微鏡に広がる（ 図3を参照）。 </li><li>スライド（ すなわち、広がりのない側）とは反対側のダイヤモンドポイントマーカーとの良好なスプレッドを選択し、円。 </li><li>ストアは月まで-20℃で広がります。湿気への暴露を避けます。 </li></ol> in situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光<ol><li> スプレッドを安定化し、脱水 注：-20℃で保存した場合に平衡化中期染色体を室温に広がります。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 <ol><li>中期染色体が200μlのRNase Aで広がるインキュベート37℃で1時間。 </li><li>洗浄は、それぞれ10mMのHCl溶液ですすぎ、続いて5分間二回2×SSC、バッファにスライド。 </li><li>脱イオンH 2 Oで洗浄し、5分間ずつ2回-SSC緩衝液で2回洗浄し、37℃で10分間、1％ペプシンでスプレッドをインキュベートします。 </li><li> 10分間、4％パラホルムアルデヒドでスプレッドをインキュベートし、5分間ずつ二回2×SSC緩衝液で洗います。 </li><li> 70％、80％、および95％エタノール：エタノールシリーズ中で2分間インキュベートすることによって広がる脱水。 </li><li>空気乾燥スライド。 </li></ol></li><li> ハイブリダイゼーションは、L1標識レトロ転位プローブ（ すなわち、SNeo）とスプレッド 注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。試薬を入手して作成する方法の詳細については、材料および試薬の表を参照してください。 <ol><li> 10分間の72℃でのハイブリダイゼーション緩衝液にSNeo 30ngの、熱を加え、室温で2分間のクール。 </li><li>電子にSNeoプローブ溶液の30μlのを追加ACHスプレッドは、カバーガラスで覆い、ゴムセメントでエッジを封印します。全く泡の形成を確認していません。 </li><li>徐々に37℃まで温度をドロップし、37℃で暗所の加湿チャンバー内で一晩インキュベートし、ヒートブロック上で5分間、72℃でスライドを加熱します。 </li></ol></li><li> 洗濯と表示（または二次抗体の添加） 注意：直接標識プローブの場合は、すべての回で光から遠ざけます。 注：準備する方法については、材料および試薬の表を参照してください。染色体全体の広がりをカバーするのに十分な量の使用が推奨されます。カバーガラスを添加した場合、過剰なボリュームが失われることに注意してください。 <ol><li>カバースリップを削除するには、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。 </li><li>洗浄は5分間、45℃で2×SSC、バッファー中に浸漬することによりスライド。 </li><li> 5分間、2×45℃で洗浄緩衝液に浸漬することによってスライドを洗浄します。 </li><li>洗浄は、10分間、45℃で0.1×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。 </li><li>洗浄は、10分間、45℃で2×SSC緩衝液中に浸漬することによりスライド。 注：場所水浴中で推奨される緩衝液を含むコプリンジャーは、45℃に温度を調整します。 </li><li>室温にスライドを冷却し、検出緩衝液でスライドを平衡化します。 </li><li>直接標識プローブの場合は、3.4.10に進みます。 </li><li>間接的な標識プローブの場合は、20〜30分間、およびブロッキング緩衝液中のブロックは、DPBSで3回洗います。 </li><li> 1時間ブロッキング緩衝液（ 例えば 、5μg/ mlのストレプトアビジン-FITC、またはαCY3）二次抗体を50μlとインキュベートします。 </li><li>洗浄は回5分間、2×SSC中でスライド。 </li><li> 10分間ヘキスト33342溶液（0.1μgの/ ml）で対比染色。 注：この染色はプローブとの共局在化のための染色体を染色するために行われます。 </li><li> DPBS 3倍に洗って、マウンティング培地のドロップを追加し、カバースリップを置き、マニキュアとエッジを封印。 </li><li> 40Xミリアンペアで蛍光顕微鏡を用いて、L1のレトロ転位を分析gnification。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、潜在的な競合する利益を宣言しません。

このような全ゲノムシーケンシング、逆PCRおよびサザンブロッティングなどの方法論は、L1のレトロ転位を研究するために使用されてきました。これらの方法論は、L1の挿入がゲノム内で発生する場所位置で非常に貴重であるが、それらのすべてのための交絡課題は、シーケンスを再構成するためのインシリコプログラミングの必要性があります。ここで説明するFISH法は、特に培養細胞における異所性のL1レトロ転位の分析を必要とする研究の場合には、これらの方法を補完するように設計されています。アプローチは、レトロ転位事象の定量的および定性的評価の両方のために使用し、核を間期に適用することができます。この方法は、異所性L1挿入部位16を決定するために用いられる後続のインシリコ配列アラインメント方法の精度を誇ります。反復配列のアラインメントは、反復sequenながら、によるホモポリマーの形成にあいまいにすることができますCESは、反復配列の過少に結果のテンプレートのプライマー増幅の間に失われる可能性があります。 FISHプローブはホモポリマ...

人間の長い散在要素-1（ ライン1またはL1）は 、「コピー＆ペースト」レトロ転位機構を介してゲノム内を伝播する自律移動要素です。典型的なヒトL1は 〜6キロバイトの長さであり、プロモーターとして機能5&#39;UTR（非翻訳領域）で構成され、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）：L1 -ORF1とL1 -ORF2、およびポリAとの3&#39;UTR 。コイルコイルドメイン、RNA認識モチーフとC末端ドメイン、L1 -ORF2タンパク質はエンドヌクレアーゼを持っていながら、転写酵素およびシステインリッチドメイン1,2,3,4,5リバース ：尾L1 -ORF1タンパク質は、3つの異なるドメインを持っています。 L1 -ORF2はレトロ転位1,2,6-に必要な両方のタンパク質と、酵素活性を提供しつつ、L1 -ORF1は、核酸シャペロン活性を示します。 L1のレトロ転位のサイクルは、L1の5&#39;UTRからの転写で始まります</RNAポリメラーゼII、細胞質への転座、および翻訳によってem&gt;の二シストロン性mRNAを。細胞質では、L1 -ORF1展示どちらかそれは独自のRNAまたはそれがL1 -ORF2p 7とリボ核タンパク質粒子（RNP）を形成するために他のRNA（ すなわち、SINE / SVAS /偽）をパッケージ化し、トランス -結合をパッケージ化シス -結合、 8。 RNPはOHを露出させるために、L1 -ORF2pニックのエンドヌクレアーゼ活性ゲノムDNA（gDNAを）核内に移行-グループ9、それが素数に逆転写酵素によって使用される順番で、3 &#39;末端からDNAにRNAを合成する逆。逆合成の間、DNAの第二鎖は、署名のL1挿入配列（ 例えば 、TTTTAA）と呼ばれる標的部位の重複（TSD）9,10を形成するために充填されている互い違いの休憩を作成するために、オリジナルのニック部位7から20塩基対をニックが入っています。このプロセスは、ターゲットプライム逆転写（TPRT）として知られており、insertiにつながります挿入配列の両端にTSDSとL1 /他のDNAの完全または切断型コピーの上。L1のレトロ転位はまた、いくつかの細胞型11にTPRT状の非相同末端結合を介して媒介されることが示されています。 私たちの研究で採用さL1のレトロ転位ベクターは、非エピソームであるとタグ付けされたL1 -ORF1＆2P組み合わせたCMV-L1-5&#39;UTRプロモーターによって駆動される（ 図1）12から構成されています。この構築物の以前のバージョンでは、酵母とヒトの細胞培養物13,14,15を用いた研究に記載されています。スプライシングおよび統合後ネオマイシンの発現を駆動するために逆方向に配置された3 &#39;末端を有する、ベクターの5&#39;および3 &#39;末端に位置する2つの別個のCMVプロモーター。 3 &#39;末端のレトロトランスポジションインジケーターカセットは、L1 -ORFsにネオマイシン遺伝子挿入アンチセンスで構成され、グロブによって半分に分離することによって不活性化さスプライスドナー（SD）およびスプライスさアクセプター（SA）部位（ 図1）とイントロンインチ染色体への組み込みの際に、L1はシストロン性mRNAおよび非アクティブネオマイシンのmRNAから構成されてmRNAを生成するために、共通のプロモーターから転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンは完全に機能するネオマイシン遺伝子を復元するために、ネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ハイブリッドmRNAはシスでRNPにパッケージ化し、それがTPRTを使用して、完全長または切断のいずれかの挿入などゲノムに組み込まれている核内に移行されます。 ここでは、単一の核レベルでのL1 -retrotransposiitionパターンと挿入率を追跡するために、具体的スプライシングされたネオマイシン遺伝子（SNeo）に向けプローブを用いたin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光を使用する方法について説明します。検出の効率と特異性は、DETにレトロ転位有能と無能な構築物およびプローブを用いて確認しました電気ショック療法SNeoまたはネオマイシンおよびイントロン接合部16をグロビン。この方法論は、このような複数の挿入、コロニー抵抗、良好なクローンの拡大などの細胞培養ベースのレトロ転位アッセイの欠点のいくつかを占めます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Labeling Probes</td></tr><tr><td>Go Tag DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x 無色バッファー</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>dATP、dGTP、dCTPの濃度を2に調整します。mMとdTTPを1.5&nbsp;mMはヌクレアーゼフリー水に溶解しています。</td></tr><tr><td>dUTP-16-ビオチン (0.5&nbsp;mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&nbsp;mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&nbsp;mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISHラベリングキット</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISHラベリングキット</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>NucleoSpin PCRクリーンアップキット</td>PCR</tr><tr><td>マシン</td><td></td><td></td>の代わりに任意のPCRクリーン試薬を使用することができます 任意の<td>サーモサイクラーマシンを使用して、ラベル製品を増幅することができます。</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>シグマ</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">染色体の準備 Spreads</td></tr><tr><td>colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>コルセミドを成長培地に直接添加し、最終濃度を0.4&nbspにします。&マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp;M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>希釈 1&nbsp;M KClの解から75&nbsp;低張液を作るためのmM溶液</td></tr><tr><td>カルノイ固定液</td><td></td><td></td><td>3容量のメタノールと1容量の酢酸を混ぜて、カーノイ固定液を作ります。毎回新鮮に作る。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Hoechst-33342をPBSに溶解し、最終濃度1&nbsp;mg/mLです。</td></tr><tr><td>ダイヤモンドポイントマーカー</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>つや消しスライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>細胞をデテックするには、細胞をトリプシンで5分間インキュベートし、等量の完全な培地で不活性にします。</td></tr><tr><td>カバースライド</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td></td><td></td><td>この目的には、任意のヒートブロックを使用できますが、スライドの加熱用に取り付けられたブロックをお勧めします。</td></tr><tr><td>ビーカー(600&nbsp;ml)</td><td>シグマ</td><td>CLS1003600</td><td>ビーカーに水を入れ、加熱して沸騰させ、高温の蒸気を使用して染色体を破裂させます。</td></tr><tr><td>ニコン顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>125690</td><td>どの顕微鏡でもスプレッド品質を見ることができます。</td></tr><tr><td colspan="4"> FISH</td></tr><tr><td>三ナトリウムクエン酸</td><td>シグマ</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>クロライドナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S3014</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアミド</td><td>シグマ</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td>シ<td>グマ</td><td>F1379</td><td></td></tr>デ<tr><td>トラン硫酸シ</td><td>グマ</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>シグマの試薬と材料</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子DNA</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Σ</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Σ</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td></td><td>Σ 459844</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Σ</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Hoechst-33342をPBSに溶解し、最終濃度1&nbsp;mg/mLです。</td></tr><tr><td>ラバーセメント/サイトボンドシーラント&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Seven Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>ダーク加湿チャンバー</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>カバースライド</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>ドライデジタルヒートブロック</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x 生理食塩水-クエン酸ナトリウム (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>175 gのNaClと88.2&nbsp;gの分子グレードのH2Oの800mlのクエン酸三ナトリウムをpH 7に調整しながら攪拌します。すべての塩が溶解したら、容量を1 Lに調整し、0.22&microでろ過します。m濾紙。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>1&nbsp;Rnase A</td><td></td><td></td>のmg / ml<td>は、20x SSCバッファーを2x SSCバッファーに希釈します。RNase Aを2x SSCバッファーに溶解し、最終濃度1&nbsp;mg/mLです。毎回新鮮な解決策を作ります。</td></tr><tr><td>1%ペプシン</td><td></td><td></td><td>ペプシン(W / V)を10 mM HClに溶解し、最終濃度1%溶液にします。毎回新鮮に作ってください。</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>ドラフト内で PFA 4.0 g を秤量し、1xPBS 50 ml を加え、60&nbsp;&deg;Cを攪拌しながら、すべてのPFAが溶解して溶液が透明になるまで、NaOHの滴でpHを調整します。音量を100&nbspに調整します。ml、0.22 &micro でろ過します。m濾紙と5mlのアリコートを-20&nbspで保存します。&deg;C. 37 &deg;その後の使用のために10〜15分間C。パラホルムアルデヒドの量に応じてフィルターサイズを調整します。</td></tr><tr><td>ウォッシュバッファー</td><td></td><td></td><td>100 ml のホルムアミド (20%) と 2.5 ml の 20x SSC を組み合わせ、1.0 M HCl で pH 7 に調整し、分子グレードの H2O で容量を 500 ml にします。</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファー</td><td></td><td></td><td>50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸塩、0.1%SDS、および300 ng/mlのサケ精子DNAを2x SSCバッファーに組み合わせます。ホルムアミドの量は、染色分体の焦点がどの程度であるかを決定します。量を滴定します。</td></tr><tr><td>検出バッファー</td><td></td><td></td><td>20x SSCバッファーを4倍に希釈し、0.2% Tween-20を加えて検出バッファーを作成します。</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td></td><td></td><td>5%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.2%Tween-20を4x SSCバッファーに組み合わせます。</td></tr><tr><td>脱水液</td><td></td><td></td><td>70%、80%、95%のエタノール溶液を作ります。</td></tr></tbody></table>

単核レベルでのline-1レトロ転位の分析

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

長い散在する核要素-1(Line-1またはL1)は、ヒトゲノムに存在するDNAの約17%を占めています。L1sの大部分は5'切り捨てのために不活性ですが、これらの要素のうち~80-100はレトロトランスポジションコンピテントを維持し、RNA中間体を介してゲノム全体の異なる場所に伝播します。古いL1はゲノムのATリッチ領域を標的とすると考えられていますが、より新しく、より活性なL1の染色体標的は、まだ十分に定義されていません。ここでは、L1挿入のパターンと異所性L1の取り込み速度を単一核レベルで追跡するために使用できる蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法について説明します。これらの実験では、フルオレセインイソチオシアネート/シアニン-3(FITC/CY3)標識ネオマイシンプローブを使用して、異所性L1を安定して発現するHepG2細胞のL1レトロトランスポジションをin vitroで追跡しました。この方法論は、毒性によって引き起こされる逆転位率の推定におけるエラーを防ぎ、単一の核への複数の挿入の発生を説明します。

L1のレトロ転位ベクターの模式図を図1に示されている。ベクターは、センス配向でグロビンイントロンによって中断され、SDおよびSA部位により挟まれているL1のORFに対してアンチセンス配向のネオマイシン遺伝子から成ります。安定して染色体に組み込まれた場合、L1 mRNAが組み合わさCMVおよびL1-5&#39;UTRプロモーター（ 図1）から転写されます。 RNAプロセシングの間に、グロビンイントロンはネオマイシン遺伝子の外にスプライスされます。ネオL1 RNAは、パッケージ化された転座および全長又は切断挿入のいずれかとしてゲノムに組み込まれます。示されるように、L1のレトロ転位は、スプライスネオマイシン（ 図1）に特異的なプローブを用いてFISHによって追跡することができます。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

ここでは、安定的に合成LINE-1を発現したHepG2細胞株の染色体スプレッドの単核レベルでのLINE-1レトロ転位を追跡するためにFISH法を採用しています。

単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

この手順の全体的な目的は、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いて、単一核レベルでL-1レトロトランスポゼーションの速度とパターンを可視化および解析することです。この手法の主な利点は、レトロトランスポゼーションの速度やパターンの過大評価または過小評価を回避できる点にあり、他の手法と組み合わせることで、単一核レベルでのL-1レトロトランスポゼーションの研究が可能になります。本手順のデモンストレーションを行うのは、研究室のシニアフェローであるPasano Bojang博士です。まず、テキストのプロトコルに従ってTAEバッファーで0.7%から1%のアガロースゲルを調製した後、メーカーのプロトコルに従ってCY3またはFITCを用いてSNeoプローブを標識し、37 °Cで1時間インキュベートします。標識したSNeoプローブ溶液を1X DNAローディングバッファーと混合し、アガロースゲルのウェルにロードします。その後、75から100 Vで15から20分間電気泳動を行います。UVイルミネーターを用いて、プローブのバンドを可視化します。次に、清潔なブレードを使用して、ラベル付きのSNeoプローブをゲルから切り出します。その後、メーカーのプロトコルに従ってPCR精製キットを使用し、SNeoプローブを可溶化および精製します。精製後、SNeo標識プローブ5 µLと未標識SNeoプローブを0.7%アガロースゲルで再度電気泳動し、サイズの増加と信号強度の低下を確認します。標識SNeoプローブの量を定量するために、260 nmでの吸光度を測定し、ヌクレアーゼフリー水を用いてSNeoプローブを10 ng/µLの分注量に希釈します。分注したサンプルは-20 °Cで保存してください。レトロトランスポジション能を持つL-1またはベクターバックボーンを発現する安定クローンを構築した後、コントロールまたはL-1ベクターを安定的に発現するHepG2細胞を培養します。培地に0.4 micrograms per milliliterのcolcemidを添加し、90分間インキュベートして細胞を中期で停止させます。1X Dulbecco's PBS（またはDPBS）を10 milliliters使用し、細胞を2回洗浄します。次に、0.25%trypsin溶液を加え、5分間インキュベートします。その後、trypsinを不活化させるために10%FBSを含む培地を添加しました。次に、細胞を15 milliliterチューブに移し、1,000 Gs、4 °Cで2分間遠心分離します。その後、細胞ペレットから培地を吸引し、DPBSを用いて細胞を洗浄します。DPBSを200 microliters残してすべて吸引し、チューブを軽く叩くか、緩やかにピペッティングすることで細胞を再懸濁し、細胞が十分に混合され、凝集塊がない状態にします。チューブを水平に回転させながら、あらかじめ加温した低張液を5 mL滴下し、37 °Cで20分間インキュベートします。細胞を120 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。その後、低張液を200 µL残してすべて除去します。固定液で3回洗浄し、洗浄の間には細胞内に約200 µLの固定液を残します。3回の洗浄後、ペレットが目視で白く膨潤していることを確認してください。次に、200 µLのCarnoy固定液を用いてペレットを再懸濁し、この固定液を用いて再懸濁した細胞の以下の希釈系列を作成します。各希釈液10 µLを、清潔で乾燥したスライドガラス上の約1 cm上の高さから滴下し、すぐにスライドの塗抹していない面を沸騰したお湯の高温蒸気に30秒間さらします。塗抹した試料を室温で乾燥させた後、DAPI含有封入剤で染色し、カバーガラスを被せます。インキュベーション後、DPBSを用いてスライドを3回洗浄します。展展標本を観察するには、蛍光コントラスト顕微鏡を使用し、40倍の倍率で観察してください。展展標本の作製が最適化されていれば、染色は不要です。良好な標本には、スライドの反対側にダイヤモンドポイントマーカーで印を付けてください。メタフェーズ染色体展開図を安定化させ脱水させるため、サンプルに 200 µL の RNase A を加え、37 °C で 1 時間インキュベートします。2X SSC を用いてスライドを 5 分間ずつ 2 回洗浄し、10 mM HCl でサンプルをリンスします。その後、展開図に 1% pepsin を加え、37 °C で 10 分間インキュベートします。脱イオン水でスライドをすすいだ後、2X SSCを用いてサンプルを5分間ずつ2回洗浄します。次に、プレパラートに4%パラホルムアルデヒドを加え、10分間インキュベートし、その後さらに2回、2X SSCバッファーで洗浄します。SSC洗浄後、以下のエタノール系列を用いてサンプルをそれぞれ2分間インキュベートし、プレパラートを脱水します。30 nanogramsのSNeoをハイブリダイゼーション緩衝液に加え、72 °Cで10分間加熱した後、室温で2分間冷却します。次に、各スプレッドに30 µLのSNeoプローブをピペットで滴下し、カバーガラスでサンプルを覆います。ゴムセメントを用いて縁を密封し、気泡が生じないようにしてください。スライドをヒートブロックで72 °C、5分間保持します。その後、温度を37 °Cまで徐々に下げます。37 °Cの加湿チャンバー内で、暗所に一晩インキュベートします。二次抗体を適用するには、まずスライドを2X SSCバッファーに浸し、カバーガラスを取り除きます。次に、スライドを45 °Cの2X SSCに5分間浸して洗浄し、その後サンプルを洗浄バッファーに移し、45 °Cで5分間の洗浄を2回行います。続いて、スライドを45 °Cの0.1X SSCバッファーに10分間浸します。次に、スライドを45°Cの2X SSCバッファーで10分間洗浄します。スライドを室温まで冷却した後、直接標識プローブを使用している場合は、2X SSCを用いて5分間ずつ2回スライドを洗浄します。検出バッファー中で室温で10分間平衡化させます。その後、DAPI含有封入剤を加えて、サンプルを10分間対比染色します。カバーガラスを載せ、マニキュアを用いて端を封印します。最後に、蛍光顕微鏡を用いて40倍の倍率でL-1レトロトランスポジションを解析します。ここで示すように、希釈系列を調製し、各スプレッドの密度、分布、および核からの距離を評価することで、中期染色体スプレッドの密度を決定しました。その後の解析には、均一に分散した低密度のスプレッドが選択されました。これらの画像は、Hoechst染料DAPIで染色された染色体スプレッドを示しており、スプレッドの品質は、染色体の長さ、スプレッドの円形度、および染色体間の距離に基づいて評価されました。細胞を低張液で短時間しかインキュベートしなかった場合、染色体スプレッドが密に絡まり、個々の染色体を視覚化することが困難になりました。しかしながら、低張液でのインキュベーション時間が長くなると、核の破裂、染色体の飛散、および/または染色体の消失が認められました。コルセミドでのインキュベーション時間を長くすると、中期にある細胞数は増加しましたが、染色体の凝縮が引き起こされました。本動画で示す通り、コルセミドでの90分間のインキュベーション、37 °Cの低張液での20分間の処理、および細胞を破裂させるための高温蒸気の使用が、高品質なスプレッドを作製するための最適条件であることが分かりました。本実験では、SNeoを標的とするプローブを用いて、染色体スプレッドにおけるL-1レトロトランスポジションの染色は行いました。プローブにはFITCとCY3の両方でラベル付けを行い、どちらの場合においても、L-1レトロトランスポジションが野生型L-1を発現している細胞でのみ観察されることを示しました。習熟すれば、特にハイブリダイゼーション時間を2〜4時間に短縮し、適切に技術を実施することで、本実験は実際には6〜8時間で完了させることができます。本技術を実施する際は、コンタミネーションを防ぐために、十分に洗浄し、ハイブリダイゼーション時間を最適化し、dNTPプローブを化学的にラベル化することが重要です。挿入部位の染色体上の位置などの追加的な疑問を解決するためには、L-1シーケンシングやGバンド分染法などの追加技術を併用することができます。このビデオを視聴することで、L-1プローブのラベル化方法、染色体展開の実施方法、および蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）技術を用いたL-1レトロトランスポゾンのパターンと頻度の測定方法について十分に理解することができます。本技術は、L-1レトロトランスポジションのパターンおよびL-1挿入部位の研究への道を切り開きました。毒性物質、生物学的試薬、および紫外線を取り扱う際は、手袋や保護具の着用などの予防措置が不可欠であることを忘れないでください。

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