のトランスクリプトームプロファイリング生体内で産ウシ着床前の胚

このビデオの全体的な目標は、7日目のウシ胚から採取した総RNAを少量使用した2色のカスタムメイドウシアレイを使用して、最適化された技術手順を提供することです。この方法は、高生産性乳牛の胚喪失に関する重要な疑問や、着床前の発生中の胚の遺伝子発現に対する胚の品質に関する疑問に答えるのに役立ちます。この手法の利点は、単一胚から抽出した全RNAのピコグラムレベルを用いて遺伝子発現を研究できることです。

この方法は、in vivoで作製したウシの着床前胚の生存に影響を与える要因についての洞察を得ることができます。これは、in vitro胚産生などの生殖技術の向上にも役立ちます。手順を開始するには、カラムベースのピコスケールRNA抽出キットから、マイクロ遠心チューブでスナップ凍結ウシ胚を調製します。

10マイクロリットルの溶解緩衝液をチューブに加え、胚を摂氏42度で30分間インキュベートします。次に、G.Pipette 250マイクロリットルのコンディショニングバッファーを精製カラムフィルターメンブレンに800倍でチューブを2分間遠心分離し、室温で5分間カラムをインキュベートします。コレクションチューブを 16 、 000 倍の G で 1 分間遠心分離し、カラムのプレコンディショニングを終了します。

溶解緩衝液と胚の混合物に10マイクロリットルの70%エタノールを加え、よく混合します。次に、混合物を精製カラムにロードします。カラムをGの100倍で2分間遠心分離し、次にGの16,000倍で30秒間遠心分離します。

最初の洗浄バッファー100マイクロリットルをカラムに加え、Gの8,000倍で1分間遠心分離します。DNaseキットを使用して、5マイクロリットルのストック溶液と35マイクロリットルのバッファーを混合し、閉じたチューブを静かに反転させて混合します。次に、DNase混合物を精製カラムメンブレンにロードし、室温で15分間インキュベートします。

最初の洗浄バッファーの40マイクロリットルをカラムに加え、Gの8, 000倍で15秒間遠心分離します。次に、100マイクロリットルの2番目の洗浄バッファーを追加し、1分間遠心分離します。第2の洗浄緩衝液の別の部分をカラムに加え、16, 000倍G.Transferで2分間遠心分離し、精製カラムを別の微量遠心チューブに移し、11マイクロリットルの溶出緩衝液をカラムメンブレンにロードします。

カラムを室温で1分間インキュベートします。1, 000倍Gで1分間、次に16, 000倍Gでさらに1分間カラムを遠心分離し、溶出したRNAの品質と量を確認し、サンプルをマイナス80°Cで保存します。増幅キットを使用して、100ピコグラムの高品質RNAを増幅します。

増幅された aRNA のサイズ範囲を蛍光ベースの定量で評価します。次に、分光光度法によりaRNAの濃度を決定します。標準キットで蛍光標識するために、増幅されたaRNAを2マイクログラム調製します。

暗室にオゾンボックスを設置し、オゾンレベルが0.001ppmに減少するまで待ちます。光の上に暗室フィルターを置きます。次に、サンプルをオゾンボックスに持ち込み、シアニン5色素と標識緩衝液をそれぞれ2マイクロリットル加えます。

サンプルを安全な光の下で、RNaseフリーの水を加えて、総容量を20マイクロリットルにします。サンプルを穏やかに混合し、その後、チューブをサーモサイクラーで摂氏85度で15分間インキュベートします。サンプルを氷上で1分間冷却した後、サンプルをスピンダウンします。

標識および増幅されたaRNAをRNA抽出キットでクリーンアップします。適切なタイプの分光計を使用して、標識および増幅されたaRNAの濃度を決定します。シアニン3色素で標識した増幅されたaRNAの2番目のサンプルを調製します。

aRNAサンプルは、マイナス80°Cで最大3日間保存します。Cy3および5標識aRNAをそれぞれ825ナノグラム組み合わせます。これにブロッキングバッファとフラグメンテーションバッファを追加します。

混合物を摂氏60度で15分間インキュベートし、次に氷上で1分間冷却します。55マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを加え、気泡を導入せずによく混合します。混合物をGの11,300倍で1分間遠心分離します。

100マイクロリットルのサンプルをアレイスライドにロードし、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーに密封します。サンプルを摂氏65度で17時間ハイブリダイズし、毎分10回転で回転させます。オゾン捕捉安定化および乾燥溶液を準備します。

オゾンへの曝露を最小限に抑えるための予防策を講じてアレイを洗浄し、安定化および乾燥溶液に30秒間浸します。アレイの表面が乾燥していて、ほこりがないことを確認してください。アレイは暗い場所に保管します。

マイクロアレイスキャナーの電源を入れ、スキャンする準備ができるまで待ちます。次に、左側にバーコードをロードします。スポット分析を実行し、データをGPRファイルとして保存します。

統計解析ソフトウェアで、データを正規化して分析します。正のスポット選択閾値を計算し、ハイブリダイズ信号とバックグラウンド信号のプロットを表示します。配列内で黄土の正規化を実行し、次に配列間の分位数正規化を実行します。

正規化されたデータをスプレッドシート ファイルにエクスポートします。マイクロアレイデータリポジトリ内のすべての正のシグナルを使用して、選択した一意の遺伝子のIDリストを作成します。ID リストをタンパク質分類および分析データベースにアップロードし、生物として bos taurus を選択し、デフォルトの統計的過剰表現テストを実行します。

2ラウンド増幅後、フラグメントのサイズは非常に類似しており、品質も良好です。この方法による増幅が成功すると、aRNAは少なくとも1000倍増加するはずです。高品質のマイクロアレイ画像は、両方のチャンネルで高いスポット強度と低いバックグラウンド強度を備えています。

バックグラウンドの強度が高すぎると、信号の解像度が低下します。スポットの約46%はバックグラウンドの上にあり、そこから胚盤胞で発現する6, 765のユニークなRNA転写産物が単離されました。統計的な過剰表現テストにより、上位10の遺伝子オントロジー用語が活発な細胞分裂プロセスを表していることが示されました。

この技術の開発により、動物生殖の分野の研究者は、胚の遺伝子発現を調査し、さまざまな要因が発生中の胚にどのように影響するかを評価することができました。この技術は、ブタなどの他の重要な種でも開発されています。この手順に続いて、定量PCRなどの他の方法を使用してマイクロアレイの結果を検証することができます。

このビデオを見れば、胚からRNAを抽出する方法や、RNAを増幅して標識し、2色マイクロアレイ解析を行う方法についてよく理解できるはずです。