Name: デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶラットオリゴデンドロサイト前駆細胞の分離培養とオリゴデンドロゲネシスの定量化法。デュアル赤外線蛍光スキャンを用いて、脱髄性疾患や脊髄損傷の治療研究に応用可能です。

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<ol><li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li>
<li>Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
<li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+glial+cells%3A+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropath+Exp+Neur%22%5BJournal%5D)">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li>
<li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li>
<li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li>
<li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+deficient+mice%3A+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li>
<li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+%28Jimpy%3B+quaking%3B+Trembler%3B+shiverer+and+its+mld+allele%29+obtained+by+zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li>
<li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+thyroid+hormone+%CE%B2+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li>
<li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li>
<li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで紹介するプロトコルは、ラットのOPCを単離し、実験的な要因に応じて、 試験管 oligodendrogenesis に定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を記載しています。正の選択を使用して、実行可能な、純粋なOPCの高い収率を実験目的のために直接使用されています。この方法は、1週間の時間枠に分離、培養、および分化工程を合理化し、固定された細胞は、好都合には、アッセイ感度を損なうことなく数週間4℃で保存することができます。 スキャナベースの蛍光アッセイの主な利点は、データの収集および分析が大きく、従来のカメラベースの顕微鏡技術に対して促進されることです。顕微鏡がOPC分化のインデューサーを同定するためのハイスループットスクリーニングにおいて首尾よく使用されてきたが、それは目に画像キャプチャシーケンスのプログラミング、データ収集の数時間、数百の分析を必要とするため、データ収集は本質的に遅いです正規化または解析18,19のための個々の細胞体を区別するための画像ファイル、およびユーザ定義のアルゴリズムousands。さら...

哺乳動物の中枢神経系（CNS）における効率的な神経伝導がオリゴデンドロサイトによって軸索の髄鞘形成を必要とします。開発中に、オリゴデンドロサイトは、開発前脳と神経管1の心室ゾーンから移行すると考えられているオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）のプールから生じます。移行後のOPCは、効率的なインパルスの伝播を促進するだけでなく、栄養サポート2と軸索を提供するだけでなく、オリゴデンドロサイトをミエリン形成、成熟へと分化します。成体CNSは、すべてのセル3の約百分の5から8までを含む、グレーと白質全体に分散されているOPCの豊富な人口を維持します。脱髄傷害後、OPCが、損傷部位に遊走増殖し、露出した軸索上の紛失または破損したミエリン鞘を置き換えるために分化します。しかし、いくつかの疾患/損傷の設定では、このプロセスは非効率的であることが見出されたまたは完全に4失敗することができます。同時に慢性脱髄は、症状5を軽減することができる疾患、効率的oligodendrogenesisおよび再ミエリン化の負担に追加すると考えられています。したがって、oligodendrogenesisに関する実験要因の影響を決定するために、in vitroでのOPCを研究するために注目されています。 乏突起膠細胞の分化の異なる段階への洞察は、ステージ特異的な細胞マーカーを同定することによって可能となりました。 8 -自己再生初期前駆細胞は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRα）、神経/グリア抗原2（NG2）とA2B5 6の発現によって定義されます。 OPCには、それらの分化プログラムを開始し、細胞周期から撤退したように、彼らは、これらのマーカーの発現をダウンレギュレートし、環状ヌクレオチド3&#39;-ホスホジエステラーゼ（CNPアーゼ）とO4を含むオリゴデンドロサイトをpremyelinatingを示すタンパク質を発現し始めます。最後に、より成熟したoligodendrocへの分化ytesは、​​ミエリン関連糖タンパク質（MAG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、およびミエリン塩基性タンパク質（MBP）などのミエリン関連タンパク質の発現によって特徴付けられます。 MBPは、細胞内の末梢膜タンパク質およびミエリン鞘の主要な成分です。 MBP欠損したマウスは、CNSミエリン形成が大幅に震え、痙攣、早期死亡9,10につながる減少している深刻な表現型を開発。髄鞘形成におけるMBPのこの重要な役割は、in vitroおよびin vivo 11 の両方のオリゴデンドロサイト分化のマーカーとしての使用につながっています。 MBPの定量化は、いくつかの異なる方法を用いて達成することができます。 RT-PCRおよびウェスタンブロット分析は、異なる治療計画の下MBPレベルの定量化を可能にします。免疫細胞化学は、カメラベースの顕微鏡手法が使用される場合にも、定量的であることができる共通の定性的なアプローチです。これらのシステムは、信頼性との基本であるが、オリゴデンドロサイト分化の研究では、それぞれが薬物スクリーニングにおけるそれらの使用を制限し、自分の欠点を有しています。まず、RT-PCRおよびウェスタンブロット分析のために必要とされる主要なOPCの量を同時に検査することができる変数の数を減少させます。免疫細胞化学のための細胞要件がはるかに低いですが定量化が目標である場合には、かなりの時間が各実験に専念しなければなりません。多数の画像が取り込まれ、その後、実験的な分析を容易にするために、定量化する必要があります。これらの注意事項は、高スループットの評価を必要とする研究のために考慮すべき重要な障害となります。ここでは、大幅に必要な細胞の数および定量分析が完了するまでの時間の両方を削減しながら、免疫細胞化学およびミエリン定量化のためのウェスタンブロット方法論の両方から基本的な側面を利用する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>解剖 材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca2+ および Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm ポリスチレン ペトリ皿</td><td>フィッシャーブランド</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>光解剖顕微鏡</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>解離材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>解離チューブローテーター</td></tr><tr><td>神経組織解離キット (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>酵素解離キット</td></tr><tr><td>PBSとCa2+およびMg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu;m セルストレーナー</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>A2B5 カラム精製&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5 Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td><td>ビーズ結合 A2B5 抗体</td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>磁気選択カラム</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS Ca2+ および Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>Culture Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>トリヨードチロニン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>クレマスチンフマル酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu;M</td></tr><tr><td>クエチアピン半フマル酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu;M</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>プトレシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>アポ-トランスフェリン</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>T1147</td><td>100 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu;g / ml</td></tr><tr><td>微量元素B</td><td>コーニング</td><td>25-022-CL</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 サプリ</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>蓋付き24ウェルブラックVisiplate</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>組織培養グレード</td></tr><tr><td>免疫細胞化学および定量</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗アクチン</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗オリ2</td><td>ミリポア</td><td>AB9610</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500</td></tr> 希釈<tr><td>ヤギ抗ウサギ800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウス</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ 抗ウサギ</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色剤 DAPI Life</td><td>Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS Ca2+ および Mg2+</sup</td><td>>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor オデッセイ CLX 赤外線イメージングシステム</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびoligodendrogenesisの定量化の準備

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

効率的なオリゴデンドロジェネシスは、脊髄損傷、新生児低酸素症、多発性硬化症や横断性脊髄炎などの脱髄疾患を含む多くの研究分野の治療目標です。髄鞘形成は、中枢神経系内での迅速なインパルス伝播を促進するだけでなく、その下にある軸索に栄養サポートを提供するためにも必要です。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、in vitroで研究することで、オリゴデンドロサイトの分化を促進または阻害する可能性のある因子を特定することができます。これまで、このプロセスを評価するために利用可能な方法の多くは、一度に調査できる条件の数が限られているために多数の細胞を必要とするか、または手間のかかる定量化の方法のいずれかでした。ここでは、高純度のOPCを多数単離するためのプロトコルと、複数の条件から同時にオリゴデンドロジェネシスを測定するための高速で信頼性の高い方法について説明します。OPCは、P5-P7新生児ラット皮質から単離され、分化前の3日間in vitroで増殖されます。分化の4日後、オリゴデンドロジェネシスを二重赤外線蛍光スキャンアッセイを用いて評価し、ミエリンタンパク質の発現を決定します。

A2B5陽性のOPCは、磁気カラム分離システムを使用して陽性細胞の選択によって単離されます。単離手順の前に、全脳はP5とP7の間にあるラットの子から削除されます。全脳を正常頭蓋骨から取り外されると、嗅球および小脳微細手術用鉗子（ 図1A）を使用して除去されます。大脳皮質組織を単離するために視床下部、視床と中脳を慎重に解剖（ 図1B）によって切除されています。次に、海馬および線条体を折り曲げ手術用鉗子（ - D 図1C）を用いて除去されています。髄膜および血管系が除去されたときに分離工程を効率的に（ 図1E）髄膜および線維芽細胞を排除するが、酵素消化が改善されています。最後に、1ミリメートルのx 1mmの組織ブロックは、 図 （その後の組織解離工程のために用意されていますURE 1F）。 <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の髄鞘細胞です。このプロトコルは、ラット皮質からそれらの前駆体であるオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離および培養する方法、および実験要因に応答してin vitroでオリゴデンドロジェネシスを評価するための迅速で信頼性の高い定量的方法について説明しています。

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

本手順の全体的な目的は、ラットのオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離・培養し、実験的要因に応じたオリゴデンドロサイト分化を定量化することです。効率的なオリゴデンドロサイト分化は、脊髄損傷、新生児低酸素症、および横断性脊髄炎や多発性硬化症などの脱髄疾患を含む多くの研究分野における治療目標となっています。本手法の主な利点は、大量のOPCを単離するためのプロトコルと、複数の実験条件下でのオリゴデンドロサイト分化を同時に判定できる迅速かつ信頼性の高い手法を組み合わせている点にあります。この手順を開始するために、加熱ビーズ滅菌器を使用してすべての解剖器具を滅菌します。次に、50 mLコニカルチューブに15～20 mLのPBSを加えます。コニカルチューブを氷上に置き、解剖中に切断した皮質組織を保持するために使用します。次に、光学顕微鏡下での解剖に使用する10 cmのペトリ皿に、冷えたPBSを加えます。ラットの幼仔を安楽死させた後、小さな鋏を用いて、耳の後ろから正中線に沿って皮膚を切開します。そして、皮膚のフラップを剥がして後方にめくります。次に、脳幹から眼にかけて正中線に沿って頭蓋骨を切開します。この際、下層にある皮質の構造を維持するため、深く切りすぎないように注意してください。その後、小さな手術用ハサミを大後頭孔に挿入し、小脳の下側で2箇所の外側切開を行います。嗅球の前方、両目の間にさらに切開を加えます。頭蓋骨の左右それぞれの半分を慎重に剥がします。脳全体を取り出し、冷たいPBSを満たした10 centimeterのペトリ皿に入れます。解剖用実体顕微鏡下で、微細手術用ピンセットを用いて嗅球と小脳を除去します。脳を反転させ、腹側が見えるようにします。次に、微細ストレートピンセットを用い、閉じたピンセットの先端を皮質と視床下部の間に挿入し、脳の深さの約3分の2まで鈍的に剥離します。ピンセットを所定の位置に配置して開き、もう一方の半球でも同様の手順を繰り返します。その後、皮質を視床下部および中脳領域から慎重に剥離します。中脳の後面を持ち、脳の前端に向かって剥がすことで、視床下部、視床、および中脳を取り除きます。続いて、前方の接続を切断します。先の曲がった精細ピンセットを使用して、海馬を取り出し、皮質との接続を切断します。その後、下層の皮質から外側に向かって斜めに掻き出すようにして、残りの線条体を取り除きます。皮質の腹側表面から血管と髄膜を除去します。次に、脳を反転させて背側表面が見えるようにします。嗅球が位置する下層の皮質から髄膜を剥離します。合計3〜4匹のラット仔 chuộtに対して同様の手順を繰り返します。その後、摘出したすべての皮質をペトリ皿に入れます。滅菌済みのカミソリで、1 mm × 1 mm の大きさになるまで細切します。次に、ディッシュをPBSで洗浄して組織を回収し、再び氷上に置きます。続いて、ピペットコントローラーに取り付けたガラス製パストゥールピペットを用い、10回から15回、あるいは組織片が細分化され溶液が混濁するまでピペッティングを行い、組織を機械的に解離させます。その後、サンプルを37 °Cの組織培養インキュベーターに戻し、連続回転させながら15分間置きます。その後、各サンプルに10 millilitersのPBSを加え、50 milliliterチューブに設置した40 micrometerのポアフィルターでホモジネートをろ過します。次に、さらに1〜2 millilitersのPBSでフィルターを洗浄します。すべてのホモジネートサンプルを1本の50 milliliterコニカルチューブにまとめ、総細胞数を測定します。細胞計数後、ホモジネートを15 mLコニカルチューブに等量ずつ分注し、300 ×gで10～12分間遠心分離します。各LSカラムに5 mLのカラムバッファーを加えてプライミングを行い、通り抜けた液を15 mLコニカルチューブに回収します。カラムバッファーがアッパーチャンバーを完全に通過した後、各カラムに1000 µLの細胞懸濁液を添加し、重力によって細胞を通過させます。次に、各カラムを取り出し、15 mLコニカルチューブに入れます。5 mLのカラムバッファーを加え、バッファーを高速でカラムに通過させて、結合した細胞を剥離させ、カラムから回収します。細胞を播種するため、OPC増殖培地を用いて細胞を1 mLあたり60,000個に希釈します。24ウェルプレートの黒色透明底ウェルの各側壁に沿って、細胞懸濁液を500 µLずつピペッティングします。プレートを8の字を描くように水平に振って、細胞を混合します。この手順では、吸引時にウェルを損傷させないよう、ガラス製パステールピペットの上に200 µLピペットチップを装着します。次に、細胞の乾燥を防ぐため、処理群ごとに順番に培養ウェルから培地を吸引します。その後、1 mLピペットを用いて、処理用マスターミックス500 µLをウェルの壁面に沿ってゆっくりと加えます。培養物をインキュベートし、2〜3日ごとに新鮮な処理培地で完全に培地交換を行います。所定の処理期間が終了したら、培地を吸引します。細胞を固定するため、ウェルの壁面に沿ってPFA 400 microlitersをゆっくりと加えます。その後、プレートを室温で20分間インキュベートします。20分後、PFAを吸引し、滅菌したD-PBS 500 microlitersをゆっくりと加えて細胞を洗浄します。この洗浄操作をさらに2回繰り返し、最後の洗浄液は吸引しないでください。次に、プレートを室温に戻し、ウェル内の液を吸引除去して、5% NGSおよび0.1% Triton x-100を含む250 microlitersのD-PBSを加えます。プレートを室温で1時間、緩やかにオービタルシェーカーで振盪しながらインキュベートします。マウスモノクローナルanti MBP抗体およびウサギポリクローナルanti olig2抗体を、5% NGSを含むD-PBSで希釈し、一次インキュベーション溶液を調製します。次に、一次抗体を4 °Cで、緩やかなオービタルシェイキングを行いながら16〜18時間一晩インキュベートします。プレートを洗浄しながら、5% NGSを含むD-PBSでanti mouse 680およびanti rabbit 800抗体を希釈し、二次インキュベーション溶液を調製します。続いて、最後の洗浄液を吸引し、二次インキュベーション溶液を250 µL加えます。プレートを遮光し、緩やかなオービタルシェーキングを行いながら室温で1時間インキュベートします。その後、700 nmおよび800 nmの蛍光放出を検出可能なイメージングシステムを用いてプレートをスキャンします。初期設定として、フォーカルオフセットを3に、感度をMBPで1.5、actinで5.0、olig2で3.5に設定してください。信号の過剰露出を避けるため、必要に応じて感度値を調整してください。この概略図では、DIFSアッセイは、PLLコーティングされた培養容器に播種した新鮮に単離されたA2B5陽性ラットOPCから始まります。これらの培養物は20 ng/mLのPDGFAA存在下で3日間増殖させ、その後、0日目にPDGFを含まない新鮮な培地中で実験因子で処理します。2日目に処理培地を完全に交換します。そして4日目に4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。ここでは、0日目と4日目の代表的な培養細胞を用いて、核対比染色としてDapiを使用し、olig2およびMBPの免疫細胞化学染色を行いました。これらの培養細胞では、0日目および4日目に、パンオリゴデンドロサイト系細胞マーカーであるOlig2の構成的な染色が認められます。一方、成熟オリゴデンドロサイトマーカーであるMBPの染色は、4日目になって初めて認められました。このビデオを視聴することで、実験的要因がオリゴデンドロサイト分化に及ぼす影響を定量化するために、A2B5陽性ラットOPCをどのように精製、培養し、分化させるかについて十分に理解できるはずです。オリゴデンドロサイト分化を促進する因子の同定は、多発性硬化症などの脱髄疾患の研究において特に重要です。本稿で述べる手法を習得することで、これらの因子の同定が進み、最終的にはより優れた治療法の開発に寄与することが期待されます。

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、成熟オリゴデンドロサイト（OLS）を生成するために差別化初代培養におけるマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）の豊かな集団を、導出する方法を説明します。さらに、この報告書はマウス後根神経節ニューロン（DRGNs）の神経突起ベッドの上にマウスのOPCを播種によってマウスmyelinating共培養を生成する手法を説明します。...

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖...

ヒト胎児脳から由来オリゴデンドロサイト前駆細胞培養システム

このビデオは、ラットの網膜から網膜神経節ニューロン(RGN)を分離し、それらを嗅覚被覆グリア(OEG)細胞と共培養する手順を示しています。この方法により、神経損傷後のOEGの神経再生能力を研究することができます。...

網膜神経節ニューロンと嗅覚被覆グリアの共培養

このビデオは、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)をオリゴデンドロサイトに分化させ、後根神経節(DRG)ニューロンとの共培養で髄鞘形成を誘導するためのプロトコルを示しています。OPCは、髄鞘形成を調節するシグナル伝達タンパク質をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されます。形質導入されたOPCをDRGニューロンと共培養して、オリゴデンドロサイトへの分化とシグナル伝達タンパク質による髄鞘形成を評価します。...

オリゴデンドロサイト前駆細胞のin vitro形質導入誘導性髄鞘形成アッセイ

出典:Schott, J. T., et al.Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (2016).

分化したオリゴデンドロサイトを同定するためのデュアル蛍光イメージング

出典: Portela-Lomba, M., et.al. 成人軸索再生のインビトロモデルとしての、嗅覚被覆グリアを用いた軸索化ラット網膜神経節ニューロンの共培養。J. Vis.

軸索切開ラット網膜神経節ニューロンにおける軸索再生のイメージングと定量化

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ...

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。...

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

本明細書では、共培養実験に使用できるオリゴデンドロサイトの精製およびオリゴデンドロサイト条件培地の製造のための効率的な方法を示す。...

共同培養実験のためのオリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト条件培地の生成

神経損傷後の嗅覚神経再生能力(OEG)の神経再生能力を評価するインビトロモデルを発表する。これは、OEG単層上のアキソトマイズ化された直上神経節ニューロン(RGN)の共培養と、RGN軸索およびソマト樹状マーカーを分析することによって、軸索再生のその後の研究に基づいています。...

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

ここでは、生きたラットの脳から神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離する方法について、実験的に詳細に紹介します。これにより、健康を損なうことなく、同じ動物からこれらの細胞を複数回収集できます。...

生きたラットからの神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離のための「脳搾乳」法

学ぶラットオリゴデンドロサイト前駆細胞の分離培養とオリゴデンドロゲネシスの定量化法。デュアル赤外線蛍光スキャンを用いて、脱髄性疾患や脊髄損傷の治療研究に応用可能です。

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