デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

この手順の全体的な目標は、ラットオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離して培養し、実験因子に応答してオリゴデンドロジェネシスを定量化することです。効率的なオリゴデンドロジェネシスは、脊髄損傷、新生児低酸素症、横断性脊髄炎や多発性硬化症などの脱髄疾患など、多くの研究分野での治療目標です。この手法の主な利点は、多数のOPCを単離するためのプロトコルと、複数の実験条件で同時にオリゴデンドロジェネシスを決定するための高速で信頼性の高い方法を組み合わせることです。

この手順を開始するには、加熱されたビーズ滅菌器を使用してすべての解剖装置を滅菌します。次に、15ミリリットルの円錐管に20〜50ミリリットルのPBSを追加します。円錐形のチューブを氷の上に置き、解剖中にさいの目に切った皮質組織を保持するために使用します。

次に、10cmのシャーレに冷たくなったPBSを加え、光学顕微鏡下での解剖に使用します。ラットの子犬を犠牲にした後、小さなハサミを使用して正中線に沿って耳の後ろの皮膚を切ります。そして、皮フラップをはがします。

次に、脳幹から目に向かって正中線に沿って頭蓋骨を切断します。また、その下にある皮質の構造を保つために、深く切りすぎないように注意してください。その後、大孔に小さな手術用ハサミを挿入して、小脳より下に2つの横方向の切り込みを入れます。

嗅球の前方の目の間に追加の切り込みを入れます。頭蓋骨の各半分を慎重に剥がします。脳全体を取り出し、冷たいPBSを入れた10センチのシャーレに入れます。

解剖光学顕微鏡下で、細い外科用鉗子で嗅球と小脳を切除します。腹面が見えるように脳を反転させます。次に、細いまっすぐな鉗子を使用して、閉じた鉗子の先端を皮質と視床下部の間に脳の約3分の2の深さまで配置することにより、鈍的解剖を行います。

鉗子が所定の位置に配置されたら開き、もう一方の半球に対して手順を繰り返します。その後、視床下部と中脳領域から皮質をいじります。視床下部、視床、および中脳を後面に保持し、脳の前端に向かって剥がすことにより、視床下部、視床、および中脳を切除します。

その後、前方の接続を切断します。細かく曲がった解剖鉗子を使用して、海馬を切除し、皮質への接続を切断します。次に、残りの線条体を外側の斜めの動きで下にある皮質からこすり落として取り除きます。

皮質の腹面から血管と髄膜を取り除きます。次に、背側の表面が見えるように脳を反転させます。嗅球が位置する下にある皮質から髄膜をはがします。

合計3〜4匹のラットの子犬について手順を繰り返します。そして、解剖されたすべての皮質をペトリ皿に入れます。滅菌したカミソリの刃で、1ミリメートル×1ミリメートルの塊になるまで切り刻みます。

次に、皿をPBSですすいでティッシュを収集してから、氷の上に戻します。次に、ピペットコントローラーに取り付けられたガラス製のパスツールピペットを使用して、10〜15回ピペッティングするか、ティッシュピースのサイズが小さくなり溶液が濁るまで、組織を機械的に解離します。次に、サンプルを摂氏37度の組織培養インキュベーターに15分間連続回転させて戻します。

その後、各サンプルに10ミリリットルのPBSを加え、50ミリリットルのチューブの上に配置された40マイクロメートルの細孔フィルターでホモジネートをろ過します。次に、さらに1〜2ミリリットルのPBSでフィルターをすすぎます。すべてのホモジネートサンプルを 1 本の 50 ミリリットルの円錐形チューブにプールし、全体の細胞数を取得します。

細胞計数を行った後、ホモジネートを15ミリリットルの円錐形チューブに均等に分割し、300 gで10〜12分間遠心分離します。各LSカラムをプライミングするには、5ミリリットルのカラムバッファーを追加します。そして、15ミリリットルの円錐形チューブを通して流れを集めます。

カラムバッファーが上部チャンバーを完全に通過したら、各カラムに1000マイクロリットルの細胞懸濁液を塗布し、細胞が重力によって通過するのを待ちます。次に、各カラムを取り外し、15ミリリットルの円錐管に入れます。5ミリリットルのカラムバッファーを添加し、バッファーをカラムに高速で突っ込み、結合した細胞を取り出してカラムから放出します。

細胞をプレートするには、OPC増殖培地で細胞を1ミリリットルあたり60, 000細胞に希釈します。24ウェルプレートの各黒、透明な底ウェルの側面に沿って細胞の500マイクロリットルをピペットで分ける。プレートを水平に振って、8の字運動を使用して細胞を混合します。

この手順では、200マイクロリットルのピペットチップをガラス製のパスツールピペットの上に置いて、吸引中にウェルが損傷しないようにします。次に、細胞の乾燥を避けるために、一度に1つの処理グループで培養ウェルから培地を吸引します。その後、1ミリリットルのピペットを使用して、ウェルの側面に沿って500マイクロリットルの治療マスターミックスをゆっくりと加えます。

培養物をインキュベートし、2〜3日ごとに新鮮な処理培地との完全な培地交換を行います。所望の治療期間の終わりに、培地を吸引する。ウェルの側面に400マイクロリットルのPFAをゆっくりと加えて細胞を固定します。

そして、プレートを室温で20分間インキュベートします。20分後、PFAを吸引し、500マイクロリットルの滅菌D-PBSをゆっくりと加えて細胞を洗浄します。洗浄をさらに2回繰り返し、最終的な洗浄を吸引しないでください。

次に、プレートを室温に戻してウェルを吸引し、5%のNGSと0.1%のTriton x-100を含む250マイクロリットルのD-PBSを追加します。プレートを室温で1時間インキュベートし、眼窩を穏やかに振とうします。マウスモノクローナル抗MBP抗体とウサギポリクローナル抗オリg2抗体を5%NGSを含むD-PBSで希釈して、一次インキュベーション溶液を調製します。

次に、一次抗体を摂氏4度で一晩16〜18時間インキュベートし、眼窩を穏やかに振とうします。プレートを洗浄しながら、5%NGSを含むD-PBS中の抗マウス680抗体と抗ウサギ800抗体を希釈して、二次インキュベーション溶液を調製します。次に、最終洗浄液を吸引し、250マイクロリットルの二次インキュベーション溶液を加えます。

プレートを光から保護し、穏やかな眼窩振盪しながら室温で1時間インキュベートします。その後、700ナノメートルと800ナノメートルの蛍光発光を検出できるイメージングシステムを使用してプレートをスキャンします。出発点として、焦点オフセットを 3 に設定し、感度を MBP の 1 ポイント 5、アクチンの 5 ポイント 0、olig2 の 3 ポイント 5 に設定します。

必要に応じて感度値を調整して、信号の露出過多を防ぎます。この概略図では、DIFSアッセイは、新たに単離されたA2B5陽性ラットOPCをPLLコード培養容器に播種することから始まります。これらの培養物は、20ナノグラム/ミリリットルのPDGFAAの存在下で3日間増殖し、その後、ゼロ日目に新鮮なPDGFフリー培地で実験因子で処理されます。

治療培地は2日目に完全に補充されます。そして、細胞は4日目に4%のパラホルムアルデヒドで固定されます。ここでは、Olig2およびMBPの免疫細胞化学を、Dapiを核対比染色剤として使用して、0日目と4日目に代表培養物に対して行いました。

これらの培養物は、0日目と4日目に汎オリゴデンドロサイト系統細胞マーカーであるOlig2の構成的染色を示します。一方、成熟オリゴデンドロサイトマーカーMBPの染色は、4日目までにのみ明らかになりました。このビデオを見た後、オリゴデンドロジェネシスに対する実験因子の影響を定量化するために、A2B5陽性ラットOPCを精製、培養、および区別する方法を十分に理解しているはずです。

オリゴデンロジェネシスを促進する因子の同定は、多発性硬化症などの脱髄疾患の研究に特に関連性があります。ここで説明する技術を習得すると、そのような要因を特定し、最終的により優れた治療法を開発するのに役立つ可能性があります。