Name: マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶマウスの気管挿管による薬剤投与法。ブレオマシンを用いた肺損傷・線維化研究に適し、周囲組織への損傷を最小限に抑え、専門機器不要で再現性が高く、短時間で習得可能です。

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著者らは、トリクローム染色および分析のヘルプのためにワシントン大学の組織学とイメージングコアのブライアン・ジョンソンに感謝します。この作品は、NIHの助成金HL098067とHL089455によってサポートされていました。

ワシントンとシーダーズ・サイナイ医療センターの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、これらの研究のために必要な動物の作業を承認しました。 1.準備<ol><li>平滑末端鉗子と降圧介してオートクレーブの両方を滅菌します。 </li><li>生物学的安全キャビネットを使用して、凍結乾燥粉末からPBSでBLMの作業ストックを準備します。偶数混合を確実にするために35 kHzで10分間この溶液を超音波処理します。 注：μlの30〜45の総容量は、より大容量で、ピペットローエンドのバリエーション、および窒息を防ぐために推奨されます。 </li><li>手順自体は約1メートル2を備えてクリーンなワークスペースを準備し、同様の手順の前と後の両方のケージの場所を指定。 </li><li>ベースとunderl渡って実験用テープの2または3のストリップを置くことによって、直ちに研究者の前でベンチに手続きボードのベースを修正しました。英ベンチ。ボードの作成 ​​に関する更なる仕様については、図1を参照してください。 </li><li>手順ボードの2つの位置決めねじのサイズ4.0縫合糸の単一の長さを接続します。 </li><li>削除し、3 1ミリリットルのシリンジからプランジャーを破棄し、気密シールを形成するために、各バレルの上部にPBSを60μlを堆積させることにより、その場しのぎの肺活量計を生成します。シリンジの1に緩くカテーテルのハブを固定し、基板の一方の側に配置します。 </li><li> 1mlシリンジ内への空気の吸引し、300μlのとは、基板の一方の側に配置します。 </li><li>一辺までの長さと場所で約6インチテープの追加部分をカット。これは、ステップ2.4​​でボードに動物を保護するために使用されます。 </li><li>イソフルラン室を設定します。露光室とクリアランス真空の両方で適切なポートに、O 2、イソフルラン、真空を取り付けます。また、イソフルラン互換生物学的に麻酔薬を投与します安全キャビネット。 </li></ol> 2.挿管<ol><li>それは意識を失い、呼吸が適切な速度に減速するまで、チャンバ内でイソフルランでマウスを麻酔。典型的な曝露は、3〜4分間、4％イソフルランおよび2％O 2を含み、理想的な結果は、鎮静の2〜2.5分です。これは、すべての2秒1呼吸の呼吸速度に対応しています。 </li><li>片側にピペッター、所定の位置にBLMの30と45μlの間に設定するには、鎮静、吸引を待っている間。 </li><li>準備ができたら、手順プラットフォームの位置決めネジに取り付けられたスレッドからその上顎切歯によって鎮静させたマウスを一時停止します。動物の背側は、プラットフォーム表面に対して平らにすることを確認してください。 </li><li>換気を制限しないように注意しながら、ちょうど横隔膜の上、緩く胸腔の下（尾）部分を横切ってテープ片を配置します。配置は、procの中に適切な位置合わせを維持するのに十分タイトであるべきですedureが、それは呼吸を制限することは非常にタイトではありません。 </li><li> 80％の間と100％の強度に照明をオンにして、それは太陽神経叢の近くに、皮膚の表面から1〜2cm程度になるように、グース​​ネックを向けます。定期的にマウスを傷つけることがないように、熱のためのグースネックの先端を確認してください。 </li><li>プラットフォームの後ろに立ち、舌を見つけるために、滅菌、平滑末端の鉗子を使用しています。下の切歯、軽くグリップを回避し、口腔外に舌を描くように注意しながら。 </li><li>残りの手を使用して、圧子を挿入し、口腔内の床面に対して舌を平らにするためにそれを使用。鉗子を解放しますが、次の2つの手順のための場所で圧子を残します。 </li><li>オリエント光気管は、それがmainstem気管支のレベルに達するまで太陽神経叢のレベルから近位グースネックを案内することにより、表示されるように。 注：気管を簡単に呼吸の作用によって区別することができ、WHIchが放出された光は強度が変動する原因となります。正しく配置すると、この構造体は、口腔自体に最小限の環境光の光の中心に位置するピンとして軸平面に識別可能になります。 </li><li>角度シリンジそれは気管の自然な経路をたどる、とストレート内腔に、液滴を含む添付のシリンジを用いて、22-Gのカテーテル先端を下げるようにします。 PBSバブルが成功した配置時に各呼吸と共に上昇し、秋に開始されます。 注：このアクションは、深い鎮静の結果として数秒遅れで表示することができます。 </li><li>追加の5ミリメートルにカテーテルを養います。舌を取り外し圧子。 </li><li>反対側の手に注射器をシフトし、ハブを把持し、静かに注射器を取り外します。 </li><li>カテーテルハブの内部の中心部へのBLMの30と45μlの間の預金は、第2のシリンジを接続し、ハブへの空気の300μLを分注します。 </li><li>第二を交換しますPBSの気泡を含有する第一と注射器。バブルが上昇し、プロシージャが正常に実行された場合に落下していきます。 </li></ol> 3.ポスト手続きケア<ol><li>カテーテルとテープを取り外し、それが意識を取り戻すまで、乾燥した暖かい場所に動物を置く - 通常、数分以内に。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

エアロゾル化が原因で制限された試薬の利用可能性、安全性、またはコストに実用的ではない例において、直接気管内投与は、肺への外因性薬剤の送達のための優れた方法である16経気管点滴注入が広くこれを達成するために使用されています。しかしながら、すべての外科的介入と同様に、それはまた、それを使用して手順自体に起因する合併症の可能性を運び、そして必ずしも薬剤が点眼されている。13 これらの理由から、それは、挿管16,17,18,19,20を介して気管に直接物質を投与することがますます一般的になってきています。しかしながら、これらの方法はまた、長期の回復ケタミン/キシラジンのような強力な鎮静剤の使用に起因する時間、不確実性カテーテルの配置に関する（ すなわち 、食道へなく気管）内の組織の不必要な操作を含め、制限を受けます口腔、および関連するコストこのようなotoscopes /喉頭鏡などの特殊な機器を購入すると。 確立されたら、ここで説明するアプローチは、他の挿管プロトコルを介...

畜産観点からいくつかの解剖学的および生理学的な違いにもかかわらず、1マウスモデルは、ヒトの生物学と疾患の病因をモデル化するための非常に貴重であり続ける。2、マウスは、取り扱いが容易で低繁殖時間を持って、加速寿命、かつ比較的安価です家へ。多様な遺伝的系統と戦略（ 例えば 、条件付きノックアウト、レポーターマウス、系統追跡手法など）、ならびに入手可能な試薬の広い範囲（ 例えば 、抗体、組換えタンパク質、阻害剤の開発と、等）、マウスは、ヒト恒常性と疾患過程を明らかにするために不可欠なモデル脊椎動物の生物となっている。3 マウスはヒトで4 ALIは、外傷、傷害、または敗血症によって引き起こされ得る。急性肺損傷（ALI）および肺線維症などの肺の状態を研究するために特に有益であったと上皮を特徴とし内皮リーク（ すなわち、浮腫）、炎症、および新生線維症。多くの患者では、ALIは、その重篤な形態、しばしば線維症、呼吸不全のために死をもたらす急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、へと進行する。5,6肺線維症は、細胞外マトリックスの過剰沈着を特徴とする進行、致命的な病態であります、最も顕著に私が損なわ肺機能につながる、型コラーゲン。ブレオマイシンの7,8管理局（BLM）は、実験動物でALIおよび線維症を誘導するための最も広く使用されていると最もよく特徴付けられたモデルである。9げっ歯類におけるBLM誘発肺線維症はありませんが、完全にヒトの線維性の表現型を再現ではない、このモデルと10マウス研究は、疾患の発症と進行に影響を与える多くの重要な要因の発見につながっている。11 BLM誘発性線維形成の背後にある正確なメカニズム（s）は不明であるが、開始けが誘導気道および肺胞、特に、1型肺の内側を覆う上皮細胞における接触依存性DNA鎖切断に起因すると考えられる。12 BLMおよび肺上皮との間の直接接触の必要性は、頑強な送達経路の重要性を強調、およびこれらの懸念はまた、組換えタンパク質、抗体、siRNAを、ウイルス、細菌、微粒子、および多くを含む遠位気道を標的とする治療法の広い範囲に密接な関係がある。口腔咽頭吸引（OPA）が広く、この目的の13のために使用されてきたが、OPAの主な欠点は、送達される薬剤の一部がそれによって投与量に不正確さをもたらす、胃腸管に飲み込むことができることです。もう一つの広く使用されているアプローチは、直接気道への薬剤の気管や点滴を露出するために強力な麻酔下で気管切開を伴う経気管点滴、である。14しかし、だけでなく、そのようなよいです手順、その浸 ​​潤性に望ましくないこと、それはまた、時間がかかり、訓練の公平なビットを必要とし、気道に対して強力な障害を引き起こします。15,16、いくつかのプロトコルが開発されているに薬剤の直接投与を含みます外科的介入を必要とせずに気管、16,17,18,19,20が、これらの方法は、強力な麻酔薬によって引き起こされる長期の回復時間、高価な装置（ すなわち 、耳鏡/喉頭鏡、市販の手順ボード、光ファイバの使用を含みます投与量に関しては、ワイヤなど）、口腔内での操作の過剰、および不確実性。 本論文では、研究者が迅速、安価に、かつ確実に周囲の組織への残留損傷の限定されたリスクとマウスの肺に試薬を植え付けることができます挿管による投与の比較的容易な方法を記載しています。

<table><tbody><tr><td>注射用ブレオマイシン、30単位/バイアル</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>103720</td><td>最良の結果を得るには、BLMをPBSに懸濁し、分注し、単回使用の凍結乾燥アリコートとして保存する必要があります</td></tr><tr><td>鈍い端鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>舌圧子 (すなわち、曲がったValleylabブレード電極、2.4インチ)&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>E1551G</td><td>は使用前に、ブレードの先端から1.5cm&nbsp;のところに45度曲げてください。適切なデプレッサーは、同様の寸法の金属製の器具からも作成できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>エクセル セーフレット カテーテル 22G X 1インチ</td> <td>エクセル インターナショナル</td><td>26746</td><td></td></tr><tr><td>1 ml スリップチップ使い捨てツベルクリン シリンジ (200/sp, 1600/ca)</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml ピペッターとフィルターチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファイバーライト イルミネーター。モデル181-1:モデル180は、標準デュアルグースネックイルミネ</td><td>ーターDolan Jenner Industries、Inc.</td>と組み合わされています。<td>181-1</td>低<td>出力のLEDイルミネーターは、気管を十分に照らすことができないため、推奨されません。</td></tr><tr><td>挿管ボード</td><td></td><td></td><td>図1を参照してください。</td></tr><tr><td>カラーラベルテープ:0.5&nbsp;で。ワイド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>15-901-15A</td><td></td></tr><tr><td>酸素&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>製品は無菌</td></tr>でなければなりません <tr><td>非滅菌 シルクブラック編組縫合糸スプール、91.4 m、サイズ 4-0</td><td>ハーバード装置</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>テーブルトップ麻酔器 イソフルラン</td><td>ハイランド医療機器</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.highlandmedical.net/ スライドトップ誘導マウスイソフルランチャンバー</td><td>MIP /麻酔技術</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>フォラン(イソフルラン、USP)吸入用液体100mL&nbsp;</td><td>バクスター</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Nanozoomer デジタルパソロジーシステム</td><td>浜松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgM ELISA 定量キット&nbsp;</td><td>ベチルラボラトリーズ</td><td>E90-101</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

解剖学的および生理学的な違いがあるにもかかわらず、マウスモデルは人間の肺疾患を研究するための不可欠なツールであり続けています。ブレオマイシン毒性は、急性肺損傷と線維症の両方を研究するために一般的に使用されるモデルであり、ブレオマイシン(およびその他の毒性物質)を肺に投与するための複数の方法が開発されています。しかし、経気管的点滴などのこれらのアプローチの多くは、強力な麻酔薬や生存手術の必要性など、固有の欠点があります。この論文では、軽度の吸入麻酔、気管の視覚化、および曝露を確認するための代理肺活量計の使用を含む、気管内挿管の迅速で再現性のある方法を報告しています。概念実証として、8-12週齢のC57BL/6マウスに2.0U/kgのブレオマイシンまたは同量のPBSを投与し、曝露後に損傷と線維化エンドポイントの両方を測定しました。この手順により、研究者は比較的短期間で大規模なマウスのコホートを治療することができ、費用も少なく、処置後のケアも最小限に抑えられます。

挿管マウスは2.5％2,2,2- トリブロモエタノールの腹腔内注射を介して、10または17日後に、体重減少及び苦痛を毎日モニターし、4を屠殺した。他の場所21に記載のように気管支肺胞洗浄 （BAL）は、PBSの3回の洗浄で回収しました、および右肺は、10％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、ワシントン組織学とイメージングコア22の大学のマッソントリクロームで染色しました。 確立されたデータと一致して、BLM-処置マウスは日7,10ポストエクスポージャー23（図2A）との間のピーク体重減少を経験した。また、犠牲BLM処置マウスからのBAL中のIgMレベルの上昇は、有意な、時間依存性の増加を示しました肺透過性、上皮および/ ​​または内皮バリア機能不全（図2B）</str...

この記事では、挿管を経由して、マウスの気管に直接ブレオマイシンを投与するための迅速かつ簡単な方法を提示します。この方法の主な利点は、習得が容易で、それは非常に再現可能であることであり、特殊な装置または長い回復時間を必要としません。

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

本手法の全体的な目的は、挿管を通じてマウスの肺に迅速かつ容易に、そして確実に試薬を投与することです。また、この方法は周囲組織への残留的な損傷のリスクを抑え、低コストであるという利点があります。本手法は、肺の基礎生物学および疾患メカニズムの分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。急性肺損傷や線維化などが挙げられます。この手法の主な利点は、再現性が高く、習得が容易であり、特殊な装置や長期間の回復時間を必要としないことです。なお、処置は必ず滅菌済みツールを用いて行ってください。鈍端鉗子とデプレッサーの両方をオートクレーブで滅菌します。滅菌済みのフード内で、挿管により投与するための試薬のワーキングストックを調製します。投与量は 30 ～ 45 µL のボーラス量（一括投与量）を推奨します。均一に混合させるため、溶液を35 kilohertzで10分間ソニケーションします。次に、作業スペースを準備します。作業スペースとして、少なくとも1平方メートルの領域を確保してください。また、処置の前後に動物を収容するための個別の場所を用意してください。次に、処置用ボードを準備します。このカスタマイズされたモデルは、アルミニウム板から切り出され、T字型ブラケットで補強されています。同様の市販ボードも利用可能です。テープを数本使い、処置ボードのベースをベンチに固定し、実験者の正面に配置します。次に、処置ボードの2つのポジショニングネジの間に、4.0縫合糸を適当な長さに切って結びつけます。次に、 spirometer を作製します。3本の 1 mL シリンジからプランジャーを取り除きます。その後、各シリンジバレルの上部に最大 60 µL の PBS を注入します。これら3本のシリンジのうち1本を、カテーテルのハブに緩く固定します。使用時、気管から出る空気によって、シリンジ内のPBSが上昇および下降します。これを処置ボードの隣に配置してください。予備として使用するため、残りのシリンジ2本を手が届く範囲に配置します。次に、4本目のシリンジに300 µLの空気を吸い込み、ボードの脇に置きます。また、動物をボードに固定するための6インチのテープを数本用意します。次に、必要に応じてイソフルランチャンバーを設置します。酸素、イソフルラン、および真空ラインをチャンバーの適切なポートに接続し、排気用真空ラインを接続します。マウスの麻酔を開始します。重要な点として、動物の年齢、体重、健康状態などの要因によって麻酔薬への反応が変化するため、各研究室は自らのニーズに合わせてイソフルラン曝露量を最適化する必要があります。待機している間に、試薬のボーラス量をピペットチップにロードし、脇に置いておきます。マウスが鎮静されたら、処置プラットフォーム上の糸で上顎切歯を吊り下げ、動物の背中がプラットフォーム表面に平らに接するように固定します。次に、換気を妨げないように注意しながら、動物の手技中の位置を固定するため、横隔膜のすぐ上の胸腔下部をプラットフォームに緩くテープで固定します。次に、グースネック照明を80～100%に設定します。照明を太陽神経叢付近の皮膚表面から1～2 cmの位置に配置し、皮膚が過熱していないか定期的に確認してください。プラットフォームの後方から、鈍端鑷子を用いて舌を確認します。次に、下顎切歯に触れないよう注意しながら、舌をそっと掴んで口腔外へ引き出します。非利き手で舌を固定し、舌圧子で平らにしながら、鉗子を離します。その後、気管を照らすために、グースネックを太陽神経叢から主気管支まで、おおよそガイドします。気管は呼吸動作によっても容易に識別でき、気管から出る光の強度が変動します。正しく配置されると、口腔内自体の周囲光は最小限に抑えられ、気管が中央の光のピンのように見えます。気管の視認性が最適になるまで、カテーテルを口腔内に挿入してはいけません。光源またはディプレッサーを操作しても気管を確認できない場合は、舌を離して再度手順を試行してください。次に、気管の自然な走行に沿うようにシリンジの角度を調整します。そして、PBSが入ったシリンジを装着した22ゲージのカテーテルの先端を、そのまま腔内に挿入します。次に、カテーテルをさらに5 mm挿入し、舌圧子を取り除きます。正しく配置されていれば、シリンジ内のPBSの気泡が呼吸に合わせて上下し始めます。深い鎮静および浅い鎮静のいずれにおいても呼吸数に影響が出るため、この指標を確認する際は注意深く観察してください。その後、シリンジを非利き手に移します。ハブをしっかりと保持しながら、カテーテルを留置したまま、シリンジをゆっくりと抜去します。利き手を用いて、調製した試薬のボーラスをカテーテルハブの中央に直接注入します。次に、300 µLの空気が入った2本目のシリンジを接続し、空気をハブに注入します。これにより、ボーラスが肺内に十分に分散されるようになります。次に、シリンジを取り外し、PBSの気泡が入ったシリンジに交換します。処置が正常に行われていれば、気泡は上昇と下降を繰り返します。ここで、カテーテルとテープを取り除きます。そして、動物が意識を取り戻すまで、乾燥した暖かい場所に置いてください。通常、数分以内に回復します。挿管したマウスについては、体重減少を毎日モニタリングしました。ブレオマイシンの気管内注入後4日、10日、および17日にマウスを回収した。これらの肺から気管支肺胞洗浄液を回収し、分析を行った。IgMレベルの上昇は、肺透過性の有意な時間依存的増加を示しており、上皮および/または内皮バリアの機能不全を示唆していた。右肺を固定し、マッソン三色染色の染色を行った。全コラーゲン含量の確立された指標である線維化反応を定量化した。組織学的切片により、治療依存的な肺間質の肥厚および線維化病変の増加が認められた。この手技を習得すれば、適切に行うことで1分以内に完了させることができます。この手順を行う際は、気管周囲の軟組織を操作する必要はなく、また推奨されないことを忘れないでください。軟組織の操作は、動物の健康と実験の完全性の両方を損なう可能性があります。

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