Name: デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いたウイルス設計・パッケージングとマウス脳への定位注射法。神経疾患関連遺伝子のノックアウトと機能解析に応用でき、遺伝子改変動物を作製せずに効率的に遺伝子操作が可能です。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

成功したウイルスのパッケージングのために重要であるいくつかの重要なステップがあります。不健康な細胞が大幅に生成されたウイルスの量を減少させるように、細胞の健康は、トランスフェクション前との間に重要です。トランスフェクションおよびパッケージングが成功した場合、100％の細胞は、フルオロフォアを発現するはずであり、細胞が機能的なシンシチウムを形成すべきです。ステップ3.2.4では、チューブをタップすると、効率的に高い力価のトランスフェクションのために必要であり、HEPES緩衝生理食塩水のpHは正確でなければなりません。ウイルスのパッケージングに必要なプラスミドを生成マキシプレップは非常に純粋である必要があります。この点に、最終的なDNAの溶出を沈殿させ、トリスEDTA緩衝液に再懸濁エタノールと便利です。カフェインは、ウイルス回収の前に6日目（ステップ3.4）上に追加されていることを培地中で2％以下に血清の量を低減することも非常に重要です。血清が減少しない場合、最終的な精製されたウイルスは、血清PROTの望ましくない量を含有するであろうEIN。ウイルス粒子を沈殿させるポリエチレングリコール6000の使用は、超遠心分離の必要性を除外しています。ウイルスを含むCas9のCRISPRは、通常、単独で蛍光団を含むウイルスよりも倍少ない10周りの力価を持っていることに注意することも重要です。 定位手術のために、吸入麻酔の使用は、注射麻酔薬と比較して、迅速かつ正確な制御または動物の意識を可能にし、より大きな年齢範囲にわたって麻酔を可能にします。清潔で無菌手術器具を維持するために非常に重要であり、かつ再現性のターゲティングは、ヘッドの正確な位置決めを必要とします。定位固定装置内や頭蓋骨が所定の位置にしっかりと感じている頭部のないピッチングやローリングがないことを確認してください。頭蓋骨の定位座標を決定するために、縫合糸を見つけるために乾燥させるのに有用であり得ます。また、座標定位それぞれのレートとボリュームは、経験的に決定されるべきです。 この手法は、（のAAV）.Thereforeアデノ随伴ウイルスと比較した場合にlenti-またはレトロウイルスの広がりは、特に、制限されている離散的な脳領域に感染する際に、これらのウイルスは貴重であるが、全体的に感染のためのAAVに関連付けられていないという点で制限されています動物における行動分析に使用しました。このプロトコルにおけるカフェインの使用が大幅にこれらのウイルスの力価を増加させ、彼らはまだAAVパッケージングで達成力価ほど高くはありません。 CRISPR / Cas9が一過性にトランスフェクトした場合でも安定したゲノム編集を形成し、Cas9とsgRNAの、継続式は最終的にオフターゲット効果を生む可能性があるとしても、安定した統合は、蛍光団式の唯一の利点です。 AAVとのCRISPR / Cas9システムは、細胞分裂全体に伝播されたゲノムの変化を生成するのに十分である一過性発現は、しかし、蛍光体の発現が維持されることはありません。 LENの作成CRISPR / Cas9システムを利用ディーおよびレトロウイルスが生物の多種多様な任意の新規遺伝子を標的化する能力を付与します。遺伝子編集の効率がCas9切断をターゲティングガイドRNAの配列に依存するように思われます。経験的クローンの10％〜80％が感染のNeuro2a細胞を配列決定した後、インデルを含むことが決定されています。のNeuro2a細胞で計算さインデル周波数はニューロンのものを反映しているかどうか現時点では不明です。このようなBenchlingように、ガイドRNAの設計ソフトウェアは現在、所定の標的配列の効率を予測することができるかもしれない「オンターゲット」のスコアが含まれます。どの程度そのような「オンターゲット」のスコアには、CRISPR-Cas9システムは、より広く実装になると、経験的に、ニューロンおよび他の細胞型で決定される信頼性が必要です。 レンチウイルスベースのトランスジェニック動物の生産は、レンチウイルス配信の導入遺伝子は、Siとなっていることを報告して可変に成功しています11を lenced。 DNAのCRISPR介在遺伝子編集全体の動物モデルを生成するために生殖系列を介して通過することができます。したがって、安定したゲノム編集は、ウイルス送達フルオロフォアおよびCas9導入遺伝子のサイレンシングにもかかわらず、達成可能であってもよいです。これは、標的ゲノム変化のための効率的なプラットフォームを提供することができます。 CRISPR / Cas9系のウイルス送達、トランスジェニック生物を必要としないが、これらの技術に相補的です。例えば、誘導的に遺伝子操作と神経活動との関係の中に複雑な研究​​を促進すべきであるのCreとのCre依存オプトまたは化学遺伝導入遺伝子を発現する化合物のトランスジェニック動物に、そのようなウイルス粒子を注入します。第二の例は、遺伝​​子 - 遺伝子相互作用をスクリーニングする試みで、条件付きノックアウトにこれらCas9 / sgRNAウイルス粒子を提供することです。最後に、本研究のもう一つの刺激的なルートは、患者由来の細胞における表現型と治療化合物のスクリーニングは、どの缶です検証し、様々な疾患で破壊された遺伝子ネットワークを発見するために使用されます。

正常な生理機能および疾患病理学の基礎を研究するために、正確にモデル生物における遺伝子発現を操作する必要があります。興味の遺伝的要素はリコンビナーゼによって認識部位によって隣接された哺乳類のモデル生物では、これは主に作成およびトランスジェニックマウスの開発に集中しています。これは、これらの隣接遺伝子の部位特異的な操作をもたらすことができます。これが成功戦略となっているが、それは時間と資源集約的です。例えば、flox化遺伝子、Creリコンビナーゼ、とのCreレポーター遺伝子を発現し、トリプルトランスジェニック動物を作成すると、複数の交配と検証が必要です。これとは対照的に、複製の定位注射は、flox化遺伝子動物に蛍光タンパク質およびリコンビナーゼをコードする欠損ウイルス粒子は、複雑なジェノタイピングや繁殖戦略1を必要としません。さらに、蛍光タンパク質とCreを発現するウイルスは、第二のウイルスENCOと同時注入された場合鼎異なる蛍光タンパク質、これは、標的遺伝子操作のための内組織制御を提供します。この戦略はまだノックイン動物の使用を必要とするが、ウイルス媒介性のRNAベースの戦略は、トランスジェニック動物の必要性を回避します。例えば、蛍光タンパク質および短ヘアピンRNA（shRNA）をコードする複製欠損ウイルスの定位注射は、目的の遺伝子の転写の強力な減少をもたらすことが、細胞の内因性RNAi機構を使用することができます。しかし、shRNAの戦略は、多くの場合、控えめな細胞の表現型2で得られた微妙な遺伝子ノックダウンを生成します。ノックダウンは、より生理学的に関連するヘテロ接合体遺伝子の機能不全のためかもしれないが、ノックアウトと比較して減少した堅牢性は、新規遺伝子の表現型の発見のための理想的ではありません。 最近浮上している第3の技術、CRISPR（クラスタ化された定期的にショート回文繰り返しをInterspaced）/ Cas9（CRISPR関連タンパク質9）システムは、小型の外因性RNAとDNA切断酵素の両方の発現に依存しています。 CRISPR / Cas9システムは、ウイルスからのDNAに侵入し、Cas9酵素3,4を経由して、分解のためにそれをターゲットに、外国人を同定する方法を進化させ、原核生物の免疫系から適応されました。この強力なゲノム編集技術が標的欠失、挿入、および突然変異の作成のために使用することができます。そして以下のプロトコルは、 生体内でその発現をノックアウトするために、目的の遺伝子に欠失を作成する方法の概要を示します。Cas9酵素は、足場のRNAと関心領域に相同と連続したガイドRNAで表現されなければなりません。この技術を用いて遺伝子のノックアウトは、合成ガイドRNA（sgRNA）を使用して、ゲノム中の特定の領域にCas9をターゲットにし、目的の部位に二本鎖切断（DSB）を誘導が必要です。これらのDSBは、非相同末端結合（NHEJ）はルを経由して、内因性の細胞修復機構により修復されますミスセンスまたはナンセンス変異を生成することができるので、機能的なタンパク質発現5の損失を作成することができますインデルに広告。このシステムはゲノム変化を生成するので、それだけでCas9とsgRNAの一過性の発現を必要とします。しかし、この方法で操作安定蛍光細胞を同定するための指標とその子孫のために望ましいです。 Lenti-およびレトロウイルスを安定的に長期発現を維持し、有糸分裂時に娘細胞に受け継がれている宿主細胞に目的のDNAを統合するという利点を有します。このプロトコルは、設計不良複製、高力価のレトロウイルスの2種類の製造が記載されている：ヒト免疫不全ウイルス由来のレンチウイルス粒子（レンチウイルス）およびマウスマロニー白血病ウイルス（レトロウイルス）に基づくもの。これらのウイルスの両方が大きな導入遺伝子の発現する安定をサポートすることが可能であるが、レトロウイルス粒子は、ゲノムデュに統合することができます従って、核膜の分解、およびと環細胞分裂を標識するためのツールおよび出生日付セル6として使用することができます。レンチウイルスは、ウイルス収集中のカフェイン8の使用を含む比較的低力価図7に示すように 、この方法論、との評判がありますが、日常的に10 9〜10 10粒子/ mlの力価を生成します。 lenti-およびレトロウイルスのもう一つの利点は、非常に大きな挿入するための許容範囲です。プロトコルの次のコレクションには、DNAを変更するだけでなく、蛍光タンパク質を発現するCRISPR / Cas9システムを利用するために蛍光レポーター、sgRNAs、およびCas9をコードするレンチウイルスまたはレトロウイルスを設計するための手順の概要を説明します。 マウス定位脳神経外科は、形態、機能、および感染したニューロンの接続性を研究するために、in vivoでウイルスを注入するための貴重な方法です。ニューロンにおけるウイルス感染は、TIMの長期間にわたって発現レベルを操作するために使用することができますこのような開発全体としてE、および発現は、正確に、種々の薬物誘導性システムの使用及び特定のCre駆動発現によって制御することができます。この特定のプロトコルは、成体マウスの脳に目的の遺伝子をノックアウトするsgRNAとCas9を発現するウイルスを注入する方法を説明します。マウスは、この手順から非常に迅速に回復し、ウイルス導入遺伝子の発現は、48時間後の注射の中を見ることができます。しかし、蛍光団式が3週間後の感染によってほぼ最大レベルが得られ週間にわたって増加するように見えます。ウイルス定位注射を受けたマウスは、行動、電気生理学、または形態学的研究のために使用することができます。全体的に、これらの手順の目的は、定位手術や特定sgRNAとCas9を発現するウイルスを使用して、成体マウスの脳内の遺伝子をノックアウトする方法を実証することです。

<table><tr><tbody><td colspan="4">List of Cell Culture Reagents</strong</td></tr><tr><td>>293FT cell</td><td>line Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>For Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP細胞株</td><td>Clontech</td><td>631458</td><td>For Retrovirus</td></tr><tr><td>Iscove's Modification of DMEM (IMDM)</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>10% FBS、1% NEAA、1% L-Gln、および &nbsp; 1% P/S</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> を含む完全な IMDM <td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液、100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン 10&nbsp;cmプレート</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA 1x</td><td>コーニング</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">トランスフェクション試薬のリスト</strong</td></tr><tr><td>>5&nbsp;mlポリスチレンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物(CaCl2)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>ddH2O 塩化ナトリウム (NaCl) で 2.5 M 溶液を作る</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES 緩衝生理食塩水 (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95&nbsp;g HEPES、0.106 g Na2HPO4、pH 7.01 (正確!</td></tr><tr><td>カフェイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & マイクロ;Mシリンジフィルターユニット</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0.45 &micro;Mシリンジフィルターユニット</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>60 cc L / Lシリンジ</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール&nbsp;&nbsp;6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>ドナーウマ血清</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>357551</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP、ウサギ、488 コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Stereotaxic Surgery Reagents</td></tr><tr><td>Vet-シリンジ獣医はTBシリンジのみ1ccルアースリップTB100 / bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼メスブレード、#10、100パック</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>人工涙液軟膏</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>トリプル抗生物質軟膏&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg;ニードルソフトパック 25 g x 5/8インチ</td> <td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 シルク縫合糸</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価crisprレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

複製欠陥のあるレンチウイルスまたはレトロウイルスは、感染した宿主細胞のゲノムに導入遺伝子を安定して組み込むことができます。この技術は、蛍光タンパク質、細胞活性の光遺伝学的または化学遺伝学的コントローラー、またはモデル生物におけるヒト遺伝子の不均一発現をコードするために広く使用されています。これらのウイルスは、トランスジェニック動物の関連する標的部位にリコンビナーゼを送達したり、遺伝子発現を操作するために小さなヘアピンやマイクロRNAを送達するためにも成功裏に使用されています。これらの技術は実を結んでいますが、トランスジェニック動物(組換え酵素)に依存しているか、高い有効性と特異性(shRNA/miRNA)を欠いていることがよくあります。対照的に、CRISPR/Casシステムは、外因性ガイドRNAを介して生物のゲノムの特定の部位を標的とする外因性Casヌクレアーゼを使用して、DNAの二本鎖切断を誘導します。 これらの切断は、非相同末端結合(NHEJ)によって修復され、挿入および欠失(indel)変異が生成され、有害なミスセンスまたはナンセンス変異を引き起こす可能性があります。 この原稿では、ニューロンを安定的に形質導入して蛍光レポーター、Cas9、sgRNAを発現させてモデル生物の遺伝子をノックアウトできる単一のレンチ/レトロウイルス粒子の設計、製造、注入、および検証のための詳細な方法を提供します。

特定の配列を標的とするオリゴが下流hU6プロモーターのPXLクローニングベクターに挿入し、のBbsIクローニング部位を用いて、ガイドRNA足場の下流ている、「CRISPR / Cas9レトロウイルスのためのガイドストランド（sgRNA）を設計するための議定書」に続いて（ 図1、ステップ1）。このsgRNAは次にPXLから切り出し、をBstBIおよびPacI部位（ 図1、ステップ2）を用いてpRubi骨格に挿入されます。最後に、別のsgRNAはPXLにクローニングされた遺伝子の別の領域を標的とし、NHEJを介してノックアウトのチャンスを増やす、pRubi-参照編1（ 図1、ステップ3）における第一ガイドの下流に配置することができます。正しい構築物の確認は、配列分析によって決定されるべきです。この構築が行われると、それは「レトロ/レンチウイルス生産 - CaPO4法のプロトコル」以下のウイルスにパッケージングすることができます。成功したパッケージは、Vを滴定するために、HEK293細胞へのウイルスの感染によって確認されますirus。全く蛍光団式が存在しない場合は、可能性の高いウイルスのパッケージング中にエラーが発生しました。 図2は、GFPおよび他の発現しmCherryをを発現する1つの、新生児マウスの歯状回に同時注入し、2レトロウイルスの代表的な結果である（7日齢）と注射後21日画像化しました。 mCherryをまたはGFPを持つ神経細胞の標識は、1つのウイルスは単独で蛍光団を発現し、CRISPR / Cas9 KOおよび他のコントロールウイルスを媒介を表現することができ、同じ組織内の様々な遺伝子操作の形態学的評価を可能にします。定位注射が意図座標、歯状回の個別の感染によって示されるように、正確な解剖学的選択性を可能にします。感染のために脳切片を分析する場合、正しい解剖学的領域が感染されたと判定されるまで、周囲の組織を維持することが重要です。感染の兆候がない場合は、注入は、隣接領域ANに発生する可能性がありますdは周囲のセクションで同定することができます。また、正確な注入領域を見つけるために、針のトラックを見つけることが役に立ちます。 VSVG偽型ウイルスはほとんどin vivoで注射した場合、歯状回の余白の外に広がっていない、と3D再構成により分析し、全体の歯状回に沿って細胞を感染吻側/尾側軸（ 図3）に沿って拡散する傾向があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> 図1：レトロウイルスpRubi-参照編1-Guide2-CRISPRプラスミドのためのクローニング戦略は、この戦略は、FUベースのレンチウイルスプラスミドで同じです。 sgRNAオリゴをアニールし、BsbIクローニング部位を用いPXLに挿入されます。 sgRNAが正常PXLに挿入されることを保証するために配列決定した後、 をBstBIおよびPacIでプラスミドを消化。 （ブラックボックス）をドロップアウトされるインサートは、その後、ウイル​​スのバックB中にクローニングされ、1（黒の線を点在）pRubi-参照編1 CRISPR。第sgRNAもPXLに挿入およびPacI酵素を用いて消化することができます。次に、これをPacI部位を使用してpRubi-参照編1のCRISPRベクトル（赤点線）にクローニングされています。得られたプラスミドは、その後、ガイドストランドと同様に必要なウイルス要素、プロモーター、およびフルオロフォアの両方が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> 図2：mCherryを（赤）またはGFP（緑色）を発現するマウスの歯状回のレトロウイルス注射レトロウイルスは、P7マウスの歯状回に注入しました。 21日後、マウスを灌流し、脳を切片にし、GFPとmCherryを染色しました。 （A）5X広視野蛍光画像は、広報を示しています歯状回の注射と歯状回顆粒ニューロンを標識の特異性のecision。海馬の形態はDAPI（青）染色を介して見ることができます。スケールバーは200μmで測定します。 （B）10×広視野蛍光画像は、これらの高力価のレンチウイルスは、形態フルオロフォアの発現を介してアクセスすることができる多数の細胞に感染することを示しています。スケールバーは100μmを測定します。 GFPまたはmCherryをを表す（C）ウイルスは、歯状回に同時注入しました。レトロウイルスのシステムを使用して、1は、GFPとmCherryをすることによってマークされ、別の操作によってマーク1遺伝子操作を行うために1つのウイルスを使用し、その後に起因各ウイルスへの単一または添加変化を評価することができます。スケールバーは10μmで測定します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> 図3：レンチウイルス注射の解剖学的広がり定位共射出。<html>大人のPTEN のloxP / +マウスの脳へのGFP-shPtenウイルスとmCherryを制御ウイルスのは、海馬の歯状回の全体の吻側/尾側軸に沿って、ウイルスの拡散をもたらしました。これは、ウイルスの拡散の輪郭が再構築ソフトウェアを使用して21連続切片（Z = 50ミクロン/セクション）にトレースされた閉じた注入の程度の3D再構築に示されています。輪郭追跡は、ボリュームの定量化のための3D画像を生成するように整列させました。合計ウイルスの拡散は、緑色（ボリューム= 54730800μmの3）に示されており、座局在スプレッドは紫（ボリューム= 27275200μmの3）に示されています。ウイルスは、針トラックと歯状回の吻側/尾側軸を埋めることに加えて、針トラックの交差点で脳梁に沿って広がります。スケールバーは200μmで測定します。 レ/ ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; レトロウイルスおよびレンチウイルスバックボーンにクローニングするsgRNAsの補足ビデオ1.デザイン。 この合成ガイドRNA（sgRNA）設計例では、マウスCHD8のゲノム配列は、NCBIからダウンロードされます。開始コドンおよびエキソン構造は、その後、ベクターNTIで可視化されています。これは、私たちは第1コーディングエクソン周りのゲノム領域をコピーして、Benchlingにこのシーケンスを入力することができます。 Benchlingは、私たちは地域のすべての潜在的なsgRNAsを可視化することができます。さらに、我々は、入力を持つゲノム領域を示す後、Benchlingは私たちに各ガイドRNAのためのターゲットオンとオフターゲットスコアが表示されます。次に、ユーザは、最高のオンとオフターゲットスコアのガイドRNAを選択することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）</a>

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

この手順の全体的な目的は、蛍光タンパク質、CAS9およびsgRNAを発現するウイルスの設計およびパッケージングを可能にし、それらをマウス脳に定位的に注入することです。この手法は、神経疾患や神経発達障害の背景にある遺伝子の役割など、神経科学分野における具体的な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、遺伝子組換え動物の作製という時間と資源を要するプロセスを経ることなく、特定の遺伝子を操作できる点にあります。細胞の準備を行う前に、ウェブサイトを使用して、シングルストランドオリゴの設計に用いる20ヌクレオチドのガイドストランドまたはsgRNAを生成します。オリゴを注文し、テキストプロトコルに記載されている通りに最終的なプラスミドを作成した後、凍結保存チューブから解凍したすべての細胞を15 mLコニカルチューブにピペッティングします。次に、あらかじめ加温しCO2平衡化した完全IMDMを2 mL加えます。その後、細胞を500 ×gで5分間遠心分離します。次いで、上清を吸引し、細胞ペレットを10 mLの完全IMDMに再懸濁します。細胞を10 cm細胞培養皿に播種し、5% 二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで一晩培養します。播種から24時間後、既存の培地を吸引し、あらかじめ加温したIMDMを10 mL加えて培地を交換します。細胞がコンフルエントになったら、細胞を継代します。細胞を継代するには、培地を吸引し、5 mLのPBSでプレートを洗浄します。その後、0.25% トリプシンを1 mLプレートに加え、細胞がプレートから剥離するまで37 °Cでインキュベートします。その後、0.5 mLのIMDMを加えてトリプシン反応を中和し、細胞を1.5 mLチューブにピペッティングして回収します。次に、細胞を500 ×gで5分間遠心分離します。細胞を1 mLのIMDMに再懸濁し、細胞懸濁液10 µLを90 µLのPBSで希釈します。ヘモサイトメーターまたは自動細胞計数装置を用いて細胞数を計測し、完全IMDMで細胞を再播種します。5日目に、トランスフェクションの2時間前に培地を交換し、10 cmプレートにちょうど 10 mL の培地が入っていることを確認します。次に、5 mL の丸底ポリスチレンチューブ2本を用いて、2枚のディッシュ分のトランスフェクション試薬を調製します。1本目のチューブに「DNA」、2本目のチューブに「2X HBS」とラベルを貼ります。その後、DNA濃度を pH 7.4 の Tris EDTA 中で 1 µg/µL に調整します。レンチウイルスおよびレトロウイルスのトランスフェクション試薬を調製するために、「DNA」とラベルされたチューブに必要成分をゆっくりと加え、チューブを絶えずタッピングして混合します。その後、「2X HBS」とラベルされたチューブに2X HBSを1 mL加えます。次に、DNAチューブの内容物を1滴ずつ、ゆっくりと2X HBSチューブに1 mL分加えます。2X HBSチューブを絶えずタッピングし、1滴加えるごとにリン酸カルシウム沈殿が形成されることを確認し、トランスフェクション複合体が正常に作成されているかを確認します。続いて、チューブを室温の暗所で30分間インキュベートします。30分後、10 cm細胞プレートそれぞれにトランスフェクション試薬をゆっくりと1 mLずつ滴下し、細胞を37 °Cで一晩インキュベートします。6日目に培地を交換します。7日目に、ウイルス粒子を含む培地を10 mLセロロジカルピペットで50 mLコニカルチューブに移し、4 °Cで保存します。その後、各細胞プレートに0.5% FBS培地を8 mLずつ加えます。8日目に、ウイルス粒子を含む細胞培地を回収し、50 mLコニカルチューブに回収済みの前日の分と合わせて合わせます。このステップでは、ウイルス上清を2000 ×gで10分間遠心分離します。その後、0.45 µmの低タンパク結合シリンジフィルターでろ過し、ウイルス培地を精製します。次に、培地に5Xポリエチレングリコール6000溶液を加えます。チューブを数回反転させて混合してください。その後、ウイルス混合液を4 °Cで12時間以上インキュベートします。9日目に、ウイルス混合液を2500 ×gで45分間遠心分離します。45分後、上清を捨て、さらに2分間スピンダウンします。続いて、再び上清を除去します。その後、320 µLの滅菌PBSを加えてペレットを再懸濁し、シェーカーを用いて室温で30分間インキュベートします。翌日、ウイルスを分注し、分注したサンプルを-80 °Cで凍結保存します。この手順を開始するために、まず麻酔をかけたマウスの頭部を剃毛し、注射部位を準備します。ノーズコーンに4%のisofluraneを導入します。次に、マウスを脳定位固定装置にセットします。耳バーで固定する前に、歯がスロットに収まるまでバイトバーを口に挿入します。動物の体がヒートパッドの上にあり、鼻がノーズコーンに位置していることを確認してください。次に、足先をつまんで麻酔状態を確認します。その後、人工涙液を点眼して目を潤します。続いて、除毛した頭部をポビドンヨードとリドカインでスワブします。次に、頭皮の中央線に沿って小さな切開を加えます。綿棒で頭蓋骨の水分を拭き取り、過酸化水素を塗布してブレグマを視認しやすくします。解剖顕微鏡を用いて頭蓋骨上のブレグマの位置を確認し、その上にドリルビットを配置します。X、Y、Z平面のデジタル定位座標をゼロに設定します。吻側尾側Y軸に沿って頭部が水平であることを確認するため、ドリルビットをlambdaに置き、bregmaとlambdaでのZ座標がほぼ等しくゼロになるように頭部の水平を調整します。X軸に沿って頭部が水平であることを確認するため、ドリルビットをbregmaとlambdaの中点に置き、中点から両側に1 mm離れた位置でZ座標を測定し、それらが等しいことを確認します。次に、イソフルランを2%まで下げてから、ドリルを目的の座標に合わせ、慎重に頭蓋骨に穴を開けます。すべての穴を開け終わったら、ウイルスを満たしたシリンジを脳定位固定装置に取り付けます。シリンジを穴の中心に合わせ、頭蓋骨の位置でZ座標をゼロに設定します。シリンジを最も深いZ深度までゆっくりと下げ、脳定位注射器を用いて0.25 µL/minの速度で注入を開始します。最も深いZ深度での注入が完了した後、1分間待機してから次の座標までシリンジを上げ、再び注入を開始します。すべてのZ注入座標で注入が完了するまで、この手順を繰り返します。最後の注入後、シリンジを抜くまで2分間待ちます。次に、マウスを脳定位固定装置から取り出し、頭皮を縫合します。手術部位にリドカインと抗菌クリームを塗布し、鎮痛剤を投与した後、動物を保温リカバリーチャンバーに移します。この10X広視野蛍光画像は、高タイターのレトロウイルスが多数の細胞に感染し、その形態が蛍光タンパク質の発現を通じて評価できることを示しています。この例では、GFPまたはmCherryを発現するウイルスが歯状回に共注入されました。レトロウイルスシステムを用いることで、一方のウイルスでGFPで標識される遺伝子操作を行い、もう一方のウイルスでmCherryで標識される別の操作を行うことで、各ウイルスによる単独または相加的な変化を評価することが可能です。これは、21枚の連続切片にわたってウイルス拡散の閉じた輪郭をトレースした、注入範囲の3D再構築図である。その後、これらの輪郭トレースを整合させ、体積定量化のための3D画像を生成した。ウイルス拡散の全体を緑色で、歯状回に局在した拡散を紫色で示している。この画像は、ウイルスが歯状回の吻側尾側軸を満たすだけでなく、針の刺入経路および脳梁に沿って拡散している様子を示している。生体内へのウイルス注入後、組織学、電気生理学、またはライブツーフォトンの顕微鏡観察などの手法を用いて、遺伝子操作が神経発達に及ぼす影響を検討します。

designing-packaging-delivery-high-titer-crispr-retro-lentiviruses-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶCRISPR/Cas9を用いたウイルス設計・パッケージングとマウス脳への定位注射法。神経疾患関連遺伝子のノックアウトと機能解析に応用でき、遺伝子改変動物を作製せずに効率的に遺伝子操作が可能です。

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

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