デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

この手順の全体的な目標は、研究者が蛍光タンパク質、CAS9、およびsgRNAを発現するウイルスを設計してパッケージ化し、それらをマウスの脳に定位的に注入できるようにすることです。この方法は、神経障害や神経発達障害の根底にある遺伝子の役割など、神経科学分野の特定の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子組み換え動物を作成する時間とリソースを大量に消費するプロセスなしに、特定の遺伝子を操作できることです。

細胞を調製する前に、ウェブサイトを使用して、一本鎖オリゴの設計に使用される20ヌクレオチドガイド鎖またはsgRNAを生成します。オリゴを注文し、それらを使用してテキストプロトコールに記載されている最終プラスミドを作成した後、クライオチューブからすべてのth-od細胞を15ミリリットルの円錐管にピペッティングします。次に、2ミリリットルの予熱済みCO2平衡化完全IMDMを追加します。

次に、細胞を500倍Gで5分間遠心分離し、その後、上清を吸引し、細胞ペレットを10ミリリットルの完全なIMDMに再懸濁します。細胞を10 cmの細胞培養皿にプレートし、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。めっきの24時間後、既存のメディアを吸引し、10ミリリットルの予熱IMDMを追加してメディアを交換します。

セルがコンフルエントになったら、セルを分割します。細胞を分割するには、培地を吸引し、プレートを5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、0.25%トリプシンの1ミリリットルをプレートに加え、細胞がプレートから浮き上がるまで摂氏37度でインキュベートします。

その後、0.5ミリリットルのIMDMを加えてトリプシン反応を中和し、細胞を1.5ミリリットルのチューブにピペットで移します。次に、細胞をGの500倍で5分間回転させます。細胞を1ミリリットルのIMDMに再懸濁し、10マイクロリットルの細胞を90マイクロリットルのPBSに希釈します。

血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、完全なIMDMで細胞を再播種します。5日目は、トランスフェクションの2時間前に培地を交換し、10cmプレートにちょうど10ミリリットルの培地があることを確認します。次に、2本の5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブを使用して、2つのディスシェ用のトランスフェクション試薬を調製します。

最初のチューブをDNAとラベルし、2番目のチューブを2X HBSとラベル付けします。次に、PH 7.4のTris EDTAでDNA濃度を1マイクロリットルあたり1マイクログラムに調整します。レンチウイルスおよびレトロウイルスのトランスフェクション試薬を作製するには、必要な成分を標識されたDNAチューブにゆっくりと加え、チューブを連続的にタップして混合します。

その後、2X HBSとラベル付けされたチューブに2X HBSを1ミリリットル加えます。次に、DNAチューブから1ミリリットルの内容物を2X HBSチューブに1滴ずつゆっくりと加えます。2X HBSチューブを連続的にタップし、各滴後に形成されるリン酸カルシウム沈殿物を観察して、トランスフェクション複合体が正常に作成されることを確認します。

その後、チューブを暗所で室温で30分間インキュベートします。30分後、トランスフェクション試薬1ミリリットルを低速液滴で各10 cmの細胞プレートに加え、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。6日目にメディアを交換します。

7日目に、ウイルス粒子を含む培地を10ミリリットルの血清ピペットで50ミリリットルの円錐管に移してから、摂氏4度で保存します。次に、各セルプレートに8ミリリットルの0.5%FBS培地を追加します。8日目に、ウイルス粒子を含む細胞培地を回収し、前日の収穫物と50ミリリットルの円錐管で組み合わせます。

このステップでは、ウイルス上清をGの2000倍で10分間遠心分離します。その後、0.45 μメートルの低タンパク質結合シリンジフィルターでウイルス培地をろ過して精製します。次に、5Xポリエチレングリコール6000溶液を培地に加えます。

チューブを数回反転させて混ぜます。次に、ウイルス混合物を摂氏4度で少なくとも12時間インキュベートします。9日目に、ウイルス混合物をGの2500倍で45分間遠心分離します。

45分後、上清を捨て、再び2分間回転させます。続いて、再び上清を取り除きます。その後、320マイクロリットルの滅菌PBSを加えてペレットを再懸濁し、室温で30分間シェーカーでインキュベー

翌日、ウイルスを分量し、分量を摂氏マイナス80度で凍結します。この手順を開始するには、注射部位の準備のために麻酔をかけたマウスの頭を剃ります。4%イソフルランをノーズコーンに直接します。.

次に、マウスを定位測定器に入れます。耳バーを固定する前に、歯がスロットに落ちるまでバイトバーを口に挿入します。動物の体が加熱パッドにあり、鼻が鼻の円錐形にあることを確認します。

次に、足をつまんで麻酔を確認します。次に、人工涙液を塗布して目を滑らかにします。その後、剃った頭をポビドンヨウ素とリドカインで綿棒で拭きます。

次に、頭皮の正中線に沿って小さな切開を行います。綿棒で頭蓋骨を乾かし、過酸化水素を塗布してブレグマを視覚化します。解剖スコープを使用して、頭蓋骨のブレグマを特定し、その上にドリルビットを置きます。

X、Y、Z 平面のデジタル定位座標を 0 に設定します。頭が吻側尾のY軸上で水平になるようにするには、ドリルビットをラムダに置き、Z座標がブレグマとラムダでほぼゼロになるように頭を水平にします。ヘッドがX軸に沿って水平になるようにするには、ドリルビットをブレグマとラムダの中点に置き、両側の中点から1ミリメートルのZ座標を測定して、それらが等しくなることを確認します。

次に、イソフルランを2%に下げてから、ドリルを目的の座標に配置し、頭蓋骨を慎重にドリルで穴を開けます。すべての穴を開けた後、ウイルス充填シリンジを定位装置に貼り付けます。シリンジを穴の中央に置き、頭蓋骨の Z 座標を 0 に設定します。

シリンジをゆっくりとZの深さまで下げ、定位インジェクターを使用して毎分0.25マイクロリットルの速度で注射を開始します。Z深度の最深部で注入が完了したら、1分待ってから次の座標まで上げ、再度注入を開始します。すべての Z インジェクション座標が注入されるまで、このパターンを続けます。

最後の注射後、2分待ってからシリンジを取り外してください。次に、マウスを定位器械から取り外し、頭皮を縫合します。リドカインと抗菌クリームを手術部位に塗布し、鎮痛剤を投与してから、動物を加熱された回復チャンバーに移します。

この10倍広視野蛍光画像は、高力価レトロウイルスが多数の細胞に感染し、その形態は蛍光色素の発現によって評価できることを示しました。この例では、GFPまたはmCherryを発現するウイルスを歯状回に共注入しました。レトロウイルスのシステムを使用して、1つのウイルスを使用してGFPでマークされた1つの遺伝子操作とmCHerryでマークされた別の操作を行い、各ウイルスによる単一または相加的な変化を評価できます。

これは、ウイルス拡散の閉じた輪郭が21の連続切片にわたって追跡された注射範囲の3D再構成です。次に、等高線トレースを位置合わせして、体積定量化用の3D画像を生成しました。ウイルスの総拡散は緑色で、デンデートの局所的な拡散は紫で示されます。

この画像は、ウイルスが針の軌跡と脳梁に沿って広がるだけでなく、歯状回の吻側尾軸を埋めていることを示しています。in vivoウイルス注射に続いて、組織学、電気生理学、顕微鏡での2重の生きたなどの他の方法を使用して、遺伝子操作がニューロンの発達に及ぼす影響を研究します。