Name: 唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶラットの顎下腺に対するレトロダクタル投与法と局所分割照射技術。唾液機能低下の治療薬効果を評価し、標的以外の組織への副作用を低減する局所治療アプローチを確立する。

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放射線量測定の支援について、ジョン・チャン博士(ルイジアナ州立大学健康科学センター放射線腫瘍学)に感謝します。この研究は、米国がん協会(助成金番号:116945-RSG-09-038-01-CCE)、国立衛生研究所(助成金番号:R21CA173162)、およびFeist-Weiller Cancer Centerの支援を受けました。

すべての手順はLSU健康、シュリーブポート、動物実験委員会によって承認され、実験動物の管理と使用のためのNIHガイドラインに従ってありました。 ラット顎下唾液腺の1カニューレ挿入<ol><li> シリンジ-チューブアセンブリの調製 <ol><li>メスでPE10ポリエチレンチューブの10cmの長さをカットします。人差し指と親指の間のチューブの両端を持ちます。穏やかな炎上記チューブの中央部分を熱し、ゆっくり両側を引っ張ることにより、その長さを倍増させる軟化チューブを伸ばします。 </li><li>先細端部と各- 2カニューレを取得するために45 Oの角度でメスで途中でチューブをカットします。 0.5ccのインスリン注射器の29 Gの針の上にフィットさせることによって、カニューレの非テーパ状の端部を展開します。 </li><li>カニューレを外し、シリンジに生理食塩水の220μLを描きます。気泡を取り除くために、タップします。 cannulを取り付け針の上に、そして空気を排出し、カニューレを介して、溶液の自由な流れを確保するために、シリンジのプランジャーを押してください。 200μlに音量を調整します。 </li></ol></li><li> 顎下腺ダクトの口腔内カニューレ挿入 注：オートクレーブ楽器は手続きの前に、ホットビーズ滅菌器の手順の間に、滅菌します。 <ol><li>スプラーグドーリーラットを計量し、皮下注射器で計算されたケタミンの量（42 mgの/キログラム）/キシラジン（8mg / kg）/アセプロマジン（1.4ミリグラム/キログラム）のミックスを分注します。 </li><li>人差し指の間尾と片手の親指の付け根を把握し、それを把握するために身体の上にもう一方の手をスライドさせることにより、動物を拘束。親指と残りの指で胴体を保持しながら、頭部の側面に沿って人差し指と中指を立てます。 </li><li>後肢の筋肉組織に麻酔薬を注入します。つま先のピンチと眼瞼反射によって麻酔の深さを確認してください。乾きしばらくのを防ぐために目の潤滑剤を塗布動物は麻酔下です。 </li><li>特別に設計されたプラットフォーム（ 図1）に動物を置き、横バーの上側切歯に係合します。下の切歯の周りにゴムバンドをループし、プラットフォームにそれを固定することにより、下顎をプルダウン。 </li><li>舌を通して滅菌縫合糸を渡し、口の床を上げるためにそれを持ち上げます。止血鉗子で縫合糸をクランプ、および横方向のバーの上にそれを渡します。 </li><li>カスタムビルドの頬スプレッダー（ 図1）と頬を展開し、解剖顕微鏡下で、口の床の上に舌下乳頭を探します。 </li><li>繊細な鉗子を用いて行うPE10チューブのテーパ状の端部をつかみます。そっと舌下乳頭上の腺管開口部にカニューレの先端を操作します。それは3ねじ込むことによって、カニューレの配置を確認してください - ダクトに5ミリメートルを。それは、任意の障害物なしに通過することを確認してください。 </li></ol></li><li> 顎下腺Instillation <ol><li>首筋に皮下アトロピン（0.5ミリグラム/キログラム）を注入し、唾液分泌の減少のために10分を待ちます。 </li><li>シアノアクリレート（接着剤）の低下にダクト開口部にカニューレを固定し、乾燥させます。ゆっくり〜50マイクロリットル/分の速度でシリンジプランジャを押して腺（200μL/腺）溶液を植え付けます。 </li><li>止血鉗子でチューブをつぶす、と慎重に注射器を取り外します。動物が意識を取り戻すまで60分 - 30用のダクト内チューブを保持します。舌を保持している縫合糸を外します。 </li><li>別々のケージに動物を移し、リカバリ中にそれを暖かく保つために加熱ランプを使用しています。それは胸骨横臥を維持するために意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。 </li><li>動物が完全に歩行した後、食物および水に無制限にアクセスできるビバリウムでそれを収容します。 </li></ol></li></ol> 2.ローカライズ分割照射顎下腺の<ol><li>前述したように動物を拘束し、後肢でケタミン（33 mgの/キログラム）/キシラジン（6ミリグラム/キログラム）/アセプロマジン（1ミリグラム/キログラム）ミックスの筋肉内投与で麻酔。麻酔の深さを確認し、目に潤滑剤を塗布。 </li><li>線形加速器卓上に動物仰向けに置き、頭を傾けることによって、その首を拡張します。胸骨の上部に下顎骨の下縁からの領域を包含するように照射野（3センチスリット幅）をコリメートします。 </li><li>領域の上に1cmの組織等価ボーラスを配置し、放射線源100センチボーラスの頂部との間の距離を調整します。 </li><li>線形加速器の6 MV光子ビームを用いて動物（2.5 Gyの）を照射します。線量率、視野サイズ、及び放射線源からのボーラスの表面までの距離は、露光時間を決定するであろう。現在のセットアップでは、動物は約1グレイ/分の線量率で照射しました。 </li><li>露出を繰り返します。 2.5 Gyの/ 8日目の合計日々;間で2日間隔で4日/週。リカバリ中に動物を暖かく保ちます。それは完全に歩行した後に飼育箱に動物を転送します。 </li><li>腺機能14を測定するために、8週間照射後刺激顎下腺の唾液を収集します。冷たい4％パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水のpHが7.2の心臓灌流によって麻酔下で動物を安楽死させます。組織学的および免疫組織化学14を分析するための顎下腺を摘出。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

唾液腺は、多くの場合、頭頸部癌、首ノードの選択科目切除、または地域の血液悪性腫瘍に対する放射線治療を受けた患者における組織回復のしきい値を超えた放射線量を受けます。腺の流体を分泌する腺房細胞が最終的に分化しているが、それらは逆説的に放射線に敏感です。分泌機能は、放射線の最初の数週間以内に低下し、慢性低唾液出力の不可逆的な腺の損傷をもたらします。貧しい腺機能とすさまじい口腔乾燥に対抗するために、保存または分泌機能の回復は非常に重要です。小説から保護または放射線損傷を修復する治療法が1を検討されている、8-11、16-20。 治療の全身投与は、非標的組織における望ましくない影響の固有のリスクを運びます。唾液腺へ向けた配信は、このリスクを減少させます。 Retroductal遺伝子治療は、予防またはに有効です放射線関連唾液腺苦悩​​1、9-、11、16,17,20を改善。しかし、同じ技術を使用して、唾液腺はまた、異所性、タンパク質を発現および分泌するように再設計することができます。唾液腺細胞における基底内分泌分泌経路を利用...

健康な組織の担保破壊は、癌治療の有害な副作用の数を占めています。放射線分野でうそをつく大唾液腺の一部または全部は、必然的に破壊されます。従って、骨髄移植の前頭部および頸部癌、子宮頸癌、リンパ腫、または全身照射のための放射線治療を受けている多くの患者は、放射線、唾液腺機能低下2-6の最も一般的かつ永続的な副作用の一つを被ります。 唾液腺の流体生産腺房細胞は、放射線への急性敏感です。唾液腺の損傷は、唾液機能低下と呼ばれる状態を唾液の流れの大幅な逓減を引き起こします。唾液の流れにおける慢性の減少は、咀嚼、嚥下、スピーチ、そして味が、激しい痛み、粘膜涙、嚥下障害、日和見感染症の病的後遺症などの重要経口活動を阻害し、虫歯が悪化します患者の幸福と機能2,3。 放射線治療関連の唾液細胞の損失は不可逆的であるため、口腔乾燥症のない矯正治療はありません。人工唾液代用とprosecretory薬で症状を和らげに焦点を当て現在の治療は長期の救済6には無効です。改良された放射線送達技術は、症状の重症度を減少させる助けているが、正常組織毒性とその合併症は、がん治療6,7の制限要因のまま。放射線治療に関連する合併症を予防するための先制措置は、従って、標準になりつつあります。フリーラジカル酸素種を除去ラジオ保護剤、里親細胞再増殖、またはDNA修復を高めるためには、唾液機能低下8-11を回避するために探索されています。 外分泌唾液腺の分泌物は、主排泄ダクトを介して口の中に排出します。目の口腔内挿管造影剤の注入のための電子排泄ダクトは外来処置として日常的に行われます。同様のアプローチを利用して、唾液腺に直接局所治療12の対象とすることができます。別に全身副作用のリスクを減少させるから、retroductal腺点滴は利益を追加しました。乳管ツリーの周りの唾液細胞の単層の配置は、すべての唾液腺上皮細胞をターゲットにすることを可能にし、不要な治療拡散を低減するための障壁として腺行為の繊維状のカプセル化。本質的には、唾液腺は、このような放射線誘発唾液機能低下などの腺苦痛の標的治療のために最適に適しています。 週間の期間のための - （2.5 Gyの/分数/日、5日の週1.8）癌治療のための従来の放射線が少量で提供されています。したがって、実験モデルにおいて長引く放射スキームに対する有効性を示している放射線防護の治療は、より大きな臨床ベアリングを持っています。 COMPRO分別放射線は小動物に記録されたが、放射線源、用量分画、および使用されるプロトコルは9,10,13変化された後、唾液機能mised。 このレポートでは、患者関連の放射線源と線量分画を用いてラット顎下腺の放射線へのローカライズさretroductal送達のための方法を確立します。

<table><tbody><tr><td>Intramedicポリエチレンチューブ(PE10)</td><td>ベクトンディクソン</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>1/2 ccインスリンシリンジU-100</td>ベ<td>クトンディクソン</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>ミラー獣医供給&nbsp;</td><td>5098-9840-64</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>パーマハンドシルク縫合</td>糸<td>エチコン</td><td>K833H</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11051-10</td><td></td></tr>オ<tr><td>リンパスSZX16実体顕微鏡</td><td>ハント光学とイメージング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 MV線形加速器</td><td>エレクタ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボーラス - スキンレス&nbsp;</td><td>シブコ</td><td>MTCB410</td><td></td></tr><tr><td>ヒートランプ</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>HL-1&nbsp;110V</td><td></td></tr></tbody></table>

唾液機能低下のラットモデルにおけるretroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

放射線のポータル内にある正常な組織は、不注意で損傷を受けます。唾液腺は、頭頸部の放射線治療中にしばしば損傷します。回復不能な細胞損傷は、唾液機能の慢性的な喪失をもたらし、基本的な口腔活動を損ない、口腔感染症や虫歯のリスクを高めます。唾液機能低下とその合併症は、患者の快適さに深刻な影響を与えます。現在の症状管理は効果がなく、症状を緩和するための新しい治療法が必要です。
唾液腺は外分泌腺であり、排泄管を介して分泌物を口の中に排出します。これらのダクトのカニューレ挿入は、腺への直接アクセスを提供します。造影剤の主要な唾液腺へのレトロダクト送達は、画像診断のための日常的な外来患者の手順です。同様の手順を使用して、腺の局所的な治療が可能です。しかし、この手法を小動物を用いた前臨床試験で実施することは、独自の課題を提起します。この研究では、Bruce Baum博士の研究室(NIH)1で改良された手順であるラット顎下腺への後戻り投与の技術について説明し、局所腺照射の手順を説明します。

低侵襲性唾液腺撮影技術、大唾液腺の局所治療を適応させることが可能です。ラット顎下唾液腺におけるRetroductal投与はウォートンのダクトの口腔内挿管（ 図2）により実行しようとしました。ウォートンの唾液管は、口の階にある舌乳頭に開くが、オリフィスは容易には見えません。カニューレの挿入は、従って、穏やかなプロービングすることによって行いました。カニューレを配置しながら厄介な出血やダクトの穿孔を避けるために、何の力は使用しませんでした。ダクト内のカニューレの滑らかな抵抗無通路は、チューブを穏やかに前後に移動することにより確認しました。 最初の実験の間にカニューレ挿入は（図3）、ヘマトキシリンまたはトリパンブルー溶液を用いて腺を注入し、安楽死させた動物において腺染色を評価することにより確認しました。 GLそしてボリュームが摘出腺における乳管ツリーの染色を可視化することにより確認した埋めま...

唾液腺の機能低下は、頭頸部放射線治療の大きな副作用であり、患者の生活の質を低下させます。動物モデルにおける新しい治療法の有効性の実証は、臨床移行前の前提条件です。このプロトコルは、ラット顎下腺のレトロダクト投与と局所照射について説明しています。

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

この手順の全体的な目的は、治療薬を顎下腺に逆行的に投与し、唾液腺機能不全に対する有効性を評価することです。この手法は、放射線照射に対して唾液腺機能を保護または回復させることができる治療法は何かという、唾液腺疾患分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、唾液腺を局所的に治療できるため、標的外組織における副作用のリスクを低減できることです。一般的に、この手法に慣れていない人は、管の開口部が見えず、カニューレを管内に盲目的に操作して挿入しなければならないため、苦労することがあります。処置を開始する前に、PE 10ポリエチレンチューブを10 cmの長さにメスで切断し、次にチューブの両端を両手の人差し指と親指で挟んで保持し、チューブの中央部分を緩やかな炎で加熱しながら、軟化したチューブを両側に慎重に引っ張って長さを2倍に伸ばします。次に、メスを用いてチューブの中央を45度の角度で切断し、先端がテーパー状になった2本のカニューレを作成します。カニューレの非テーパー端を、0.5ccインスリン用注射器の29ゲージ針に被せて広げます。次に、カニューレを取り外し、注射器に220 µLの生理食塩数を吸引します。注射器のシャフトを軽く叩いて気泡を取り除き、再び針にカニューレを装着します。プランジャーを押し下げてカニューラから空気を排出し、チューブ内を溶液がスムーズに流れるようにして、シリンジ内の生理食塩水の量を200 microlitersに調整します。次に、足指のつまみテストと触知可能な反射によって、ラットが適切な鎮静レベルにあることを確認し、露出した角膜に眼潤滑剤を塗布します。動物を専用の固定プラットフォームに置き、上顎切歯を横棒に固定します。下顎の前切歯にゴムバンドをかけ、顎を下に引きます。それをプラットフォームに固定します。次に、滅菌済みの縫合糸を舌に通し、持ち上げることで口底を上昇させます。次に、止血鉗子で縫合糸を固定し、止血鉗子を横棒（トランスバースバー）の上に渡します。続いて、特製の頬拡開器を用いて頬を広げ、解剖顕微鏡を使用して口腔底にある舌下乳頭を確認します。精細鑷子を用いて、あらかじめ準備したPE 10チューブのテーパー状の端を掴み、カニューレの先端を舌下乳頭の管開口部へと緩やかに挿入します。次に、カニューレが詰まることなく管内を通ることを確認しながら、カニューレを管内に3～5 mm挿入します。生理食塩水を注入する前に、動物の項部にアトロピンを皮下注射します。注射の10分後、シアノアクリレートを1滴滴下し、カニューレを管口に固定します。接着剤が乾燥した後、生理食塩水 200 µL が腺内に注入されるまで、シリンジのプランジャーを 50 µL/min の速度でゆっくりと押し下げます。注入中に逆圧が生じた場合は、一旦停止してチューブを抜き、新しいカニューレで再度挿入してください。その後、止血鉗子でチューブをクランプし、慎重にシリンジを取り除きます。動物が意識を取り戻すまで、チューブをダクトに入れたまま30〜60分間放置します。その後、舌を固定している縫合糸を取り除き、完全に回復するまでヒートランプのある別のケージに動物を移動させます。顎下腺に局所的に分割照射を行います。仰臥位で麻酔をかけたラットの、下顎の下縁から胸骨上端までの領域を包含する3 cmの狭長放射線照射野を設定します。当該領域に1 cmの組織等価ボルスを配置した後、リニアアクセラレーターの6 MV光子ビームを用い、線源からボルスの上面までの距離を100 cmに調整します。適切な照射時間で、動物に2.5 graysの放射線を照射します。放射線照射期間の終了後、実演した通りに動物の回復を待ちながら保温します。初期の実験では、腺にヘマトキシリンまたはトリパンブルー溶液を注入し、安楽死させた動物における腺の染色状態を評価することで、カニューレが適切に配置されていることを確認しました。顎下腺が研究対象となったのは、頸部へのコリメート照射を行うことで、動物の健康状態や実験結果に影響を及ぼしうる深刻な口腔内のオフターゲット効果を回避しつつ、選択的に照射できるためである。この分割照射計画が照射8週間後の唾液流量に及ぼす影響を分析した結果、2.5 greyずつの1日あたりの曝露により、唾液流量が急激に減少することが示された。照射された動物では、非照射動物と比較して唾液分泌量が10分の1に減少した。この手技を習得すれば、適切に行うことで数分で完了させることができます。この手順を試みる際は、カニューレが唾液腺の排泄管へ妨げなく挿入されるようにすることが重要です。この手法の開発により、唾液腺疾患分野の研究者が、放射線治療や自己免疫性唾液腺疾患の治療法を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ラットの顎下腺における逆管内注入法の実施方法と、放射線毒性軽減策の治療効果を評価するための腺への局所照射方法について、十分に理解できるはずです。遺伝子治療薬やタンパク質治療薬を取り扱う際は非常に危険を伴うため、本手順の実施にあたっては、針刺し事故の回避や生物学的製剤への皮膚露出の最小化など、常に十分な予防策を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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学ぶラットの顎下腺に対するレトロダクタル投与法と局所分割照射技術。唾液機能低下の治療薬効果を評価し、標的以外の組織への副作用を低減する局所治療アプローチを確立する。

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

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