三次元根系のための抽出メトリック：イン土壌のX線コンピュータ断層撮影データからボリュームおよび表面分析

この手順の全体的な目標は、土壌内のX線コンピューター断層撮影データから植物の根に関する定量的情報を抽出することです。生きた植物の根の構造を調査するこの方法は、植物が干ばつや微生物活動などの変化する環境条件にどのように反応するかなど、生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、非侵襲的であるため、植物を本来の環境である土壌で研究できることです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、手順には断層撮影、データの再構築、分析など、視覚的な補助なしでは不明瞭な多数のステップが含まれるため、価値があります。まず、X線トモグラフィースキャナーのサンプルマニピュレーターに鉢植えの植物を、ターゲット倍率に必要な距離に置きます。直径2インチのホルダーの植物の場合、サンプルを約3インチのソース距離に設定します。

機器制御ソフトウェアで、X線出力設定を85キロボルトと190マイクロアンペアに設定します。次に、露光時間を1秒に設定すると、信号対雑音比が向上します。適切なデータ統計のために、投影の数を 3, 142 に設定し、投影あたりのフレーム数を 4 に設定します。

設定したスキャンパラメータを使用して、「シェーディング補正」タブを選択します。次に、[新規]をクリックして、シェーディング補正ファイルに名前を付けます。次に、「プレゼンテーション」をクリックして、新しい条件を確認します。

次に、「作成」をクリックし、「OK」をクリックして、2つの参照画像を使用します。次に、「生成」をクリックします。次に、警告ポップアップウィンドウが表示されたら、サンプルをビームパスから物理的に削除してから、[OK]をクリックします。シェーディング補正が実行されます。

次に、「Acquisition」タブをクリックし、データファイルに名前を付け、X線フィルターの「None」を選択します。[リングアーティファクトを最小化する]チェックボックスがオンになっていることを確認して、投影画像が取得される間、サンプルが角度のあるステップで回転

最後に、 取得」 ボタンをクリックしてスキャンを開始します。生データを取得した後、再構築プログラムにロードします。「点滅」をクリックして最初と最後の画像を比較し、データ取得中に標本が動かなかったこと、またはスキャン設定が変更されなかったことを確認します。

回転中心(COR)を計算するには、[回転の中心]タブを選択し、[自動][高品質]精度の[COR検索]オプションと[COR計算のデュアル]スライス選択を使用します。次に、「開始」をクリックして計算を実行します。CORが見つかったら、[Volume]タブをクリックして、再構築するサンプルを選択します。

サムネイルを使用して、ボリューム選択ウィンドウを編集します。次に、「開始」をクリックして再構築を実行し、3Dデータを含むボリュームファイルを作成します。RooTrak 処理可能なイメージスタックを準備するには、ファイル、インポート、Raw の順にクリックし、ボリュームファイルを選択して、ボリュームファイルを ImageJ にロードします。

根と土の間の画像のコントラストを最適化するには、[画像]タブをクリックし、[明るさ/コントラストの調整]を選択して、[自動]を選択します。関心領域がはっきりと見える場合、設定は最適化されていると見なされます。画像をJPEG、BMP、またはPNG形式の画像スタックとして保存するには、[名前を付けて保存]をクリックして[画像シーケンス]を選択します。

RooTrakで処理してルートをセグメント化するには、[ツール]タブを選択し、[トラッカー]を選択します。次に、ダイアログボックスの白い入力領域をダブルクリックして、画像スタックをロードします。画像が読み込まれたら、[トラッカー] タブを選択し、ボリューム データのトップ ビュー スライスに表示される各関連するルート セクション内のいくつかのポイントをクリックして、ルート内にシード ポイントを設定します。

トラッカー パラメーターの滑らかさを 0.3 に、類似性を 0.8 に設定します。「出力ディレクトリ」の下のフィールドをクリックして、ファイルフォルダを選択します。次に、[フォルダの選択]をクリックし、[開始]をクリックします。

その後、トラッキング機能が実行されます。これは、上の画像スライスから下のスライスまでルートをたどります。ボリュームデータを開いて表示した後、使用可能なデータ量に応じてスライス数を選択します。

ここに示す例では、トラッキングは 200 スライス (深さ 6.2 mm に相当) で停止し、ルート境界が明確に定義されていません。ImageJ でボリュームと表面の分析を実行するには、[Process]、[Binary]、[Make Binary] の順に選択して、RooTrak のイメージスタックをバイナリイメージ形式に変換します。オープン ソースの ImageJ プラグインである BoneJ を使用して、Plugins、BoneJ、Isosurface の順に選択して三角形メッシュを作成します。

開いたオプションウィンドウで、「Resampling」と「Threshold」をそれぞれ6と120に設定します。次に、「表面を表示」にチェックを入れ、「OK」ボタンを押します。開いた3Dビューアで、[ファイル]タブをクリックします。

次に、[サーフェスのエクスポート]をクリックし、STLバイナリとして保存します。最後に、IMESHJを開きます。「Select STL File」をクリックしてSTLファイルをロードし、ボクセルサイズをミクロン単位で入力します。

「Enter Voxel Size」をクリックして31ミクロンを入力し、「OK」を2回クリックします。「表面積の計算」をクリックして、サンプルルートの合計表面積を平方ミリメートル単位で取得します。次に、[ボリュームの計算]をクリックして、サンプルルートの総体積を立方ミリメートルで取得します。

ここには、在来の草原のドロップシードであるSporobolus heterolepisの2本の茎と、その周囲の元の土壌からなる標本が示されています。生成された再構成データのボクセルサイズは約31立方ミクロンでした。画像のスタックを作成し、根と土壌の間のコントラストを上げた後、再構築されたデータは、根と土壌の一部の構成成分が非常に類似したX線減衰係数を持っていることを示しました。

この図は、ボリューム データの一番上のスライスに表示される関連するルート セクション内で選択された代表的なシード ポイントを示しています。このビデオで説明したRooTrakのパラメータを使用して、RooTrakは選択した約200スライスのボリュームデータ(深さ6.2ミリメートル相当)を正常にセグメント化しました。ルートのセグメンテーションもこのアニメーションで示されています。

ここでは、ImageJを使用して、RooTrakによって生成されたデータから3Dボリュームの三角形メッシュ等値面を生成しました。使用したデフォルト設定では、詳細な等値面が比較的迅速に作成されました。最後に、IMESHJを用いて表面積を351.87平方ミリメートルと計算し、体積を47.27立方ミリメートルと計算しました。

この手順をマスターすると、適切に実行すれば5時間で完了します。この手法を試すときは、すべての安全手順に従うことを忘れないでください。また、根のセグメンテーションは、根と土壌の間に十分なX線コントラストがある場合にのみ可能であることを覚えておくことも重要です。

この手順に従うと、木の葉、動物や人間の肺など、枝分かれした構造を持つ他の標本を画像化して分析し、生体組織がどのように成長するか、特定の条件にどのように耐えるかなどの追加の質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、植物科学分野の研究者がBrachypodiumなどのモデル植物の耐乾性などを探求する道を開きます。このビデオを見れば、トモグラフィーを使用して植物標本を画像化する方法、根の構造を視覚化する方法、土壌内X線コンピューター断層撮影データから根の定量的情報を抽出する方法についてよく理解できるはずです。

X線装置の使用は危険な場合があり、この技術を試す際には関連する安全手順に従う必要があることを忘れないでください。