弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離マラリア原虫スポロゾイト
2016年5月18日
ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。
この一連の手順の全体的な目標は、放射線が弱毒化されたマラリア原虫をマウスに免疫することです。マウスの皮膚およびリンパ節の排出における骨髄系細胞の動員の解析を容易にするため。この方法は、弱毒生した生寄生虫に対する自然免疫応答に関与する細胞アクターは何かなど、マラリア分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
感染の血液粉の後18〜25日の間に、氷上の15ミリリットルのチューブに感染した蚊を集めて冷やします。次に、チューブを氷の上のシャーレに慎重に反転させ、昆虫を12キロラッドのガンマ線またはX線にさらします。照射された蚊の唾液腺を氷上の15マイクロリットルのDPBSに集めます。
次に、腺をそっと押しつぶしてスポロゾイトを解放します。高濃度の寄生虫懸濁液を少量で注入することは重要であるため、緑色蛍光の強力な発現によって証明されるように、感染性の高い蚊から十分な数の唾液腺を採取することが重要です。1.5ミリリットルの微量遠心チューブに適合した35マイクロメートルのストレーナーを介してろ過する前に、寄生虫懸濁液を再懸濁します。
顕微鏡計数チャンバーを使用して、単離されたスポロゾイトの総数をカウントし、寄生虫懸濁液を氷上の冷たいDPBS中のマイクロリットル濃度あたり10〜4番目のスポロゾイトの8.3倍に調整します。スポロゾイトを注入する前に、つま先をつまんで実験動物の適切な鎮静レベルを確認し、角膜の乾燥を防ぐための眼軟膏を塗布してください。次に、迅速に作業し、透明なテープを使用して、実体顕微鏡で耳介の腹側を優しく固定し、35ゲージの針を備えた10マイクロリットルの注射器に0.6マイクロリットルの再懸濁寄生虫を装填します。
次に、針を斜めにして、耳の背側の表皮の下に慎重に挿入し、0.15マイクロリットルのスポロゾイトをその部位に注入します。注射部位に特徴的な丘疹が観察されます。真皮をさらに3回注射した後、先ほど示したように、テープを慎重に剥がし、マウスが完全に回復するまでマウスを監視します。
スポロゾイト接種後の所望の時点で、マウスを犠牲にし、直ちに処置を開始する。マウスが臨床的死の兆候を示していることを確認してください。耳と対応する首の領域を70パーセントのエタノールで消毒します。
次に、滅菌ハサミと鉗子を使用して、ジュグロ頸動脈領域を切開します。次に、2つの鉗子で切開部を伸ばして、灰色に見えるドレインリンパ節を露出させます。リンパ節の真上にある結合組織を慎重につまんで取り除き、その下に置かれた2組目の鉗子で抽出します。
コラゲナーゼとDNaseを添加した4.5ミリリットルの標準培地を含む6ウェル組織培養プレートの1ウェルで、リンパ節を70ミクロンのストレーナーに移します。次に、接種した耳全体を採取し、2つの鉗子を使用して耳をつまんで背側と腹側に分離します。次に、耳の両側を、消化酵素を補給した培地のウェルあたり4.5ミリリットルを含む2番目の6ウェルプレートのウェルに入れ、各組織が培地に完全に浸るように注意します。
リンパ節から免疫細胞を単離するには、リンパ組織のプレートを摂氏37度、CO2を5%で穏やかに攪拌しながらインキュベートします。15分後、各ウェルに10ミリモルのEDTAを加え、プレートを氷の上に置きます。次に、リンパ節ごとに、新しい5mmシリンジプランジャーの端を使用し、円を描くようにしてリンパ節をストレーナーに押し付けて組織を解離させます。
白い結合組織だけが残ったら、FBSとEDTAを含む500マイクロリットルのDPBSでストレーナーを2回すすぎ、洗浄液を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、500マイクロリットルのサプリメントDPBSでウェルをさらに2回洗浄し、氷の上に置いたチューブに洗浄液を移します。耳から免疫細胞を単離するには、耳のリーフレットを摂氏37度と5%のCO2で穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
20分後、組織を細かく切って分解を容易にし、サンプルをインキュベーターに戻します。40分後、10ミリモルEDTAで消化を停止し、プレートを氷の上に置きます。先端がカットされた1ミリリットルのピペットを使用して、各ウェルの全内容物を70ミクロンのストレーナを含む新しいウェルに移します。
また、5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、先ほど示したように円運動で耳組織の断片を解離します。白い結合組織と髪の毛だけが残ったら、先ほど示したようにDPBSとFBSおよびEDTAでストレーナーとウェルを洗い、氷上の50ミリリットルのチューブに洗浄液をプールします。最後に、サプリメントのDPBSでウェルを2回洗浄し、氷の上に置いたチューブに洗浄液を移します。
このビデオでは、寄生虫の皮内注射の15分後に放射線減衰スポロゾイトがマウスの皮膚に移動する様子を見ることができます。皮内スポロゾイト注射の24時間後、全細胞が皮膚とドレーンリンパ節から分離されます。この図で観察されるように、皮膚およびリンパ節の骨髄細胞の頻度は、ナイーブマウスと比較して強力に増加しています。
習得すれば、スポロゾイト注射への蚊の照射のプロトコルの最初のステップは4時間で完了できます。この手順を試みる際には、蚊の唾液腺から分離されたスポロゾイトが急速に感染力を失うことを覚えておくことが重要です。したがって、できるだけ早く注入する必要があります。
このビデオを見れば、マウスの皮膚とリンパ節のドレナージから骨髄細胞を分離し、弱毒生マラリア原虫の皮内注射に対する免疫応答を調べる方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本記事では、Plasmodium sporozoites（プラズモジウム胞子体）を皮内注射した後のマウスの皮膚および排液リンパ節から骨髄系細胞を分離するためのプロトコルについて説明します。この手法により、骨髄系細胞の動員および寄生虫に対する炎症反応の解析が容易になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 寄生虫学
- 細胞生物学
背景
- マラリアに対する免疫応答を理解することは、ワクチンの開発において極めて重要です。
- 骨髄系細胞は、自然免疫応答において重要な役割を果たしています。
- Plasmodiumのスポロゾイトは、マラリア原虫の感染ステージです。
- フローサイトメトリーは、免疫細胞集団の特性解析における有用なツールです。
研究目的
- 放射線減弱Plasmodium寄生虫を用いてマウスに免疫を導入する。
- 寄生虫に対する骨髄系細胞のリクルートメントを分析する。
- 自然免疫応答に関与する細胞因子を特定する。
使用された手法
- マウスへのPlasmodium sporozoitesの静脈内注射。
- 解析のための皮膚および所属リンパ節の採取。
- 炎症反応を特性づけるためのフローサイトメトリー。
- 唾液腺を取得するための、感染蚊へのガンマ線またはX線照射。
主な結果
- マウス組織からの骨髄系細胞の分離に成功。
- Plasmodium sporozoitesに対する炎症反応の特性評価。
- 反応に関与する主要な免疫細胞集団の同定。
- マラリアに対する自然免疫のメカニズムに関する知見。
結論
- このプロトコルは、骨髄系細胞のダイナミクスを研究するための信頼性の高い手法を提供します。
- 得られた知見は、マラリア免疫学の理解に寄与します。
- ワクチン開発およびマラリア治療への潜在的な影響が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
スポロゾイト接種後の早期骨髄系細胞の動員を理解することは、マラリアに対する自然免疫活性化のメカニズム的な洞察をもたらします。本アッセイは、関連する組織コンパートメントにおける炎症細胞の動態を定量化することにより、ワクチン候補のリスク低減を可能にします。この手法は、寄生虫への曝露と皮膚および所属リンパ節における骨髄系表現型の変化を関連付けることで、ターゲットのバリデーションを支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：抗スポロゾイト免疫における骨髄系細胞の関与という治療仮説を検証する。
- 実用的価値：フローサイトメトリーを用いて、動員された免疫サブセットの表現型特性解析を可能にする。
- 科学的価値：Plasmodium曝露における主要な自然免疫因子を特定することで、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 下流の免疫プロファイリングに向けて、皮膚およびリンパ節から検証済みの生物学的システムを調製する。
- 運用的価値： 定量的な免疫応答測定のために、標準化され再現性のある細胞分離を実現する。
- 科学的価値： 一貫した骨髄系細胞の回収量と生存率により、信頼性の高い化合物またはワクチンの評価を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 皮内注射による自然なスポロゾイト送達をモデル化することで、疾患との関連性を維持します。
- 運用的価値： 免疫調節剤の発見から前臨床検証までの継続性を確保します。
- 科学的価値： myeloid細胞の動員と防御免疫を相関させることで、リスクを調整した進展をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲット検証から前臨床免疫プロファイリングに至るディスカバリー・コンティニュアムに適合し、マラリア介入策の反復的な設計を可能にします。
- 探索生物学： 寄生虫の皮膚への沈着後に起こる骨髄系細胞の動員経路に関する仮説を検証します。
- スクリーニング： 標準化された分離法を用いて、再現性のあるダウンストリーム解析が可能な、アッセイ準備済みの免疫細胞を提供します。
- 分析： 定量的なフローサイトメトリーの読み取り値を生成し、実験群間で免疫状態を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ： 一貫した組織処理を通じて、初期の免疫イベントを前臨床結果へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 皮膚病原体に対する骨髄系反応を研究するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：骨髄系細胞のダイナミクスを寄生虫への曝露と結びつけることで、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：標準化された酵素消化およびストレーナーを用いた解離により、再現性を確保します。
- 戦略的価値：関連組織における早期炎症バイオマーカーを定量化することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：骨髄系細胞の調節に基づいた、ワクチン候補のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- マウス組織の取り扱い、酵素消化、およびフローサイトメトリー調製の専門知識が必要です。
- 滅菌済みの解剖器具、ストレーナー、遠心分離機、ならびに37°Cおよび5% CO2のインキュベーション設備が必要です。
- 細胞生存率を確保するため、消化時間とEDTAクエンチングのチーム間での標準化が不可欠です。
- 実験規模を拡大する際は、蚊の感染率およびスポロゾイト回収量のばらつきを考慮する必要があります。
- 分離後のスポロゾイトは感染力が急速に失われるため、唾液腺抽出後すぐに使用するという制限があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Radiation-attentuated Sporozoite Isolation from Mosquito Salivary Glands
2:07
Sporozoite Injection
3:13
Skin and Draining Lymphs Node Dissection
4:49
Cell Isolation
7:18
Results: Intradermal RAS Injection Increases Myeloid Cell Migration to Mouse Ear Skin and dLN
8:01
Conclusion
