Name: 弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離マラリア原虫スポロゾイト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶマウスの皮膚と排出リンパノードから骨髄性細胞を単離する方法。Plasmodium sporozoitesの皮内投与後の免疫応答を解析し、マラリアの自然免疫メカニズムを解明する。

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著者らは、マウスの皮膚におけるスポロゾイトの運動性のin vivoイメージングに教えるためのパトリシアBaldacci、ヴァネッサLagalとザビーネThiberge重要な読書のために、イリーナDobrescuとザビーネThiberge写真を撮るのヘルプおよびポーリンFormaglioに感謝します。また、蚊の飼育のための生産とハマダラカ（CEPIA-パスツール研究所）の感染のためにマレックSzatanikとセンターに感謝したいと思います。この研究は、ラボラトリードール・エクセレンス &quot;新興感染症の統合生物学」（無許可。ANR-10-LABX-62-IBEID）からAX​​Aリサーチファンドと資金によってサポートされていました。

<html>すべての手順は、パスツール研究所の委員会や地元動物実験に関する倫理委員会（倫理委員IDF-パリ1、パリ、フランス、契約番号：2012から0015）によって承認された際は適用される基準および規則に従って行いました。 1.材料および試薬<ol><li>以前21記載されているように3〜5日出現とリアの後に感染したマウスを餌に女性ハマダラカ蚊（Sda500株）を使用します。 </li><li>構成的熱ショックタンパク質70（HSP70）プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を発現する寄生虫原虫ベルゲイ ANKAクローンを使用します。これは、寄生虫のライフサイクル22を通して明るい蛍光が得られます。 </li><li>雌のC57BL / 6JRjマウス（7週齢）を使用します。 注：記載されているプロトコルで使用されるすべての試薬 ​​は、 マテリアル/機器のできる Tに記載されています。 </li></ol>_title &quot;&gt; 2。蚊唾液腺からの放射弱毒化スポロゾイトの単離<ol><li>感染血液食事の後18-25日の間、収集し、以前に21記載されているように氷上で15 mlのチューブに蚊をコールド麻酔。慎重にチューブを反転させてペトリ皿に移します。氷の上で昆虫を維持し、γ-又はX線照射の12 kradの線量に蚊を公開します。 </li><li>以前に21を説明したように、照射蚊の唾液腺からの弱毒化スポロゾイトを分離します。氷上で1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の（15μL程度）小音量で感染した唾液腺を収集し、静かにスポロゾイトを解放するためにそれらをつぶします。 注：彼らの強い発現によって証明されるように重要では小容量で高濃縮寄生虫懸濁液の注入は、事前に選択され、十分に感染した蚊の数が多いから、唾液腺の十分な数を収穫することが不可欠です緑色蛍光。 </li><li>塊と蚊の破片を除去するために、低接着1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに適合した35μmのセルストレーナーキャップを介してスポロゾイトサスペンションをフィルタリングします。 </li><li>以前に21を説明したように、単離されたスポロゾイトの合計数をカウントし、83,000スポロゾイト/μLを得るために、冷1×DPBSで寄生虫懸濁液の濃度を調整します。次のステップを継続しながら氷上で寄生虫を保管してください。 </li><li>ネガティブコントロールとして使用される非感染蚊から唾液腺の同等の数を収集し、手順2.2と2.3で説明したようにサンプルを処理します。懸濁液中の唾液腺抽出物の類似の濃度を得るために、上記のように試料を希釈します。 注：スポロゾイトは、2時間の最大氷上で保存することができます。しかし、理想的にはそれらは唾液腺を粉砕後1時間以内に注入されています。 </li></ol>皮膚ラへのスポロゾイトの3インジェクション耳のヤー<ol><li>ケタミンの腹腔内注射によって動物を麻酔（50mg / kgの）/キシラジン（5mg / kg）の混合物。マウスは無意識の状態であることと、角膜の乾燥を防ぐために、眼に眼軟膏を適用するために5-8分待ちます。両方のリアの足に優しいつま先のピンチを実行することによって、麻酔の深さを評価します。 注：麻酔の投与量は、20分未満継続するので、次のステップが迅速に行わなければなりません。 </li><li>以前に実体顕微鏡（ 図1A）下に置かれた明確なテープで腹側を固定することにより、マウスの耳介を安定させます。優しく血管系の損傷を避けるために、耳を押します。 </li><li>再懸 ​​濁した寄生虫10の0.6μlの10μlのシリンジ/ 35ゲージの面取り針をロードします。 </li><li>表皮の下に、注意深く耳（ 図1A）の背側に針を挿入することにより、4注射部位（部位あたり0.15μL）でスポロゾイトサスペンションを提供し、とベベルアップ、任意の血管を避けるように注意しながら。針は、それを削除する前に、注入物質の逆流を防止するために数秒のために真皮内に残ることを許可します。手順（ 図1Bおよび1C）の最後に各注射部位の特性丘疹を観察します。 </li><li>注入後、慎重にテープから耳を削除します。 </li><li>手順3.2から3.4に従うことによって寄生虫の同用量と反対側の耳に注入します。 </li><li>単独の注射と真皮における蚊材料の堆積によって媒介される炎症反応を評価するために、1×DPBSの0.6μlあるいは非感染蚊から1×DPBS +唾液腺抽出物0.6μlのいずれかでの2つの追加のマウスを注入します。 </li><li>ケージに戻ってそれを置く前に、麻酔からのマウスの回復を監視します。 注：皮膚における適切なスポロゾイト堆積は、蛍光顕微鏡検査（ 図2Aおよび図2Bによってモニターすることができますprevisously 23記載されているように）、マウスを用意しています。 </li></ol> 4.皮膚及び流入領域リンパ郭清<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 25 mMの400 U / mlのコラゲナーゼおよび50μg/ mlのデオキシリボヌクレアーゼ（DNアーゼ）を補充した4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、次のように標準培地（SM）を調製。 </li><li> DLNサンプル用ウェル当たり4.5ミリリットルSM +70μmのセルストレーナー（プレートA）および皮膚サンプル用ウェル当たり4.5ミリリットルSM（プレートB）と氷上で2 6ウェル平底組織培養プレートを準備します。 </li><li>スポロゾイト接種後の所望の時点では、ケタミン（125mgの/キログラム）/キシラジン（12.5ミリグラム/キログラム）混合前に頸椎脱臼の腹腔内注射によってマウスを麻酔。マウスは臨床死の兆候を示しているとすぐに解剖を開始していることを確認します。 注：骨髄細胞動員の動態は、INJ後の異なる時点で検査することができますection（以前に14を説明するように、すなわち 2時間、4時間および24時間）。 </li><li>汚染の可能性を減少させるために70％エタノールを接種し、耳と対応するネック領域を消毒します。 </li><li>滅菌はさみやピンセットを用いて、無菌的に周囲の脂肪を収集せずに、近位耳のDLNを分析。 jugulo-carotidian溝の最初の切開を行い、手術現場から毛を取り除きます。周囲の組織に比べて灰色がかった表示されますDLNを露出させるために2鉗子で切開を伸ばします。 </li><li>その除去を容易にするために鉗子でDLNの上に慎重に結合組織を挟みます。リンパ組織（ 図3Aおよび3B）の下に鉗子を置くことによってDLNを抽出します。よく含む4.5ミリリットルSM +70μmのセルストレーナー（プレートA）にDLNを置きます。 </li><li>無菌鋭いハサミやピンセット（ 図4A）を使用して、全体の接種耳を収穫。 SEPARピンチと2鉗子（ - 4E 図4B）で終わるカットを離間さによって耳の背側と腹側の側面を食べました。両方の組織は完全培地中に浸漬されていることを確認することも含む4.5ミリリットルSM（プレートB）にそれらを配置します。 注：実験の信頼性を向上させ、関心対象の細胞の数を増加させるために、プール2は、サンプルあたり同じマウスからの耳又は2 dLNs注入しました。 </li><li>耳と1×DPBSまたは唾液腺抽出物のいずれかを接種したマウスのdLNs並列に収穫し、処理。負の単一の染色補正コントロールのナイーブマウスから採取した2つの追加の耳とリンパ節サンプルを含みます。 </li></ol>リンパ節から5細胞の単離<ol><li>穏やかな攪拌下で15分間、37℃+ 5％CO 2でのリンパ節（プレートA）にインキュベートします。コラゲナーゼおよびDNアーゼACTIを中和するために、ウェルあたり10 mMの最終エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を追加vities。氷の上で次の手順を実行します。 </li><li> 5mLのシリンジプランジャーの先端を用いてリンパ節を解離します。残っているすべてのまでストレーナーに対して円運動でEnterキーを押して、白の結合組織です。 </li><li> 500μlの1×DPBS + 2％ウシ胎児血清（FBS）+ 2mMのEDTAで二回セルストレーナーを洗浄します。 15ミリリットルチューブにウェルのボリューム全体を転送します。 </li><li> 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAでも二回を洗浄し、15ミリリットルチューブにボリュームを移します。氷の上にチューブを保管してください。 </li></ol>耳の皮膚から6細胞の単離<ol><li>穏やかな攪拌下で1時間、37℃+ 5％CO 2で耳のリーフレット（プレートB）をインキュベートします。 注：インキュベーションの20分後、組織消化を促進し、残りの40分間バックインキュベーター内のサンプルを入れて小片にハサミで耳のリーフレットを切りました。単一細胞はインキュベーション時間の終了時に培地中に観察することができます。 </li><li> 10mMの最終を追加<html>ウェルあたりEDTA、コラゲナーゼおよびDNアーゼ活性を中和します。氷の上で次の手順を実行します。 </li><li>耳組織断片とよく1ミリリットルピペットを用いて、70μmのセルストレーナーを含む新しい培地中の全容量を転送します。より簡単に耳組織断片を収集するためにチップの先端から2〜3ミリメートルをカット。 </li><li> 5ミリリットルの注射器プランジャの先端を使用して、耳の組織断片を解離します。残っているすべてのまでストレーナーに対して円運動でEnterキーを押して、白の結合組織です。 </li><li> 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAで二回セルストレーナーを洗浄します。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを介して50ミリリットルチューブに入ってものボリューム全体を転送します。 </li><li> 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAとをよくすすぎ、50ミリリットルチューブにボリュームを移します。チューブを氷上に保管してください。 注：皮膚およびDLN組織から全細胞を分離する別の手順を図5にまとめます。 </li></ol>タイトル &quot;&gt; 7。数及び採取した細胞の生存率<ol><li> 4℃で450×gで5分間、皮膚とDLNサンプルを遠心分離し、上清を捨てます。静かに300μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAでペレットを再懸濁。 </li><li>血球計数器を用いて皮膚及びDLNから単離された細胞の総数をカウントするために、各試料の少量を収集します。細胞生存率を決定するために、0.04％トリパンブルーを追加します。 </li></ol>非8.ブロッキング抗原特異的結合<ol><li>非標識CD16 / CD32のFc-ブロック抗体10μg/ mlを追加します。 （長く行くことができます）、4℃で20分間インキュベートします。 </li><li>冷たい1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAの2ミリリットルを追加します。 4℃で450×gで5分間サンプルを遠心し、上清を捨てます。静かに+ 2％FBS + 2mMのEDTA300μlの1×DPBSでペレットを再懸濁し、氷上でサンプルを維持します。 </li></ol> 9.染色皮膚及びリンパ節骨髄細胞<ol><li>以前にブロックされたスキーをインキュベートn及びDLNライブ/デッド・トラッカー（ すなわち 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールまたはDAPI）、抗CD45および抗CD11b特異的抗体で細胞を単離しました。 注意：利息の骨髄細胞亜集団、特に希少なものを豊かにするためには、CD45 +細胞およびリンパ球は、それぞれ皮膚から精製することができるか、細胞選別を容易にする磁気ビーズによってDLNから枯渇。 DLNから単離された細胞のほとんどがCD45 +であるので、抗CD45の使用は必須ではありません。他のマーカーは、正または負のゲーティング戦略により対象の骨髄細胞の亜集団を同定するために含めることができます。このプロトコルでは、DLNに動員骨髄細胞を、CD8α+細胞（全T細胞コンパートメントは、抗CD3特異的抗体を用いて標的とすることができる）を除くことによって濃縮しました。 </li><li>暗所で4℃で30分間インキュベートします。 500μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTA、遠心分離機4℃で450×gでサンプル5分を追加し、supeを捨てますrnatant。二回洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> 300μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAを含む試料を再懸濁します。 35μmのセルストレーナーを通してFACSチューブにボリューム全体を転送します。 100μlの1×DPBS + 2％FBS + 2mMのEDTAでフィルターを洗浄します。 </li><li>フローサイトメーターで染色した細胞を実行します。死細胞とダブレットを排除する-ゲートは、単一細胞（FSC-W DAPI）を生きます。プロットCD45 +のCD11b +皮膚（ 図6A）のためのイベントと（CD45 +）CD8α - DLN（ 図6B）のためのCD11b +イベント。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

全スポロゾイトマラリアワクチンを用いたヒトの大規模なワクチン接種の観点では、克服すべき主な課題の一つは、成功した免疫化および保護24,25を確実にするために最適化された経路および寄生虫投与方法を開発することです。ヒトでは、生きた弱毒寄生虫（LAP）によって媒介される防御効果の評価は、自然蚊に刺さ2と同様に、皮内、皮下25,26およびIV免疫化の27以下の行われています。げっ歯類28および非ヒト霊長類25に報告されているように、LAPのIV投与は、上記の経路に比べてより強い防御免疫応答を誘導します。それにもかかわらず、針と注射器を使用して、管理の非IVルートはまだ人間の質量予防接種のために、より適したままで、努力は現在、彼らの防御効果を最適化するために行われています。 マウスで行われた最近の研究で実証します特にIDルートの場合はD、より大きな容量で希釈した寄生虫の単回接種と比較して、複数の注入部位（4ポイント）が有意に増加した寄生虫の感染性のスポロゾイト...

マラリアは年間50万人以上を殺害し、世界最悪の感染症の一つです。 マラリア原虫 、疾患の原因物質による感染は、前赤血球（PE）相によって開始されます。このフェーズでは、雌ハマダラカ蚊によって宿主の皮膚に注入されたスポロゾイトは、血流を介して肝臓に到達し、赤血球に感染し、疾患の症状を引き起こす寄生形態に内部に肝細胞を区別する。 マラリア原虫のPE段は、抗マラリアワクチン接種のための特権標的を表します。実際、このような放射線弱毒化スポロゾイト（RAS）などのこれらのステージに対する弱毒化ワクチンを、生きて、遺伝的に逮捕された寄生虫（GAP）または化学的予防及びスポロゾイト（CPS）は、げっ歯類とヒト宿主1-9の両方を保護する能力を実証しています。齧歯類モデルでは、ほとんどのワクチン接種研究は、静脈内免疫を利用して行われます、防御効力の点でゴールドスタンダードです。しかし、皮膚のステージの説明と保護を誘発するのに皮膚関連の流入領域リンパ節（DLN）の重要性は、PE相の私達の認識を変え、注入の皮内経路の重要性を強調しています。 P.の生体内イメージングげっ歯類の皮膚に注入ベルゲイのスポロゾイトは、接種物のみ〜25％が血流を介して肝臓に到達したことを示しています。残りの〜75％は、近位DLN（〜15％）と少量変換し、皮膚細胞12,13の内側週間生きている残ることができる皮膚（〜50％）10,11、の間で分配します。また、その後の研究は、皮内免疫化後の効果的な防御免疫の確立は、主に寄生虫特異的CD8 + T細胞が14,15脾臓または肝臓-dLNsにわずかしか活性化され、皮膚DLNに起こることを説明しました。 同時にほとんどの研究は、はるかに少ない皮膚に注入生きた弱毒寄生虫、先天性免疫系との特にそれらの相互作用の運命について知られている、防御免疫応答の確立に関与するエフェクター細胞の特徴付けに集中しています。具体的には、CD8 + T細胞への寄生虫抗原取り込み、プロセシングおよび提示に関与する抗原提示細胞の特徴付けは、PE抗原捕捉は、皮膚及びDLNコンパートメントの両方において発生する可能性があることを知って、非常に重要です。前の生体内イメージング研究は、スポロゾイトと樹状細胞との間の初期の相互作用がDLN 10,17で観察された感染蚊に刺され16次肌に明るい蛍光のLys-GFP陽性細胞の早期流入を説明しました。より最近では、蚊によって皮膚に接種スポロゾイトは、皮膚の両方の樹状細胞および制御性T細胞の運動性を増大させることが報告されていますマウスを、抗原提示細胞の減少数は、DLN 18で観察されました。 我々は、白血球の皮膚とそれに対応するDLNで募集サブセットだけでなく、RAS 19の用量を免疫の皮内注射後の寄生虫と相互作用するものを同定し、より正確に定量化することを目的としました。この文脈において、我々は両方の組織から骨髄細胞（CD45 +のCD11b +）を単離し、マルチ=パラメトリックフローサイトメトリーによって関心の亜集団を特徴とします。 リーシュマニアの主要な皮膚感染20の初期の段階で説明した免疫応答と一致して、注射をスポロゾイトする主な宿主応答は、炎症性単球（CD45 +のCD11b続い多形核好中球（CD45 +のCD11b + Ly6G + Ly6C int型 ）の連続した募集で構成されてい+ Ly6G - differentiに基づいて識別されているLy6C +）Ly6GおよびLy6C表面マーカーのアル表現。 ここでは、感染した蚊の唾液腺から抽出されたRASの用量を免疫の皮内注射後のマウスの皮膚とDLNから骨髄細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。再現性の皮内注射し、組織処理は、感染組織内の細胞集団を浸潤の表現型の変化を定量化するための重要なステップです。以下に詳述するアプローチは、皮膚やマラリア原虫にDLN炎症反応を評価するための信頼性の高いアッセイを提供し、様々な実験系に拡張することができます。

<table><tbody><tr><td>ケタミン:イマルゲン&reg; 1,000</td><td></td> <td>Merial-50</td> <td>mg / kg:以前のスポロゾイト注射

125 mg / kg:事前の犠牲</td></tr><tr><td>キシラジン:ロンプン&reg; 2%</td><td>バイエル</td><td>-</td><td>5 mg / kg:以前のスポロゾイト注射

12.5 mg/kg: 事前犠牲</td></tr><tr><td>NanoFil シリンジ + 35 ゲージ針</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>オムニカン&reg; 50インスリン注射器 0.5ml/50 I.U.</td><td>B.ブラウンメディカル&nbsp;</td><td></td><td>9151125-MultiwellTM</td></tr> <tr><td>6ウェル組織培養プレート &ndash;フラットボトム</td><td>BDファルコン&nbsp;</td><td></td><td>353046-70</td></tr> <tr><td>& マイクロ;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>BDファルコン&nbsp;</td><td>352350-2</td><td></td></tr> <tr><td>ml シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-02S-BLUE</td><td></td></tr> <tr><td>MAXTM 15 ml ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>BD ファルコン&nbsp;</td><td></td><td>352097-BLUE</td></tr> <tr><td>MAXTM 50 ml ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>BD ファルコン&nbsp;</td><td></td><td>352098-5</td></tr> <tr><td>ml ポリスチレン丸底チューブ 35 &micro;m セルストレーナーキャップ</td><td>BD ファルコン&nbsp;</td><td></td><td>352235-DPBS</td></tr> <tr><td>1x CaCl2- および MgCl2--free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021-Clostridium</td><td></td></tr> <tr><td>histolyticum 由来コラゲナーゼ、IV 型 0.5-5.0 FALGPA 単位/mg 固体&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ膵臓IV型由来のデオキシリボヌクレアーゼI&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 & マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM または 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500-HEPES</td><td></td></tr> <tr><td>緩衝液 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>希釈率 1:10&nbsp;</td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32(2.4G2クローン)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &micro;g/ml 最終 (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPureTM グレード</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>final 抗マウス CD45 (30-F11 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&nbsp;希釈率1:200</td></tr><tr><td>抗マウスCD11b(M1/70クローン)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&nbsp;希釈 1:400</td></tr><tr><td>抗マウス CD8&alpha;(5H10クローン)</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>MCD0830</td><td>&nbsp;希釈率 1:100</td></tr><tr><td>雌 C57BL/6JRj マウス (7週齢)&nbsp;</td><td>ジャンヴィエ研究所</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

マラリア原虫のスポロゾイト段階は、蚊に刺さを介して哺乳動物宿主の皮膚に接種されたときにマラリア感染が開始されます。非常に運動性の寄生虫は、肝細胞に侵入し、赤血球感染形式に変換するための肝臓に到達していないだけ。それはまた、皮膚に、それが認識され、居住者及び/又は動員骨髄系細胞によって分解することができる注射部位を、排出近位リンパ節に移動します。生体内イメージングは、明るい蛍光のLys-GFP陽性の皮膚中の白血球および排出リンパ節におけるスポロゾイトおよびCD11c +細胞間の相互作用の早期動員を報告しました。ここでは、回復特定し、マウスの皮膚に動員し、マウスモデルにおいてスポロゾイトの投与量を免疫の皮内注射後のリンパ節を排出している骨髄細胞サブセットを列挙するための効率的な手順を提示します。表現型の特徴用いたマルチパラメトリックフローサイトメトリー提供しますマラリア原虫感染に対する炎症反応の初期にダイナミックな細胞変化を評価するための信頼性の高いアッセイ。

我々は最近、Pの免疫化用量の針注射器注入を実証しましたマウス皮膚におけるベルゲイのスポロゾイトは、皮膚やDLN 19における炎症性単球が続く多形核好中球の連続的な動員を誘導します。プロトコルセクションは、耳の真皮（図1及び2）でスポロゾイトの多数の複数回の注射以下の両方の組織からのライブ骨髄細胞を正常に分離するために使用される手順を詳しく説明し、上記の。マルチパラメトリックフローサイトメトリーによる細胞浸潤を分析するために、図5にまとめたように最初の24時間以内に、DLN（図3）および皮膚注射部位（図4）を単離し、処理しました。全体的に、この技術は、私たちは平均10 4 CD45 +のCD11b + 2.10 4のCD11b +ライブ単一細...

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

一連の手順の全体的な目的は、放射線減弱プラズモジウム寄生虫をマウスに免疫させることです。これにより、マウスの皮膚および所属リンパ節における骨髄系細胞の動員解析を容易にします。本手法は、生減弱寄生虫に対する自然免疫応答に関与する細胞因子は何かという、マラリア研究分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。感染後の吸血から18〜25日後に、感染した蚊を15 mLチューブに回収し、氷上で冷麻酔を行います。次に、チューブを氷上のペトリ皿に慎重に反転させ、昆虫に12 kradのガンマ線またはX線照射を行います。照射後の蚊の唾液腺を、氷上の15 µLのDPBSで回収します。その後、腺を穏やかに押し潰してスポロゾイトを放出させます。少量の液量で高濃度の寄生虫懸濁液を注入することが極めて重要であるため、強い緑色蛍光の発現によって確認された、十分に感染した蚊から十分な数の唾液腺を回収することが重要です。1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに装着した 35 micrometer ストレイナーでろ過する前に、寄生虫懸濁液を再懸濁させてください。顕微鏡用血球計算盤を用いて、単離されたスポロゾイトの総数を計測し、氷上の冷DPBSを用いて寄生虫懸濁液の濃度を8.3 × 10⁴ sporozoites/µLに調整する。スポロゾイトを注入する前に、足指つまみ法により実験動物の鎮静レベルが適切であることを確認し、角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布する。その後、迅速に操作を行い、実体顕微鏡下で耳介の腹側を透明テープで軽く固定し、35G針を装着した10 µLシリンジに、再懸濁した寄生虫液0.6 µLを充填する。次に、針の斜面を上に向け、耳の背側の表皮下に慎重に挿入し、0.15 µLのスポロゾイトをその部位に注入します。注入部位には特徴的な丘疹が観察されます。今デモンストレーションしたように真皮への注入をさらに3回繰り返した後、慎重にテープを取り除き、マウスが完全に回復するまで観察します。スポロゾイト接種後の所定の時点でマウスを安楽死させ、直ちに処置を開始します。マウスに臨床的な死亡の兆候があることを確認してください。耳および対応する頸部領域を70%エタノールで消毒します。次に、滅菌済みの鋏とピンセットを使用して、頸頸動脈領域を切開します。その後、2本のピンセットで切開部を広げ、灰色に見える排泄リンパ節を露出させます。リンパ節の直上にある結合組織を慎重に挟んで取り除き、その下に配置した2組目のピンセットでリンパ節を摘出します。リンパ節を、コラゲナーゼおよびDNaseを添加した4.5 millilitersの標準培地を含む6ウェル組織培養プレートの1ウェル内の70 micronストレーナーに移します。次に、接種した耳全体を採取し、2本のピンセットで耳を挟み、背側と腹側に分離します。その後、耳の各側を、消化酵素を添加した培地を1ウェルあたり4.5 milliliters含む2枚目の6ウェルプレートのウェルに入れ、各組織が培地に完全に浸っていることを確認してください。リンパ節から免疫細胞を単離するために、リンパ組織が入ったプレートを37°C、5% CO2の条件下で穏やかに撹拌しながらインキュベートします。15分後、各ウェルに10 mM EDTAを加え、プレートを氷上に置きます。次に、各リンパ節について、新しい5 mmシリンジプランジャーの先端を用い、円を描くようにリンパ節をストレーナーに押し付けて組織を分散させます。白い結合組織のみが残ったら、FBSおよびEDTAを含むDPBS 500 µLでストレーナーを2回すすぎ、洗浄液を15 mLコニカルチューブに移します。次に、添加剤入りDPBS 500 µLでウェルをさらに2回洗浄し、洗浄液を氷上に置いたチューブに移します。耳から免疫細胞を分離するために、耳介を37 °C、5% CO2の条件下で緩やかに攪拌しながらインキュベートします。20分後、組織を消化しやすくするために小さく裁断し、サンプルをインキュベーターに戻します。40分後、10 mM EDTAを用いて消化を停止させ、プレートを氷上に置きます。チップの先を切断した1 mLピペットを使用して、各ウェルの全内容物を、70 µmストレーナーが入った新しいウェルに転送します。そして、先ほど実演したように、5 mLシリンジのプランジャーを使用して、円を描くように動かして耳組織の断片を分散させます。白い結合組織と毛だけが残ったら、先ほど実演したように、FBSとEDTAを添加したDPBSでストレーナーとウェルを洗浄し、洗浄液を氷上の50 mLチューブに回収します。最後に、添加剤入りDPBSでウェルを2回洗浄し、その洗浄液を氷上のチューブに移します。このビデオでは、寄生虫を皮内注射して15分後のマウス皮膚への放射線減弱スポロゾイトの遊走を確認できます。スポロゾイトの皮内注射から24時間後、皮膚および排泄リンパ節から全細胞を単離します。この図で観察されるように、皮膚および排泄リンパ節における骨髄系細胞の頻度は、ナイーブマウスと比較して顕著に増加しています。蚊の放射線照射からスポロゾイトの注入までのプロトコルの初期段階に習熟すれば、4時間で完了させることができます。この操作を行う際は、蚊の唾液腺から分離されたスポロゾイトは急速に感染力を失うことを念頭に置くことが重要です。したがって、可能な限り速やかに注入する必要があります。このビデオを視聴することで、生減毒プラズモジウム原虫の皮内注射に対する免疫応答を探索するために、マウスの皮膚および所属リンパ節から骨髄系細胞を分離する方法について十分に理解することができます。

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。...

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

このビデオは、マウスでMycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin...

感染マウスのドレナージリンパ節への皮膚樹状細胞の移動を監視するためのCFSEベースのアッセイ

このビデオは、弱毒化した生きたスポロゾイトでマウスモデルを免疫するためのアッセイを示しています。放射線が弱毒化されたマラリア原虫スポロゾイトは、マウスの耳の背側に注入されます。両耳の複数の場所に注射した後、マウスは回復します。...

マウスモデルにおける生弱毒スポロゾイトによる皮内免疫

予防的および治療的ワクチン接種は、多くの場合、週のリンパ節へのワクチンの排水および免疫細胞の関与の結果として、乏しいによる強力な免疫応答を刺激することができない。リンパ節へのワクチンの直接注射することによって、いわゆるリンパ内注射は、ワクチンの有効性を強く改善することができ、ワクチン用量を低減することができる。...

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炎症部位でのCD4エフェクターT細胞の間質運動を支配するメカニズムは、比較的知られていません。我々は、in vitroで視覚化して操作するための非侵襲的なアプローチは、その場でこれらの細胞の動的挙動の研究を可能にする、炎症を起こした耳の真皮中のCD4 T細胞を-primed提示します。...

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弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離

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