開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニックアフリカツメガエル腎臓

この手順の全体的な目標は、発育中のキセノプス腎臓にマイクロインジェクションを標的とすることです。この方法は、腎臓がどのように形成され、このプロセスにどの遺伝子が重要であるかなど、発生生物学の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、標的組織へのマイクロインジェクション試薬の送達を最大化することです。

この分析法の可視化は、標的マイクロインジェクションに適した割球の同定が重要であるため、重要です。この手順を開始するために、両方の精巣を1匹のオスのカエルから分離し、10ミリリットルの精巣保存溶液で満たされた60ミリメートルのシャーレに入れました。次に、精巣を摂氏4度で保存します。

次に、100ミリメートルのシャーレでメスのカエルから卵を採取しました。ペトリ皿から余分な水を注ぎます。その後、精巣保存ソリューションで精巣の4分の1を切り取りました。

精巣の一部を卵の入ったシャーレに移します。続いて、精巣部分を細かく切ります。MMRとゲンタマイシンをシャーレに加え、卵を覆います。

皿を回して混ぜ合わせ、室温で受精が行われるまで約30分待ちます。受精後、胚の色素沈着面が上を向いている必要があります。トランスファーピペットを使用してペトリ皿からMMRを取り出し、胚を覆うのに十分なデゼリー溶液を追加します。

その後、次の数分間皿を回転させて、胚のゼリーコートを溶かします。胚が皿の中央で互いに密接に接触すると、ゼリーコートが取り除かれます。デゼリー溶液をトランスファーピペットで取り出します。

次に、脱ゼリー状の胚をMMRとゲンタマイシンで3〜5回洗浄し、MMRを慎重に注ぎ、新しいMMRを皿に充填します。胚を損傷する可能性のあるMMRをすべて皿から取り出さないでください。その後、未受精卵や精巣片をシャーレから取り出します。

それらの成長をずらすには、1回の受精からの胚の半分を摂氏14度に保たれたシャーレに入れ、残りの半分の胚を摂氏18度に保ったシャーレに入れます。胚は、摂氏18度よりも摂氏14度でゆっくりと成長します。1つの施肥クラッチから複数のセットの注射が可能です。

ポイントゼロをナノリットルあたり1ナノグラムの膜結合赤色蛍光タンパク質mRNAを含む注射液を調製します。胚が4細胞または8細胞の段階に発達している間。注射液は使用するまで氷の上に置いてください。

次に、7インチの交換用ガラスキャピラリーチューブを、交換用チューブの上部をニードルプーラーケースの上部に合わせた状態でニードルプーラーにロードします。熱番号2の値を800に、プル値を650に設定し、プルボタンを押して針を引っ張ります。その後、引っ張った針の先端をデュモン鉗子で切り取ります。

マイクロピペットコレットを針の裏に滑り込ませます。次に、大きな穴のOリングをコレットの後ろの針の後ろに滑り込ませます。次に、27ゲージの皮亢進針を使用して、針に気泡が入らないように注意しながら、針にミネラルオイルを充填します。

針をマイクロインジェクターのプランジャーに滑り込ませ、プランジャーに取り付けられた白いプラスチックスペーサーの大きな穴に針を固定します。コレットを締めて針を固定します。次に、マイクロインジェクターコントロールボックスの「空」ボタンをビープ音が2回鳴るまで押し続けます。

その後、3マイクロリットルの注射液をパラフィルムにピペットで移します。その後、パラフィルム上の注射液のビーズに針先を挿入します。マイクロインジェクターコントロールボックスの「充填」ボタンを押し続けて、注入液を針に引き込みます。

マイクロインジェクションの前に、Xenopus胚の初期の細胞分裂を理解することが重要です。単細胞胚は、暗く色素沈着した動物の極と、白くてヨーキーな植物性の極を持っています。2細胞胚では、最初の切断は通常、胚の左側と右側の間で発生します。

これらの細胞は、前腎系譜に等しく寄与します。2番目の卵割は、胚の背側半分と腹側半分を分割し、4細胞胚につながります。背側細胞は腹側細胞よりも小さく、色素が少ないです。

4細胞胚に注入する場合は、左腹割球を注入して左腎臓を標的にします。3番目の劈開は、動物側と植物側を二分します。その結果、8細胞の胚が生まれました。

この時点で、4つの動物割球と4つの植物割球があります。8細胞胚の左腎臓を標的とするには、左腹側植物割球に注入します。続いて、500ミクロンのポリエステルメッシュで裏打ちされた60ミリメートルのシャーレに、MMRとゲンタマイシンの5%フィコールを充填します。

20〜30個の8細胞胚を慎重にピペットで皿に入れます。ヘアループを使用して、注入する割球が針に向くように胚を操作します。左腎臓を標的にするには、8細胞胚の左腹側植物割球が針を向くように胚を並べます。

皿の各胚の選択された割球に10ナノリットルの注入溶液を注入します。次に、注入した胚を、MMRとゲンタマイシンに5%のfycolを添加した培養プレートのウェルに移します。注入した胚を摂氏16度で約1〜2時間インキュベートして、注入した割球が治癒するのを待ちます。

その後、マイクロインジェクションした胚を、MMRとゲンタマイシンを充填した培養プレート内の新しいウェルに移します。胚がステージ38から40に達するまで、摂氏14〜22度で胚をインキュベートします。この手順では、10〜20ステージ38〜40の胚をガラスバイアルに移します。

バイアルに100%エタノール中の5%ベンゾカインを10マイクロリットル加えます。バイアルを反転させて混合し、10分間待って胚を麻酔します。次に、バイアルからMMRを取り出し、MEMFAで満たします。

その後、立体的なロッキングプラットフォームに室温で1時間置きます。1時間後、バイアルからMEMFAを取り出し、100%メタノールで満たします。次に、バイアルを3次元のロッキングプラットフォームに室温で10分間置きます。

この洗浄手順をもう一度繰り返し、胚を100%メタノールで摂氏マイナス20度で一晩保存します。これで胚が固定され、免疫染色の準備が整いました。この概略図は、膜結合赤色蛍光タンパク質mRNAをトレーサーとして使用して、8細胞段階でXenopus胚の左プロネフロを標的とするためにどの割球を注入するかを示しています。

左腹側植物割球への注射後のトレーサーの所在は赤で示され、腎臓は緑でラベル付けされています。この画像は、腎臓が抗体3G8および4A6で緑色に染色されたことを示しています。これは、トレーサーの非依存性を示す腎臓領域のクローズアップビューであり、これはトレーサーと腎臓との共局在を示すマージされた画像です。

ここに示されているのは、3G8および4A6で染色された2番目の胚の腎臓の共焦点画像です。これは、腎臓および周囲の組織における赤色トレーサーの局在であり、これは腎臓におけるトレーサー3G8および4A6の共局在を示す結合画像です。この手順を実行する前に、初期のXenopus胚に精通することが重要です。

これにより、確立されたXenopusフェードマップを通じてマイクロインジェクションを適切にターゲットにすることができます。一度習得すると、この技術は神経管や心臓などの他の組織を標的にするように適応させることができます。