シトクロムをカプセル化

本手順の全体的な目的は、シトクロムcをシリカゾルゲルに封入することです。これらのゲルを超臨界処理してバイオエアロゲルを形成し、これらのバイオエアロゲルを用いて気相反応を通じて一酸化窒素を迅速に認識させます。この手法は、高度に多孔質なエアロゲルに封入された際にシトクロムcが活性を維持するためにどのような条件が必要かなど、バイオセンシングおよびバイオ分析分野における重要な課題の解決に寄与します。

この手法の重要性は、これまでタンパク質の封入が困難であったマトリックスに、タンパク質を封入するための簡便な手順であるという点にあります。この方法はシトクロムcに関する知見を提供すると同時に、将来的なバイオ分析デバイスへの応用が期待される、エアロゲルへの他のタンパク質の封入に向けた手順の開発につながる可能性があります。シトクロムcの濃度が0.7から1 mMの範囲となる溶液を調製してください。

テキストプロトコルに記載されている通り、希釈した 0.105 millimolar シトクロムc溶液を用意します。次に、使い捨ての 50 milliliter ポリプロピレンビーカーに「ビーカーA」とラベルを貼ります。ビーカーを分析天秤の皿の上に置き、ガラス製パステールピペットを用いて 1.88 grams のテトラメトキシシランをビーカーに加えます。天秤をゼロ点調整します。

次に、2.88 gのメタノールをビーカーAにピペットで分注します。ビーカーAをパラフィルムで密閉します。その後、ビーカーBとラベルを貼った使い捨ての50 mLポリプロピレン製ビーカーにマグネチックスターラーバーを加え、分析天秤のパンの上に置きます。ガラスピペットを用いて、0.75 gの水と3.00 gのメタノールを加え、ビーカーBをパラフィルムで密閉します。

ドラフト内にて、スターラーを用いてビーカーBの内容物を攪拌し始めます。次に、シリンジを使用して、パラフィルムのカバー越しに28.0～30.0%の水酸化アンモニウム溶液5 µLを混合液に注入し、攪拌を続けます。この操作が完了しだい、ビーカーAの内容物をビーカーBに加えます。パラフィルムで蓋をしたまま、混合液を20分間攪拌します。

シリカゾル混合液を撹拌している間に、ポリプロピレン製シンチレーションバイアルを8〜9本と、対応するキャップを用意します。バイアルのキャップ端にプラスチックラップを被せ、ゲルが形成されるための平坦な面を作り、その上からキャップを被せて固定します。

プラスチックラップがキャップの中で外れないように注意します。バイアルを、キャップ側をベンチトップに向け、開口部のある底側を上にして並べます。次に、各バイアルを覆うのに使用するパラフィルムをカットします。

ゾルの混合が完了したら、清潔な使い捨て50 milliliterポリプロピレンビーカーに、ゾル混合液を3 milliliters分加えます。ガラス製パステールピペットを使用し、0.105 millimolarに希釈したシトクロムc溶液500 microlitersを、ビーカーの壁面に沿って約1分かけて3 milliliterのゾル混合液の中に非常にゆっくりと滴下します。大きな赤色の凝集塊の形成を防ぐため、シトクロムcを加える際は混合液を静かに回旋させてください。

得られたシトクロムcシリカゾルを、準備した各型に0.5 millilitersずつピペットで分注します。また、超臨界乾燥工程での対照試料とするため、残りのプレーンシリカゾルを1〜2個の型に0.5 millilitersずつ分注します。型の開口部をパラフィルムで密閉し、冷蔵庫に一晩、または少なくとも12時間保管してゾルゲルを形成させます。

金型を冷蔵庫から取り出します。cytochrome c ソルゲルを含む1つの金型の上部からパラフィルムを取り除き、底部からキャップとプラスチックラップを取り除きます。洗浄瓶を用いて金型の中にエタノールを少量加えた後、シリンジプランジャーの円盤状の端を使用して、ゲルを慎重に金型から押し出し、約 5 milliliters のエタノールが入った清潔な 20 milliliter ガラスシンチレーションバイアルに移します。

すべてのシトクロムcゲルがバイアルに加えられ、すべてのシリカゲルが別のバイアルに加えられるまで、このゲル除去手順を繰り返します。その後、バイアルをエタノールで満たします。キャップを閉め、2～8°Cで保存してください。

1日を通して4時間ごとに、ゲルを冷蔵庫から取り出します。ゲルからエタノールを捨て、新しいエタノールと交換します。さらに3日間、湿ったゾルゲルをアセトンに浸し、1日3回アセトンを捨てて新しいアセトンを加えます。

付属のサーキュレーターの温度を8°Cに設定し、臨界点乾燥装置を10°Cまで冷却します。装置が10°Cに達したら、テキストプロトコルに従って装置のリークテストを行います。装置に漏れがないことを確認した後、シンチレーションバイアルから濡れたゲルを、アセトンの大部分とともに、移送ボートの3つの長いセクションに注意深く注ぎ入れます。

装置内でボートを密封する前に、すべてのゲルが完全にアセトンに浸っていることを確認し、必要に応じてアセトンを追加してください。装置の充填バルブを開き、二酸化炭素を導入します。装置の窓から、二酸化炭素が装置の底に沈降していくのが確認できたら、排水バルブを開いてアセトンを5分間排出してください。

アセトンが底部に浸透するのは、装置が二酸化炭素で完全に満たされる前になります。したがって、排水中も充填バルブを開いたままにし、装置への充填を継続させてください。その後、排水バルブを閉じます。

充填バルブをわずかに開いたままにします。開始直後は、アセトンが無水ではないため、排出される混合物には水が含まれています。そのため、ドレンチューブ内で凍結や詰まり、圧力上昇が生じる可能性があります。

詰まりが検出された場合は、詰まりが溶けるまで排水バルブを閉じます。5分後、排水バルブをさらに5分間開き、排水時間中ずっと装置が満たされた状態になるよう、注水バルブを十分に開いて調整します。5分後、排水バルブを閉じ、注水バルブをわずかに開いたままにします。

次に、5分後にこの排出ステップをもう一度繰り返します。排出ステップが完了したら、充填バルブを閉じ、装置のウィンドウを通してボートの prong のわずか上に液面が見える状態で液体二酸化炭素を排出します。次に、装置に取り付けられたサーキュレーターの温度を 40 °C に設定し、液体二酸化炭素が臨界温度および臨界圧力を超えるようにします。

約15分後、ボートの爪より上の液面（メニスカス）が消失する様子を装置のウィンドウから観察し、液体から超臨界流体への転移を確認します。少なくとも15分間の平衡化時間を経た後、ベントバルブをわずかに開き、超臨界流体の放出を開始します。約45分かけて、ベントバルブを段階的にさらに開き、流体が放出されるわずかだが一定のシューという音が聞こえ、圧力計の数値がゆっくりとゼロまで低下するのを確認します。

装置の圧力がゼロになった後、装置のドアを開けます。ボートを取り出します。そして、ピンセットを使用して、新しく乾燥させたエアロゲルを清潔なガラス製シンチレーションバイアルに入れます。

テキストプロトコルに従った特性評価の後、シトクロムcシリカエアロゲルを用いて一酸化窒素ガスの存在を検出する準備が整いました。4.4 millimolar、40 millimolar、および70 millimolarのリン酸カリウム緩衝液中で15 micromolarのシトクロムcを封入したエアロゲルを、10セント硬貨と比較して示します。ここでは、緩衝液中のシトクロムcと、さまざまな条件下でエアロゲルに封入されたシトクロムcの代表的なスペクトルを比較して示しています。

エアロゲル内において、シトクロムcの409ナノメートルのソレットピークは実質的にシフトせず、バイオエアロゲルが気相の一酸化窒素にさらされると特徴的なレッドシフトを示します。このビデオを視聴することで、シリカゾルゲルを合成し、これらのゾルゲルにシトクロムcを封入し、さらにこれらの複合ゾルゲルを乾燥させてエアロゲルにする方法について十分に理解できるはずです。バイオエアロゲルの特性評価および、バイオエアロゲルを用いた気相一酸化窒素の検出に関する詳細は、テキストプロトコルを参照してください。