Name: シトクロムをカプセル化 C金属ナノ粒子なしのシリカエアロジェルナノアーキテクチャで気相生物活性を保持しながら、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶシトクロムcをシリカエアロジェルにカプセル化し、気相一酸化窒素検出のためのバイオセンシング手法を確立する方法。超臨界乾燥により高多孔質構造を維持し、タンパク質活性を保持します。

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<li>Moore, G. R., Pettigrew, G. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+GR+%22Cytochromes+c.+Evolutionary%2C+Structural%2C+and+Physicochemical+Aspects%22">Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects</a>. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).</li>
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<li>Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+electrochemistry+and+Raman+spectroscopy+of+sol-gel-encapsulated+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin.</a> Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).</li>
<li>Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sol-gel+encapsulation+of+metalloproteins+for+the+development+of+optical+biosensors+for+nitrogen-monoxide+and+carbon-monoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide.</a> Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).</li>
<li>Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+sol-gel+encapsulated+heme+proteins+with+chemical+sensing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties.</a> J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).</li>
<li>Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+conditions+for+encapsulating+cytochrome+c.+and+catalase+in+SiO2+sol-gel+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Non-Cryst.+Solids%22%5BJournal%5D)">Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials.</a> J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).</li>
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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

説明したように、この手順は、一貫して実行可能なCYTを生成した。エアロゲル内に封入Cはエアロゲル内CYT。Cの濃度は5〜15μMおよび4.4からのタンパク質の生存度に深刻な悪影響なしに70 mMのリン酸に変えることができるエアロゲル内に封入初期CYT。C溶液の緩衝液濃度から変化させることができます。しかし、ピーク中心と特性のcytのピーク幅。ソーレーピークCエアロゲルで、彼らはCYTためのものであるものに最も近い。溶液中のCのcyt。cが 40 mMのバッファ9の溶液からエアロゲル中にカプセル化されたとき。 CYTの合成。C -SiO 2エアロゲルは、出発試薬のいくつかの年齢によって影響されます。メタノール、テトラ、および水酸化アンモニウム溶液は、すべての吸湿性であり、すべて1対2ヶ月を交換する必要があります。中に蓄積増加した水時間をかけてこれらの試薬は、ゲル構造特性およびゾルからゲルへの遷移時間に影響を与えます。 超臨界乾燥を行う場合には、臨界点乾燥装置の転送ボートが厚い18 0.5センチメートル、直径1cmのゲルを保持することができます。プロトコルセクションで概説したように、特定の充填および排出手順は、ゾル - ゲルに二酸化炭素を転送するために従うべきです。排水プロトコルの開始時に、二酸化炭素とアセトンの排出液は、ドレインチューブは水分が外部に氷に凝縮と硬い凍結するような高速で流れることに留意することが重要です。アセトン、無水なく、この水は時折排水管が実際に詰まら程度にフリーズすることがあるため外排出混合物は、いくつかの水が含まれています。このような目詰まりを監視するために、フローの停止をリッスンする必要があります。詰まりが検出された場合、目詰まりが溶融するので、排水弁が数分間閉鎖されるべきです。に排水バルブが閉じていない場合は最悪のシナリオは、目詰まりはそんなに圧力が排水管が強制的に装置をオフにポップすることを構築することがあります。最初のいくつかのドレイン期間の後、アセトンの大部分は、装置の外に洗浄されています、と濡れた氷の塊の発生が大幅に減少します。排水プロトコルは（そのような香りなど）アセトンの存在の任意の残留証拠を継続するように、放電は次第に排水処理の終了により検出不能となってドライアイスのようになります。 装置内の二酸化炭素を超臨界流体への液体から移行したと通気プロセスが始まった後、手順9に示されるように、少なくとも45分間にわたってゆっくりとした速度で流体を放出することが必要です。リリースの高いレートは、チトクロームの生存率を減少させることができます。エアロゲルとエアロゲル自身内のcが （ 図9に示すように）実際に目のようにバラバラにすることができますE液をゲルから逃れるために突入します。彼らは脆く、簡単に破ることができるように一般的に、エアロゲルは、装置の扉を開いた後に無傷のまま場合でも、慎重に、静かにそれらを処理することが重要です。 CYTと一緒に注入する制御シリカゲル。C -SiO 2ゲルは、ゲルへの二酸化炭素の移動が成功したかどうかを決定するために超臨界乾燥の後に使用されます。時にはCYT。C -SiO 2ゲルは曇って見えることがあり、これは不完全な溶剤転送するか、CYTの濃度に関係しています。Cまたはゲル内に封入されたバッファリングすることができるかの原因であるかどうかは決定することが重要です。 CYTなしのシリカゲルが。全体に均質な、半透明の外観を有するように見えるcの場合、溶媒の転送が完全にたとえCYTを発生したこと、これが証拠として撮影することができます。C -SiO 2ゲルは、それらにいくつかの曇りを持っています。シリカゲル内雲量CYTずに乾燥後。cが 、いくつかのアセトンが通気中にゲルの内部に残っていることを示しています。 プロトコルセクションで示したように、一酸化窒素（NO）で作業するとき、重要な安全上の予防措置をとる必要があります。エアロゲルを用いてNOを検出するために、非常によく、キュベットを密閉し、ドラフト内にエアロゲル上を流れるガスを排出する必要があります。また、全体の分光光度計は、NOガスへの露出を制限するために追加の予防策として、NOガスシリンダーと一緒にヒュームフード内に移動させることができます。空気NOと接触するとすぐに非常に有毒な二酸化窒素、四酸化二窒素または両方を生成します。 NO、熱及び腐食性のフュームを生成するために水と反応することができます。したがって、NOへの持続的な曝露は、直接的な組織毒性をもたらす可能性があります。 CYTを使用する場合。C -SiO 2エアロゲルの一酸化窒素の存在を検出するために、ソーレー帯は、最初〜408 nmであろうと移行します一酸化窒素の存在下で〜414 nmまで。バック窒素に切り替えた後、ソーレー帯は〜408 nmの中心とされているに戻って逆必要があります。また、CYTを使用することも可能である。C -SiO 2エアロゲル、一酸化炭素27のような他のリガンドの存在を検出します。 異なる公開された方法は、従来のゾルと混合し、超臨界エアロゲル4-8を形成するために乾燥に溶液中のcyt。Cと金または銀ナノ粒子を合成する追加ステップを含みます。 CYTのUV-可視分光法を比較した。cは CYTのものと金属ナノ粒子とのエーロゲルの中にカプセル化金属ナノ粒子なしエーロゲルの中にカプセル化Cは、カプセル化技術のこれらの2つのタイプがCYTを生成することを示している。エアロゲル内の類似の生存率C（ 図5） 。しかし、金属ナノ粒子でカプセル化CYT。cが CYTよりわずかに安定である。Cの封入エアロゲル9内の金属ナノ粒子を含まないD。両方がいくつかのエアロゲル内のcyt。Cの展開を示すバッファ内のcyt。Cのスペクトル（ 図7）と異なるものの、CYT。Cエアロゲルの両方のタイプのCDスペクトルは、また類似しています。 CYT上の以前の報告。エアロゲル中にカプセル化さcは円偏光二色性分光法は、最も可能性の高いタンパク質の最外層を評価していることを示唆しているが、金属ナノ粒子核形成多層CYTいずれかの内、シリカゲルとの接触の際に展開するcの構造や形成緩く組織化構造いかなる金属ナノ粒子は、エアロゲル4.9に存在しない場合。しかし紫外可視分光法により測定されたエアロゲル内部に自己組織化構造のいずれかのタイプ内のcyt。Cの大部分は、折り畳まれたままになります。本明細書のSANナノ粒子を記載したプロトコルの利点は、高価な購入または金属の時間のかかる合成ナノ粒子は必要ありません。タンパク質は、多くの場合、正常にエアロゲル内にカプセル化されておらず、それが将来のバイオ分析装置のための潜在的な重要性を持つエアロゲル中の他のタンパク質をカプセル化するための、より一般的な方法の開発につながる可能性があり、その中にため、この手順は重要です。

シトクロムc（CYT。c）は、身体の細胞呼吸の反応に関与する重要な電子伝達タンパク質です。細胞死の制御された形態、アポトーシスに関与することが示されており、それは、一酸化窒素及び一酸化炭素1-3のような小さな毒性分子を検出することができます。一酸化窒素（NO）は、神経、心血管系で起こる生理学的過程、および免疫系の様々な役割を果たしています。 CYTは。Cは、一般的に、構造的に無傷でアクティブなままにしたpH中性の値に緩衝水性環境が必要ですが、研究はそのCYTを示している。cは一定の条件4-9の下でエアロゲルとして知られている固体材料で、その構造と機能を保持することができます。 エアロゲルは、多くの場合、金属酸化物エアロゲルは非常に一般的であるが、炭素およびエアロゲルの他のタイプの合成された（ゾル - ゲル金属酸化物を合成することによって形成された高度に多孔質の材料である。一例では、InPのAERありますogels）10と多孔質固体マトリックスは11-14変更されないような方法でこれらのゾル-ゲルを乾燥させます。固体エアロゲルの細孔の全てが表面反応が重要である任意のアプリケーションのためのエアロゲルは、非常に有用にする多くの利用可能な表面積になります。化学的または生化学的機能がエアロゲルナノアーキテクチャ内で組み立てられる場合には、エーロゲルの物理的な多孔度および表面増強領域は、センサ、並びに電池用電極、燃料電池、及びスーパーキャパシタアプリケーション11,15-23を改善するのに役立つことが示されています。不変の多孔質固体マトリックスを残すようにエアロゲルを乾燥させるためには、超臨界溶媒抽出を介して、ゾル - ゲル合成後の細孔中に残存溶媒を除去することが典型的です。ゲルからの溶媒が蒸発するように表面張力によって生じ得る任意の孔の崩壊が原因超臨界乾燥、液体 - 蒸気界面は決して形で最小化されます。 24-30乾燥させたゾル-ゲル中にカプセル化されているcは 。その後、エアロゲルが原因で多くのタンパク質の構造に損害を与える恐れがあります必要な処理に稀です形成するために超臨界乾燥させて、ゾル - ゲル中の生体分子をカプセル化するレポート。 CYT。Cの場合には、一定の条件により、検出およびエーロゲルの中に気相窒素酸化物に反応するのCYT。C能力を保持することを可能にします。一度エアロゲルで安定化、エアロゲルの高品質な細孔構造はCYT。cおよび一酸化窒素4,8,9との間の反応を促進します。 CYT。cが最初のソリューション4-8に金または銀ナノ粒子の周囲に複数の層でそれを関連付けることにより、エアロゲル内にカプセル化することができます。これらの多層超構造は、エアロゲルマトリックス内にタンパク質を保護するのに役立ちます。最新approacでタンパク質濃度およびバッファー強度が他の合成条件と一緒に制御されている我々が開発している時間は、CYT。cがあっても、金属ナノ粒子の初期の関連付け9なしエアロゲル内の整合性を保持しています。 合成は、多くのエアロゲル合成は、一定期間のためのシリカゾルゲル前駆体を混合することにより開始し始めます。これは、cは 、混合物中に緩衝溶液として添加することがCYT。混合時間セットした後です。ゲルはその後細孔が水、メタノール、残りの反応物及び副生成物で充填された多孔質シリカ固体構造を形成するために起こります。毛穴を埋めるこの液体は、溶媒交換の一連の様々な溶媒を用いてすすぐことができ、液体二酸化炭素は、臨界点乾燥装置内で行わとの最後の交流が低温に保ちました。二酸化炭素の臨界温度（31.1℃）より上のゲルをもたらすことなどの形成を促進します乾燥し、高度に多孔性エアロゲルを形成するために排出することができ、加圧装置内upercritical流体。それが変性可能性がある温度以下にタンパク質を保持するための超臨界流体を形成するために、二酸化炭素のために必要な比較的低い温度が他の溶媒に比べて有利です。 それは、他のタンパク質をカプセル化するための、より一般的に適用可能なプロトコルの開発につながる可能性があり、簡単な手順であるため、エアロゲルにCYT。Cをカプセル化する当社の金属ナノ粒子を含まないアプローチが有利で ​​す。多くのタンパク質は、CYT同じように金属ナノ粒子と相互作用しないことがあります。cが行い、金属ナノ粒子の合成または購入手続きに追加の時間と費用を追加します。エアロゲル中のタンパク質をカプセル化するには、いくつかの報告は私を助けることができるエアロゲル中の他のタンパク質をカプセル化するための、より一般的な手順を見つけるための重要な一歩は、この手順の開発を行いますnは潜在的な将来の生体分析装置。 この原稿のプロトコルセクションでは、シリカのゾル-ゲルを合成し、これらのゾル-ゲルにCYT。Cをカプセル化し 、エアロゲルを形成するために、これらの複合ゾル-ゲルを乾燥、紫外可視および円偏光二色性分光法を使用して、これらのbioaerogelsを特徴付け、存在を検出する方法について説明しますこれらbioaerogelsと気相酸化窒素の。第一リン酸緩衝液の4.4 mMの70の水溶液中に溶解した場合CYT。cが正常エアロゲル中に封入されています。しかし、エアロゲルで最適化されたタンパク質の構造は、CYTの40mMのリン酸緩衝液を封入する際に生じることが判明した。ロードされたエアロゲルCYTを生産Cは 5~9μM〜15の範囲のC濃度 。したがって、下記のプロトコルは、CYTの40mMのリン酸緩衝液を使用してエアロゲルを合成することである。ロードされたcytその結果、C。C濃度15μMのエアロゲルインチ&lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P285-500</td><td>認定ACS(一塩基性リン酸ナトリウムを使用することも可能)</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性カリウム無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P288-500</td><td>認定ACS(二塩基性リン酸ナトリウムを使用することも可能)</td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>ミリポアダイレクトQ</td><td></td><td>18 M&オメガ;</td></tr><tr><td>cm pHメーターと電極</td><td>デンバー機器</td><td>UB-10</td><td></td></tr>シ<tr><td>トクロムc馬の心臓シ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>C7752-100MG&nbsp;</td><td>&ge;95%はMol.Wt.12,384に基づいており、-20&nbspで受信および保管された状態で使用。&deg;C</td></tr><tr><td>ガラスシンチレーションバイアル</td><td>ウィートン</td><td>03-341-25J</td><td>20 ml、外径×高さ(キャップ付き):28&nbsp;mm×61&nbsp;mm</td></tr><tr><td>使い捨てキュベット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>14-955-126</td><td>メタクリレート、10 mm x 10 mm x 45&nbsp;mm</td></tr><tr><td>紫外線可視分光光度計</td><td>島津</td><td>製作所UV-1800</td><td>はUVProbe v 2.33ソフトウェアを使用します</td></tr><tr><td>円二色性分光計(または分光偏光計)</td><td>JASCO</td><td>J-810</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 実験室用冷蔵庫</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン使い捨てビーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-291-10</td><td>50ミリリットル</td></tr><tr><td>テトラメチルオルトケイ酸塩(別名テトラメトキシシラン、TMOS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>218472-500G</td><td>純度98%</td></tr><tr><td></td><td>メタノールフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A457-4</td><td>GCレゾルブグレードの</td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221228-25ML-A</td><td>ACS試薬、28.0%-30.0%</td></tr><tr><td>汎用ポリプロピレンシンチレーションバイアルシ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>Z376825-1PAK</td><td>16 mm x 57 mm、ボリュームサイズ6.5&nbsp;ml、鋭利なナイフやカミソリで底をスライス</td></tr><tr><td>一般的なプラスチックラップ</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M 実験室ラッピングフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックシリンジプランジャー</td><td>3mlのシリンジ</td>から<td>様々な</td><td></td>使用シリンジプランジャー</tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>アクロス</td><td>61509-0040</td><td>絶対、200プルーフ、99.5% ACS試薬</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A949-4</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>臨界点乾燥装置</td><td>クォーラムテクノロジー</td><td></td><td>ズ E3000シリーズ</td></tr><tr><td>サーキュレーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>アイソテンプ3016</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素シリンダー</td><td>テック エア</td><td></td><td>サイフォンチューブ</td></tr><tr><td>マイクロメーター</td><td>セントラルツールカンパニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グラム/AI 8.0ソフトウェア</td><td>サーモエレクトロンコーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>窒素ボンベテック</td><td>エア</td><td></td>別の<td>不活性ガスは、</td></tr><tr><td>10%一酸化窒素/ 90%窒素ボンベ</td>エア<td>ガス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>、各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tスイッチバルブ</td><td>、各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ針</td><td>、各種</td><td></td><td></td></tr>に置き換えることができます</tbody></table>

シトクロムをカプセル化<em&gt; c</em&gt;金属ナノ粒子なしのシリカエアロジェルナノアーキテクチャで気相生物活性を保持しながら、

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

官能性化合物は、エアロゲル内にカプセル化されたときに、センサ、電池、燃料電池などのアプリケーションは、非常に多孔性のエアロゲルを使用することによって改善されています。しかし、エアロゲルを形成するために処理されているゾル - ゲル内のタンパク質をカプセル化するには、いくつかの報告が存在します。超臨界酸化窒素（NO）は、気相活性を有するbioaerogelsを形成するために処理されるシリカ（SiO 2）ゾル-ゲルにシトクロムc（CYT。C）をカプセル化するための手順が示されています。 CYT。Cは制御タンパク質濃度で混合シリカゾルに加え、強度条件をバッファリングします。ゾル混合物をゲル化し、ゲルの孔に充填された液体は、液体二酸化炭素と溶媒交換の一連の置換されています。二酸化炭素は、その臨界点にし、CYTで乾燥エアロゲルを形成するためにオフに排出される。cは内部に封入されました。これらのbioaerogelsは、紫外可視分光ANと特徴付けられますD円偏光二色性分光法及び気相酸化窒素の存在を検出することができます。この方法の成功はCYT。C濃度と緩衝液濃度を調整するに依存し、このような金属ナノ粒子のような他の成分を必要としません。潜在的な将来の生物分析機器開発のための重要なこの手順を行う同様のアプローチを使用して、他のタンパク質をカプセル化することが可能です。

実行可能なCYT。Cを含むエアロゲルで説明する手順をもたらします。導入の最後に指定されているように、CYT。cが 4.4から70 mMのリン酸の範囲で緩衝水溶液からカプセル化することができます。 CYTの例。C -シリカ（CYT。C -SiO 2）異なる緩衝液濃度を含有する溶液から製造されたエアロゲルは、 図4に示されている。70ミリモルから製造されたゲルは最も不透明なバッファを用いてすべてのゲルは、比較的半透明です。 CYTの分光法との比較。異なる条件の下でcは 、図5に示されている。典型的なスペクトル（ 図5c）が 2エアロゲルC -SiO。CYTための408 nmの周りに大きなソーレーピークを示し、チトクロームのスペクトルに非常に類似しています溶液中。C（ 図5a）。また、CYTのスペクトル。金属ナノ粒子がエーロゲルの中にカプセル化されたCは 、（ 図5b）とCYTが示されている。C -SiO 2エアロゲルスペクトルは、同様に、このスペクトルに類似しています。 CYT。C -SiO 2エアロゲルは窒素酸化物に暴露されると、ソーレーピークの典型的なシフトは、（ 図5d）で観察されています。 CYTから作られたゲルのためのUV-VISスペクトルを変化させる緩衝液濃度でのCソリューションは、 図6に示されている。これらのゲルのすべての特性UV-可視分光はCYT。cは 、ゲル内の変性状態にないことを示す特徴を示しています。しかし、これらのスペクトルのためのより低い信号対雑音比で70 mMの緩衝結果から作られたゲルの減少透光。 CYTのCDスペクトル。C -SiO 2エアロゲルはCYTのスペクトルに類似している。C </eM&gt;エアロゲルスペクトルの両方のタイプの緩衝溶液中でCYT。Cのスペクトルと異なっているが、金属ナノ粒子を有するエアロゲル内に封入された （ 図7）。 図8は 、CYTのための典型的な酸化窒素監視応答を示している。C -SiO 2エアロゲルともCYT。Cに加えて、金属ナノ粒子を含んで対応するエアロゲル。 408 nmで414 nmでの吸光度との差が増大し、次いでゲルを連続してそれぞれ窒素を一酸化窒素に露出されたときに減少することが分かります。 超臨界二酸化炭素を十分に遅い速度、CYTの生存能力にリリースされていない場合。形成されたエアロゲル内のcが危険にさらされます。これは、異なる時に二酸化炭素を放出することによってゲルを形成した後、得られた紫外可視スペクトルを比較することによって明らかにされます料金（ 図9）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig1.jpg" /> 図1：臨界点乾燥装置 （A）正面および（B）から示される臨界点乾燥装置背面次の装置の背面に示す伝達ボートおよび装置、ドア付き。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig2.jpg" /> 図2：ダンボールプラットフォーム楽器のビームの経路にエアロゲルを保持するための組み立てられた段ボールプラットフォーム。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig3.jpg" /> 図3：一酸化窒素感知セットアップ一酸化窒素感知セットアップは、（A）10％の一酸化窒素囲まドラフト含むように示されています。、90％窒素シリンダー、チューブ、およびT-バルブ、及び（B）に挿入針をキュベット。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig4.jpg" /> 図4：試料CYT C -SiO 2 エーロゲルは、15μMのCYTをカプセル化エアロゲルCを 4.4ミリメートル、40ミリメートル、70 mMのリン酸カリウム緩衝液中で左から右にダイムと比較して示されています。これらのエアロゲルは、約0.2から0.5 cmの高されています。許可9を得て転載。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig5.jpg" /> 図5：CYT C -SiO 2 エアロゲル分光法 （a）は、50 mMリン酸緩衝ゾル中の15μMのシトクロムcの可視スペクトル。ution; （b）の金（5-nm）の 〜のcyt C -SiO 2エアロゲル。 。（空気にさらさ）（c）のチトクロームC -SiO 2エアロゲル。 （d）に CYT。（3.5分間酸化窒素にさらさ）C -SiO 2エアロゲル。ゲルの各タイプのこれらの代表的なスペクトルは、明確にするためにオフセットされており、破線は、バッファ内のCYT。Cソーレーピークの位置を示します。各スペクトルは、15μMのcyt。cがあるが、ゲルの厚さ（または高さ）が高い溶液の吸光度が得られた1cmソリューションのキュベットに比べて唯一の0.2から0.5センチです。許可9を得て転載。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig6.jpg" /> 図6：カプセル化された緩衝液の濃度を変化させたとして、エアロゲル分光法 15 _をカプセル化するゲルについてゲルパスの長さで分割されたエアロゲルの平均化紫外可視分光吸光度。6; MのCYTは、70mMの（黒）（4スペクトルの平均）、40mMの（赤、点線）（8スペクトルの平均）、及び4.4 mMの（緑、破線）（9スペクトルの平均）、リン酸カリウム緩衝液中で、C。 。許可9を得て転載。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig7.jpg" /> 図7：。。。エアロゲル円偏光二色性分光法 （固体）、リン酸ナトリウム緩衝溶液中のチトクロームCの円偏光二色性スペクトル、チトクロームの2つの代表的なスペクトルC -SiO 2エアロゲル（破線）、及びAuの2つの代表的なスペクトル（5-nm）の 〜CYT。C SiO- 2エアロゲル（点線）。許可9を得て転載。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig8.jpg" /> 図8：CYTと一酸化窒素の検出 C -SiO 2。 </サブ&gt; エアロゲル （ΔAは414 nmで = - 408 nm）をシフトの監視。。。ガス流としてのSiO 2複合エアロゲルナノアーキテクチャにカプセル化のcytのソーレー強度でC（固体赤）とAu〜のチトクロームC（青点線） （ソーレーピーク最大値は〜414 nmである）、窒素（ソーレーピーク最大値は〜408 nmである）と一酸化窒素との間でトグルされます。各曲線は、チトクロームの2で、3-4回の平均値であるΔAで監視C -SiO 2試験では、414ナノメートル = - 。初期ソーレーピーク最大値は、これらの試験のための407 nmであったため、407 nmのを 。許可9を得て転載。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig9.jpg" /> 図9：超臨界流体の放出時間の影響 CYTためのゲル経路の長さで割った紫外可視分光吸光度を平均化C -SiO 2エアロゲルenca。50 mMの超臨界乾燥エアロゲルは45分（9スペクトルの固体、黒（平均））または7分（4の破線、赤（平均の上のいずれか解放する超臨界二酸化炭素によって作られたリン酸緩衝液中の10μMのCYTをpsulating。Cスペクトル））。許可9を得て転載。

この手順は、シリカにシトクロムc（CYT。c）をカプセル化する方法を説明し（SiO 2）でゾル-ゲルプロセスこれらのゲルはbioaerogelsを形成し、急速気相反応により一酸化窒素（NO）を認識するために、これらのbioaerogelsを使用します。このタイプのプロトコルは、バイオセンサーまたは他の生体分析機器の将来の発展を助けることができます。

シトクロムをカプセル化<em&gt; C</em&gt;金属ナノ粒子なしのシリカエアロジェルナノアーキテクチャで気相生物活性を保持しながら、

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are ...

本手順の全体的な目的は、シトクロムcをシリカゾルゲルに封入することです。これらのゲルを超臨界処理してバイオエアロゲルを形成し、これらのバイオエアロゲルを用いて気相反応を通じて一酸化窒素を迅速に認識させます。この手法は、高度に多孔質なエアロゲルに封入された際にシトクロムcが活性を維持するためにどのような条件が必要かなど、バイオセンシングおよびバイオ分析分野における重要な課題の解決に寄与します。この手法の重要性は、これまでタンパク質の封入が困難であったマトリックスに、タンパク質を封入するための簡便な手順であるという点にあります。この方法はシトクロムcに関する知見を提供すると同時に、将来的なバイオ分析デバイスへの応用が期待される、エアロゲルへの他のタンパク質の封入に向けた手順の開発につながる可能性があります。シトクロムcの濃度が0.7から1 mMの範囲となる溶液を調製してください。テキストプロトコルに記載されている通り、希釈した 0.105 millimolar シトクロムc溶液を用意します。次に、使い捨ての 50 milliliter ポリプロピレンビーカーに「ビーカーA」とラベルを貼ります。ビーカーを分析天秤の皿の上に置き、ガラス製パステールピペットを用いて 1.88 grams のテトラメトキシシランをビーカーに加えます。天秤をゼロ点調整します。次に、2.88 gのメタノールをビーカーAにピペットで分注します。ビーカーAをパラフィルムで密閉します。その後、ビーカーBとラベルを貼った使い捨ての50 mLポリプロピレン製ビーカーにマグネチックスターラーバーを加え、分析天秤のパンの上に置きます。ガラスピペットを用いて、0.75 gの水と3.00 gのメタノールを加え、ビーカーBをパラフィルムで密閉します。ドラフト内にて、スターラーを用いてビーカーBの内容物を攪拌し始めます。次に、シリンジを使用して、パラフィルムのカバー越しに28.0～30.0%の水酸化アンモニウム溶液5 µLを混合液に注入し、攪拌を続けます。この操作が完了しだい、ビーカーAの内容物をビーカーBに加えます。パラフィルムで蓋をしたまま、混合液を20分間攪拌します。シリカゾル混合液を撹拌している間に、ポリプロピレン製シンチレーションバイアルを8〜9本と、対応するキャップを用意します。バイアルのキャップ端にプラスチックラップを被せ、ゲルが形成されるための平坦な面を作り、その上からキャップを被せて固定します。プラスチックラップがキャップの中で外れないように注意します。バイアルを、キャップ側をベンチトップに向け、開口部のある底側を上にして並べます。次に、各バイアルを覆うのに使用するパラフィルムをカットします。ゾルの混合が完了したら、清潔な使い捨て50 milliliterポリプロピレンビーカーに、ゾル混合液を3 milliliters分加えます。ガラス製パステールピペットを使用し、0.105 millimolarに希釈したシトクロムc溶液500 microlitersを、ビーカーの壁面に沿って約1分かけて3 milliliterのゾル混合液の中に非常にゆっくりと滴下します。大きな赤色の凝集塊の形成を防ぐため、シトクロムcを加える際は混合液を静かに回旋させてください。得られたシトクロムcシリカゾルを、準備した各型に0.5 millilitersずつピペットで分注します。また、超臨界乾燥工程での対照試料とするため、残りのプレーンシリカゾルを1〜2個の型に0.5 millilitersずつ分注します。型の開口部をパラフィルムで密閉し、冷蔵庫に一晩、または少なくとも12時間保管してゾルゲルを形成させます。金型を冷蔵庫から取り出します。cytochrome c ソルゲルを含む1つの金型の上部からパラフィルムを取り除き、底部からキャップとプラスチックラップを取り除きます。洗浄瓶を用いて金型の中にエタノールを少量加えた後、シリンジプランジャーの円盤状の端を使用して、ゲルを慎重に金型から押し出し、約 5 milliliters のエタノールが入った清潔な 20 milliliter ガラスシンチレーションバイアルに移します。すべてのシトクロムcゲルがバイアルに加えられ、すべてのシリカゲルが別のバイアルに加えられるまで、このゲル除去手順を繰り返します。その後、バイアルをエタノールで満たします。キャップを閉め、2～8°Cで保存してください。1日を通して4時間ごとに、ゲルを冷蔵庫から取り出します。ゲルからエタノールを捨て、新しいエタノールと交換します。さらに3日間、湿ったゾルゲルをアセトンに浸し、1日3回アセトンを捨てて新しいアセトンを加えます。付属のサーキュレーターの温度を8°Cに設定し、臨界点乾燥装置を10°Cまで冷却します。装置が10°Cに達したら、テキストプロトコルに従って装置のリークテストを行います。装置に漏れがないことを確認した後、シンチレーションバイアルから濡れたゲルを、アセトンの大部分とともに、移送ボートの3つの長いセクションに注意深く注ぎ入れます。装置内でボートを密封する前に、すべてのゲルが完全にアセトンに浸っていることを確認し、必要に応じてアセトンを追加してください。装置の充填バルブを開き、二酸化炭素を導入します。装置の窓から、二酸化炭素が装置の底に沈降していくのが確認できたら、排水バルブを開いてアセトンを5分間排出してください。アセトンが底部に浸透するのは、装置が二酸化炭素で完全に満たされる前になります。したがって、排水中も充填バルブを開いたままにし、装置への充填を継続させてください。その後、排水バルブを閉じます。充填バルブをわずかに開いたままにします。開始直後は、アセトンが無水ではないため、排出される混合物には水が含まれています。そのため、ドレンチューブ内で凍結や詰まり、圧力上昇が生じる可能性があります。詰まりが検出された場合は、詰まりが溶けるまで排水バルブを閉じます。5分後、排水バルブをさらに5分間開き、排水時間中ずっと装置が満たされた状態になるよう、注水バルブを十分に開いて調整します。5分後、排水バルブを閉じ、注水バルブをわずかに開いたままにします。次に、5分後にこの排出ステップをもう一度繰り返します。排出ステップが完了したら、充填バルブを閉じ、装置のウィンドウを通してボートの prong のわずか上に液面が見える状態で液体二酸化炭素を排出します。次に、装置に取り付けられたサーキュレーターの温度を 40 °C に設定し、液体二酸化炭素が臨界温度および臨界圧力を超えるようにします。約15分後、ボートの爪より上の液面（メニスカス）が消失する様子を装置のウィンドウから観察し、液体から超臨界流体への転移を確認します。少なくとも15分間の平衡化時間を経た後、ベントバルブをわずかに開き、超臨界流体の放出を開始します。約45分かけて、ベントバルブを段階的にさらに開き、流体が放出されるわずかだが一定のシューという音が聞こえ、圧力計の数値がゆっくりとゼロまで低下するのを確認します。装置の圧力がゼロになった後、装置のドアを開けます。ボートを取り出します。そして、ピンセットを使用して、新しく乾燥させたエアロゲルを清潔なガラス製シンチレーションバイアルに入れます。テキストプロトコルに従った特性評価の後、シトクロムcシリカエアロゲルを用いて一酸化窒素ガスの存在を検出する準備が整いました。4.4 millimolar、40 millimolar、および70 millimolarのリン酸カリウム緩衝液中で15 micromolarのシトクロムcを封入したエアロゲルを、10セント硬貨と比較して示します。ここでは、緩衝液中のシトクロムcと、さまざまな条件下でエアロゲルに封入されたシトクロムcの代表的なスペクトルを比較して示しています。エアロゲル内において、シトクロムcの409ナノメートルのソレットピークは実質的にシフトせず、バイオエアロゲルが気相の一酸化窒素にさらされると特徴的なレッドシフトを示します。このビデオを視聴することで、シリカゾルゲルを合成し、これらのゾルゲルにシトクロムcを封入し、さらにこれらの複合ゾルゲルを乾燥させてエアロゲルにする方法について十分に理解できるはずです。バイオエアロゲルの特性評価および、バイオエアロゲルを用いた気相一酸化窒素の検出に関する詳細は、テキストプロトコルを参照してください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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シトクロムをカプセル化

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