ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

本プロトコルの全体的な目的は、ヒト多能性幹細胞を、完全に色素が沈着した成熟メラノサイトへと分化させることです。この手法は、メラノサイトの発達過程における重要な因子の特定に寄与します。さらに、本プロトコルを用いることで、疾患の発症過程で異常が生じた因子の特定や、創薬における重要な薬剤のスクリーニングが可能になります。

このプロトコルの主な利点は、完全に色素沈着したメラノサイトを大量に作製できることです。患者からメラノサイトを分離する場合、通常は得られる細胞数が比較的少なくなります。ゼラチン状タンパク質を分注して凍結した後、1 mLのアリコートを解凍し、19 mLのDMEM f12に再懸濁します。

次に、この混合液を5 mL、1枚の10 cm組織培養皿に導入します。同様のプレートを数枚準備した後、室温で1時間インキュベートします。続いて、PO、ラミニン、およびフィブロネクチンでコートしたプレートの準備を開始するため、まず15 µg/mLのPOを含むPBSを培養皿に加えます。

次に、プレートを加湿インキュベーター内で37 °Cで一晩インキュベートします。その後、溶液を吸引し、ディッシュを1X PBSで3回洗浄します。1 µg/mLのマウスlaminin 1と2 µg/mLのfibronectinを含むPBSを10 mL加え、コーティングを続けます。

次に、既述の方法でディッシュをインキュベートします。まず、10 cmディッシュにPBSで調製した0.1%ゼラチンを加え、室温で5分間放置します。

このプレートをコーティングしている間に、凍結保存したマウス胚性線維芽細胞（MEF）を37 °Cの水槽に入れ、速やかに融解させます。次に、ディッシュからゼラチンを吸引し、10%胎児牛血清を添加したDMEMを用いて、約50,000 cells/cm²の密度でMEFを播種します。37 °Cで一晩インキュベートした後、培地を吸引し、準備したMEFプレートを1X PBSで洗浄します。

あらかじめ調製した、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）を含むhESC培地10 millilitersを、10 centimeterディッシュに加えてください。1皿あたり5 million cellsの密度で細胞を播種した後、プレートを37 degrees Celsius、5%二酸化炭素条件下でインキュベートします。その後、新鮮なhESC培地10 millilitersを毎日添加して細胞を維持してください。

分化を開始する前に、分化した細胞、不規則な境界、または透明な中心部を持つように見えるコロニーがプレート内にないか確認します。ラミナーフローフード内で解剖顕微鏡を用い、そのような不規則なコロニーをピペットで物理的に除去します。Matrigelなどのゼラチン性タンパク質でコーティングを行う場合は、まず、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるため、タンパク質を1 mLずつ分注して凍結させます。

次に、1 mLの凍結アリコートを融解し、19 mLのDMEM F12で再懸濁します。この混合液5 mLを10 cmディッシュに播種し、室温（RT）で1時間インキュベートします。その後、細胞を播種する直前にゼラチン状のタンパク質を吸引し、DMEM F12で洗浄します。このディッシュのコーティングを行う間に、hPSCsが約80%のコンフルエンシーに達しているプレートを選択します。

hESC培地を吸引します。次に、PBSで細胞を洗浄します。PBSを除去した後、0.05% trypsin-EDTAを3 mL、プレートに加えます。

MEFが単一細胞として剥離し始めるのが顕微鏡下で観察されるまで、ディッシュを水平方向に2分間激しく振ります。この間、hPSCコロニーはプレートに付着したままであると考えられます。MEFが剥離し、かつhPSCコロニーが脱落する前に、トリプシンを吸引してください。

次に、10 µMのROCK阻害剤Y-27632 dihydrochlorideを含むhESC培地を10 mL、プレートに加えます。その後、コロニーの上でピペッティングを行い、細胞を剥離させます。次に、ゼラチン質タンパク質を含むディッシュに戻し、溶液を吸引します。

凝集物を除去するため、このディッシュをDMEM f12で洗浄します。そこにhPSCsを1:2の比率で播種します。次に、10 µMのY-27632 dihydrochlorideを含むhESC培地を、合計10 mLになるまでプレートに加えます。

細胞を37°Cで一晩インキュベートします。ROCK阻害剤を添加した培地を用いて、毎日細胞に給餌してください。hPSCsが80%コンフルエンスに達した時点で神経分化を開始し、この時点をDay 0と定義します。

分化を開始させるため、0日目と1日目に、100 nMのMP阻害剤であるLDN-193189および10 µMのactivinおよびNodal阻害剤であるSB 431542を含むKSR分化培地10 mLを細胞に添加します。2日目には、同濃度のBNP、activinおよびNodal阻害剤に加え、3 µMのWntアゴニストであるCHIR99021を含む培地に交換して継続します。その後、3日目に、10 µMのSB 431542および3 µMのCHIR99021のみを添加したKSR分化培地を細胞に添加します。

75% KSR分化培地と、3 µMのWntアゴニストを含む25% N2分化培地の混合液を調製します。4日目と5日目に、この液体を15 mLずつ細胞に添加します。次に、6日目と7日目には、50% KSR分化培地と50% N2分化培地の混合液に、3 µM CHIR99021、25 ng/mL BMP4、および100 nM EDN3を添加した培地15 mLを細胞に添加します。

次に、8日目と9日目に、6日目および7日目に使用したものと同じ濃度の因子を添加した、25% KSR分化培地と75% N2分化培地の混合液 20 millilitersを細胞に添加します。10日目になり、3 micromolar CHIR99021、25 nanograms per milliliter BMP4、および100 nanomolar EDN3を含むN2分化培地 20 millilitersを添加し、神経分化を継続します。11日目に、あらかじめPO laminin 1およびフィブロネクチンでコーティングしたディッシュから溶液を吸引除去します。

その後、プレートを蓋なしのまま組織培養フード内に約10〜15分間放置し、完全に乾燥させます。次に、11日目の細胞から培地を除去し、PBSで洗浄します。その後、ディッシュに4 mLの細胞剥離溶液を加え、37 °Cで25分間インキュベートします。

インキュベーション後、ディッシュに5 mLのメラノサイト完全培地を加えます。そして、細胞がプレートから剥がれるまで、ピペッティングで手動で再懸濁します。懸濁液を15 mLチューブに移し、200 Gで5分間遠心分離して細胞を回収します。トリパンブルー排除法と血球計数器を用いて細胞数をカウントした後、細胞を2×10⁶ cells/mLの密度でメラノサイト完全培地に再懸濁します。

乾燥しコーティングされたディッシュ上に、細胞懸濁液を10 µLずつ滴下します。液滴同士が接触しないよう近づけて配置し、エッジが明確で、液だれしていないことを確認してください。細胞を接着させるため、液滴を室温で10〜20分間静置します。

その後、付着した細胞を乱さないように注意しながら、10 millilitersの完全メラノサイト培地をディッシュにゆっくりと加えます。次に、ディッシュをインキュベーターに移します。2〜3日ごとに完全メラノサイト培地で細胞に給餌してください。

そして、1週目の終わりまでに細胞のクラスターに色素沈着が観察されることを確認してください。週に1回、前述の方法で細胞剥離液を用いて細胞を継代します。細胞を回収し遠心分離した後、無添加のNeurobasal培地で2回洗浄します。

次に、PO、ラミニン1、およびフィブロネクチンでコートしたディッシュを用い、完全メラノサイト培地にて細胞を1:6の比率で再播種します。分化開始から約30日後になると、細胞は濃い色素を帯びた外見になります。これは、高密度で播種した際や、継代時のペレット状態で容易に視認できます。

ここでは、記述した分化プロトコルの11日目まで培養し、再播種する前の、トランスジェニックpsox10 GFPヒト胚性幹細胞株の明視野像を示しています。これらの培養細胞では、細胞が濃い定義された隆起を形成しているのが見て取れます。これらの培養細胞でGFPシグナルを評価したところ、この濃い隆起部分にsox10陽性細胞が集積していました。

sox10は神経堤幹細胞によって発現が上昇し、メラノブラストにおいて維持される転写因子であるため、これらの結果は、本分化法により11日目までに最終的にメラノサイトへと分化する細胞が濃縮されたことを示唆している。その証拠として、プロトコルの20日目までに、培養物の中には無色素の細胞、成熟過程にある細胞、および完全に成熟した有色素メラノサイトが含まれていた。25日目においても、培養物中で同様の細胞種が観察された。

これらの調製物における成熟および色素形成済みメラノサイトの存在は、2つのメラニン産生タンパク質を用いた染色によって確認されます。TYRP2はメラノブラストとメラノサイトの両方のマーカーとして機能し、TYRP1は色素形成済みのメラノサイトのみで発現するメラノサイトの後期マーカーです。このプロトコルを習得すれば、ヒト多能性幹細胞を25日間で完全に色素化した成熟メラノサイトへと分化させることができます。

このプロトコールでは、まず神経堤状態を経てメラノブラスト段階へと進み、通常のメラノサイト分化を進行させます。