Name: ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶ 遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御法。海馬ニューロンを用いて、特定タンパク質の神経シグナル伝達への寄与を高い時空間分解能で解明する手法です。

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ニューロン培養とCa-Pトランスフェクションに関する有益な議論をしてくださったS.Szobota博士に感謝します。L.W.は、The Salk Innovation Grant、California Institute for Regenerative Medicine(RN1-00577-1)、およびNational Institutes of Health(1DP2OD004744)からの支援に感謝します。

現在の研究のすべての手順は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）を用いて実施したソーク研究所、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州で動物取扱プロトコルを承認 1. UAA Kir2.1で設立し、初代神経細胞培養における結果として生じるPIRKの発現<ol><li> DNA構築<ol><li> UAAの取り込みのためのKir2.1の標的部位を選択します。光応答UAA組み込まれたと選択されたサイトはKir2.1機能21の光変調を可能にするように、Kir2.1の構造と機能についての事前の知識や情報を活用します。 </li><li> TAGアンバー終止コドンに変異選ばれたサイトとの組換えDNAをコードするKir2.1遺伝子を構築します。哺乳動物発現プラスミドにKir2.1-TAGのDNAをクローニングするために、標準的なクローニング技術25を使用してください。 </li><li> UAAに特異的であり、に応じて、UAAを組み込むクローンのtRNA /合成酵素遺伝子別の哺乳動物発現プラスミド21にTAG終止コドン。 注：最適なUAAを組み込むための、（のtRNA、シンテターゼ、およびKir2.1のために）別のプロモーターおよび遺伝子カセットの組み合わせが異なるプラスミドで試験することができます。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってミニプレップまたはマキシプレップ市販のキットを用いて高品質のプラスミドDNAを得ます。 260/280比の1.9の周りに精製されたDNAに最適です。必要な場合、プレップDNA 25の純度を確認するためにアガロースゲル電気泳動を行います。高純度のスーパーコイルプラスミドDNAは、神経細胞のトランスフェクションに最適です。 </li></ol></li><li>文化ラット海馬一次ニューロン<ol><li>場所のカバーガラス24ウェルプレート中（円、直径12ミリメートル）、各ウェルに1カバーガラス、およびコート各ウェルに0.5mg / mlのポリ-D-リジン（100mMのホウ酸緩衝液中の250μlの持つ：1.24グラムのホウ酸および脱イオン蒸留H 2 OまたはのddH 2の400ミリリットル中1.90グラムの四ホウ酸ナトリウム</su室温で10時間以上のためのpH 8.5でB&gt; O）、密封されました。子犬当たり約10-12コーティングされたカバースリップを準備します。 </li><li>解剖の日に、イソフルランでそれらを麻酔し、decapitating後に出生後の仔ラット（1-4生後日）から新生児の脳を収集します。イソフルラン（2-4％）を含む麻酔室に子犬を麻酔。彼らは意識を失い、触覚刺激にし、足のピンチに応答しないまで待ってください。 </li><li>標準的な技術26を使用して、（〜37℃）生理食塩水（10mMのHEPESおよびハンクス液で追加した20mMのD-グルコース）暖かいに脳から海馬を解剖し、4.5ミリリットル温かい生理食塩水でコニカルチューブに海馬を集めます。 </li><li>海馬（0.25％最終トリプシン濃度）を2.5％トリプシンの500μlを添加し、37℃の水浴中で10分間インキュベートします。 </li><li>徹底的に生理食塩水（3×10ml）および粉砕物を用いて組織をすすぎます。 </li><li> 1ミリリットルワットで解離ニューロンを回復5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した最小必須培地（MEM）を含有するアーム増殖培地、21.2 mMのD-グルコース、2mMのL-グルタミン、2％B-27、および0.1％血清エクステンダー。 注：新鮮な増殖培地を準備するために解剖の日にL-グルタミンおよびB-27を追加します。 </li><li>血球計数器を持つニューロンをカウントし、40μmのナイロンメッシュを通して濾過した後、500μlの増殖培地で1.0〜1.5×10 5細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートにカバーガラス上にそれらをプレート。 </li><li> 2-3週間95％空気加湿インキュベーター：5％CO 2中35℃での神経培養をインキュベートします。最良の結果については、インキュベーション中に可能な限りの文化を乱しません。 </li></ol></li><li>初代神経培養のリン酸カルシウム（CA-P）トランスフェクション<ol><li> 4℃でストック溶液とストアを行います。0.5 M BES（N、N -ビス[2-ヒドロキシエチル] -2-アミノエタンスルホン酸）緩衝液（10倍）。 150mMののNa 2 HPO 4（100倍）。 2.8 MのNaCl（10X）;無菌のddH 2 O;滅菌1NのNaOH。 </li><li>トランスフェクションの日に、0.22μmのフィルターでのddH 2 Oで新鮮2.5 MのCaCl 2溶液および滅菌フィルターを作ります。 0.22μmのフィルターを用いてpHを7.00（NaOHでpHを調整）し、滅菌フィルターの50mMのBES、1.5mMののNa 2 HPO 4、および280 mMのNaClを含有する新鮮な2×BES緩衝生理食塩水（BBS）のバッファを作成します。 注：トランスフェクトするのCaCl 2溶液とカバースリップの数に応じてBBSバッファの量を計算します。また、1.3.4を見てください。 </li><li> 500μlの新鮮な予熱したトランスフェクションの増殖培地で培養増殖培地を交換してください。 （トランスフェクション培地はMEMプラス21.2 mMのD-グルコースを用いて作製することができます）。 注意：古いメディアを廃棄しないでください。 </li><li> ddH 2 Oの量を計算し、1.65μlののCaCl 2、0.7μgのDNAを含有するトランスフェクション溶液（各カバースリップあたり33μl）を作るために追加するための準備、および16.5＆＃181;リットルの2×BBS。 </li><li>文化に追加する前に、すぐにトランスフェクション溶液を準備します。ゆっくりチューブを攪拌しながら準備するには、最初のCaCl 2とのddH 2 Oを兼ね備えています。攪拌を続行し、ゆっくりと溶液中にDNAを追加します。攪拌しながら最後に、2×BBS緩衝滴下を追加します。 </li><li>すぐに神経培養の各カバースリップにトランスフェクション溶液の30μlを添加します。 </li><li> 45分〜1時間の95％空気の加湿インキュベーター：溶液を混合し、5％CO 2中35℃でインキュベートし、培養皿を数回揺すります。ニューロンは、トランスフェクション溶液と共にインキュベートした後、非常に細かいのCa-P析出物は、ニューロンを覆う層を形成します。 </li><li> 500μlの予熱した洗浄緩衝液（135mMのNaClを、20mMのHEPES、4のKCl、2mMのCaCl 2を、1mMのMgCl 2、1 mMののNa 2 HPO 4、pHが7.3で10 mMグルコース、無菌でトランスフェクション培地を交換してください0.22μmのフィルターで濾過）し、35でインキュベート6; 5％CO 2でC：15-20分間、95％空気の加湿インキュベーター。 Ca-Pの析出物は、洗浄工程の後に消えてしまいます。 </li><li> 500μlの新鮮な増殖培地で洗浄緩衝液を交換してください。ここでも、保存された元のメディアに成長培地を交換してください。 </li><li> 1 mMの最終濃度に達するように培養し（50μlの暖かい増殖培地中でプレミックス）UAA CMNを追加します。 </li><li>アッセイの前に12から48時間、インキュベーターを加湿95％空気：5％CO 2中35℃でトランスフェクトされた培養物をインキュベートします。 </li></ol></li><li>光活性化と細胞全体の録音<ol><li>余分な/細胞内の溶液を調製します。細胞内液は、135mMのグルコン酸カリウム、10mMのNaClを、2のMgCl 2、10mMのHEPES、1mMのEGTA、2.56 mMのK 2 ATP、およびpH7.4の0.3mMのリチウム2 GTPが含まれています。細胞外記録溶液は、150mMのNaCl、3mMの塩化カリウムを含有する5mMのMgCl 2、0.5mMのCaCl 2を、5mMグルコース、およびpH7.4の10mMのHEPES。 </li><li4X及び20X目的​​を取り付けた顕微鏡、微分干渉コントラスト（DIC）、およびmCitrineフィルター（励起：495/10 nmの発光：25分の525 nm）を&gt;全細胞パッチクランプ用の電気生理学リグを設定します。マニピュレータ;パッチクランプ増幅器。デジタイザ;データ収集および分析ソフトウェア。 <ol><li> 45°の角度で1センチメートルawayから焦点に光を提供するためにリグの顕微鏡により385 nmでの発光の発光ダイオード（LED）をインストールします。光パワーメータとLEDの電源を確認してください。 </li></ol></li><li> 3-6MΩピペット耐性を持つように商業マイクロピペットプラーを用いてガラス電極からパッチピペットを引き出します。マイクロピペットプラーを設定するには、製造元の指示に従ってください。 <ol><li>ピペット抵抗をテストするには、最初に細胞内溶液でピペットを記入し、電極ホルダ上に配置します。顕微鏡P上に配置された細胞外溶液を充填した35mmの培養皿にピペットを浸しlatform。回路を完成するために皿に接地電極を浸し。 </li><li>アンプ/デジタイザをオンにして、データ収集ソフトを起動します。膜の試験プロトコルを用いてピペットの抵抗を監視します。 </li></ol></li><li>インキュベーターからニューロン文化のカバースリップを取り出し、細胞外液中に一回すすぎます。真空グリースを使用して、新鮮な細胞外液で満たされた35mm培養皿の中央にカバースリップを押したままにします。 </li><li>電気生理学顕微鏡プラットフォーム上のカバーガラス/皿を置きます。 </li><li>標準パッチクランプ技術を用いて、mCitrine蛍光27でニューロンにパッチを適用。電流クランプ（I-クランプ）メソッドを使用して録音神経活動。まず、小電流を注入することによって周り-72 mVでの静止電位を調整します。その後、活動電位の連続発射（5-15 Hz）を誘導するためにステップ電流（10-200 PA）を注入します。 </li><li>手動で、またはデータ収集ソフトウェアを使用して、パルスフラッシュ（罪GLE記録中のニューロンへのLEDライトの100ミリ秒-1秒の持続時間）のパルス、および活動電位が影響を受けるかどうかを確認します。 </li><li>浴に0.5 mMののBaCl 2を追加し、活動電位が回復しているかどうかを確認します。 </li></ol></li></ol> 2. Kir2.1でUAA定款およびin vivoでのマウス胚の脳内の結果として生じるPIRKの発現<ol><li> DNA構築<ol><li>ステップ1.1と同様にプラスミドDNAを設計します。 in vivoでの発現のために、このようなCAG（CMVエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーター）などの強力なプロモーターを使用しています。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、エンドトキシンフリーマキシプレップ市販のキットを用いてDNAを精製します。 （2-5μgの/μlに凝縮）極めて高品質のDNAを取得するためにエタノール沈殿25に続くフェノール-クロロホルム抽出を行います。 </li></ol></li><li>マウス胚新皮質への子宮内エレクトロポレーションで 注：基本的なテクニック子宮内エレクトロポレーションのためのqueのは、以前28に記載されています。 <ol><li>ペントバルビタールナトリウム（腹腔内注射、グラム体重あたり50μgの）またはイソフルラン（吸入、2から4パーセント）と胎生14.5（E14.5）で時限妊娠マウスを麻酔。意識の喪失および触覚刺激に応答なしをチェックすることにより、そして足のピンチに麻酔深度を監視します。 </li><li>腹部正中線に小さな切開を行います。静かに鉗子や指先で子宮角を露出させます。 </li><li>子宮壁を通して挿入されたガラスピペットを用いて各同腹の側脳室へ（コンストラクトに応じて、各プラスミドの2-5μgの/μL、）約1μlのDNA溶液を注入します。ほとんどの場合、総胚の約60〜80％が注入されます。 </li><li>エレクトロ（33-35 V、50ミリ秒の持続時間、950ミリ秒間隔、4-8パルス）で胚をエレクトロポ。 </li><li>以下のために静かに腹腔に子宮角を返します。CEPSと指先。筋肉壁を縫合した後、胚は開発を継続することを可能にする手術用縫合糸で皮膚。 </li></ol></li><li> UAAマイクロインジェクション<ol><li> E16.5で再び腹部正中線に小さな切開を行い、そして静かに鉗子や指先で子宮角を露出させます。 </li><li>エレクトロ側又は子宮壁を通して挿入ガラスピペットで側脳室の両側に約2~5μlのCMN-ALA（500ミリモル）を注入します。 CMNの生物学的利用能を高めるために、 生体内 21 に CMNを提供するためにジペプチドCMN-ALA（CMN-アラニン）を使用します。 </li><li>ここでも、ピンセットと指先で軽く腹腔に子宮角を返します。筋肉壁を縫合した後、胚は開発を継続することを可能にする手術用縫合糸で皮膚。 </li></ol></li><li>急性脳スライスを取得<ol><li> 119のNaCl、2.5mMのKClを、1.3のMgCl 2、2.5 mMの塩化カルシウムを含む1 L人工脳脊髄液（ACSF）を作ります<sUB&gt; 2、1mMののNaH 2 PO 4、26.2 mMの炭酸水素ナトリウム、及びpH 7.3の11 mMグルコース。 </li><li> 20〜30分間、-80℃で200ミリリットルのACSFと高速凍結してください。室温で95％O 2ガス：CO 2 5％とバブルACSFの残りの部分を。 </li><li>胚からの脳を採取する手術ツールを準備し、滅菌します。また、氷のバケツを用意。 </li><li>電子レンジで加熱することによりフラスコ中〜100ミリリットル4％低融点アガロース溶液を作ります。それが固化し始める前に、約5分間のソリューションをクールダウン。 </li><li> CO 2過剰投与によりCMN-Alaの注射後のマウス12-24時間を安楽死させます。腹部に大きな切開を行い、微細なハサミやピンセットで子宮からのエレクトロポレーション/マイクロインジェクション胚を解剖します。 </li><li>細かいハサミやピンセットで胚からの収穫の脳。 </li><li>アイスバケットに配置された10cmの培養皿上で各脳を置きます。鋭い刃を使用して2つの半球を分割し、それぞれを配置皿の底に触れる正中矢状面と皿の上半球。迅速（半球あたり500μlの周りの）脳の上にアガロース溶液を注ぎます。 </li><li>鋭い刃を使用して、正方形の脳に埋め込まれたアガロースブ​​ロックを作るために、脳の周りにアガロースを切りました。 </li><li>組織接着剤を使用して、ビブラトームのマウント上のアガロースブ​​ロックの正中矢状平面ダウン接着剤。予め冷却ACSFでビブラトーム室を記入し、200μmの矢状脳スライスをカット。 </li><li> 95％O 2ガス：5％CO 2でバブリングしながら42分間33℃で3mmのミオの -イノシトール、0.4mMのアスコルビン酸、および2mMのピルビン酸ナトリウムを補充したACSF中の急性切片をインキュベートします。 </li><li> 42分後、ヒーターをオフにして泡立てながら室温でスライスをインキュベートし続けます。ヒーターをオフにした後、全細胞パッチ記録を少なくとも15分を開始します。 </li></ol></li><li>光活性化と細胞全体の録音<ol><li> INTRACを準備130ミリモルのグルコン酸カリウム、4のMgCl 2、5mMのHEPES、1.1 mMのEGTA、3.4 mMののNa 2 ATP、10mMのナトリウムクレアチンリン酸、およびKOHでpH調整7.3で0.1mMののNa 3 GTPを含むellularソリューション。 </li><li> 3-6MΩピペット耐性を持つように商業マイクロピペットプラーを用いてガラス電極からパッチピペットを引き出します。 </li><li>全細胞パッチクランプ用のスライス電気生理学リグを設定し、2ミリリットル/灌流ポンプと分の速度でACSFで記録チャンバーを表面かん流します。周りに33°Cにチャンバ温度を調整します。 注意：スライスの電気生理学リグは、灌流チャンバー、水浸対物レンズ及び温度コントローラを備えています。また、GFPフィルター（励起：30分の480 nmの発光：40分の535 nm）をmCherryをフィルター（励起：20分の580 nmの発光：130分の675 nm）が必要です。 <ol><li> 45℃で1センチメートルawayから焦点に光を提供するためにリグで顕微鏡で385nmでの発光のLEDインストール角度。光パワーメータとLEDの電源を確認してください。 </li></ol></li><li>慎重に灌流チャンバー内のガラスピペットと場所で脳スライスを拾います。ハープとのスライスを押したままにします。 </li><li>新皮質領域27からmCherryを/ GFPの蛍光を有するニューロンにパッチを適用します。電圧クランプ（V-クランプ）メソッドを使用してレコードPIRK活動。まず、-60 mVので膜電位を保持します。次に、固定された負の膜電位（-100 mVの）または電圧ランプでの記録電流（+ 40mVまでには-100mV）。具体的には、-100mVのでKir2.1特定の内向き電流を監視します。 </li><li>手動、またはデータ収集ソフトウェアを使用して、記録しながらニューロンにLED光のパルス（100ミリ秒-1秒の持続時間の単一パルス）を点滅し、PIRKタンパク質が活性化されるかどうかを確認します。 PIRKが起動されると、-100 mVので内向き電流が大幅に増加するであろう。 </li><li>浴に0.5 mMののBaCl 2を追加し、PIRKが再び不活性化されるかどうかを確認します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

効果的な光変調を実現するために、重要な最初のステップは、ここで標的タンパク質に光応答UAAを組み込むことを決定することです。標的タンパク質の構造的および機能的情報は、候補サイトの選択を導くために非常に有用です。これと同時に、光調節の目的は、最も適しているサイト決定するであろう。候補地を選択した後、私たちは、一次ニューロンへとin vivoで進める前に、このようなヒト胚性腎臓（HEK）容易文化や操作のための細胞などの哺乳動物細胞株でサイトをテストすることをお勧めします。 Kir2.1光活性化のための部位を同定するために、Kir2.1の孔に沿って複数のサイトが最初にHEK細胞で試験されています。 C169が存在Kir2.1孔径はCMN側鎖を収容するのに十分な大きさが、イオンの通過を遮断するCMN側鎖のために十分に小さいため、Kir2.1のC169は、最適な発見されました。 CMNはKir2.1にC169に組み込まれたときにHEK細胞で発現、トン彼は不活性であったが、成功したPIRK開発21を確認し、光の短いPuleの際に活性化になった突然変異体Kir2.1を結果として生じます。 <p clas...

従来の電気刺激に比べて、光刺激は、検体の生理学的システムへの干渉が最小と大きな時間的、空間分解能を提供しています。 1971年1でニューロンを刺激するためにレーザーを使用してのデモンストレーション以来、多くの創造的な方法は、外因的に光で神経活動を制御するために発明されています。フォトケージアゴニストの光学リリースが長いリガンド2,3,4への神経回路網の生理学的応答を研究するために使用されています。この技術は、ケージドアゴニストの拡散に起因する特異性が限られています。遺伝子特異性は、異所的に発現している感光性オプシンチャネルによって達成さ5,6,7ポンプ 、正常に多様なモデル生物における選択された神経回路網を調節するために適用されているされています。しかし、他のタンパク質へのオプシンタンパク質からの光応答をグラフトするため、光学的に、様々な他のニューロンタンパク質を制御するためにこの方法を適用することは困難であろうwoul検討中のタンパク質の天然の特性を変更することができる強烈なエンジニアリングを必要とdは。化学的にタンパク質の外因性の感光性リガンドがチャネルタンパク質8,9,10の機能を制御する別の方法を示した係留。リガンドが提示またはアゾベンゼン部分の光異性化を介してタンパク質の結合部位から引き抜かれます。テザリング化学は、細胞内側面と細胞内タンパク質を除き、主に膜タンパク質の細胞外側への適用を制限します。 光応答Uaasは、タンパク質に組み込まれた後、光を有するタンパク質を操作するための一般的な戦略を提供します。初期の努力では、化学的にフォトケージUaasでアシル化したtRNAは、その構造と機能の関係12,13,14の理解を進めてきた膜受容体およびイオンチャネル11へUaasを組み込むためにアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクションしました。このマイクロインジェクション法は、主に大規模な卵母細胞に限定されています。 UAAの遺伝的取り込みは、生細胞15,16,17,18における内因性タンパク質の翻訳を介してUAAを組み込んだ直交tRNA /シンテターゼ対を使用して技術的に困難のtRNAアシル化およびマイクロインジェクションをバイパスします。神経タンパク質へUAAの取り込みは、一次ニューロンおよび神経幹細胞19,20に実証されています。最近では、光応答UAAは、遺伝的に初めて21 in vivoでの哺乳類の脳内の神経タンパク質に組み込まれています。これらの進歩は、それらの天然の細胞環境にUaasと神経細胞のタンパク質を研究することを可能にします。 内向き整流カリウムチャネルKir2.1は、細胞の外よりにより容易にK +電流を通過させる強力な整流器であり、細胞の興奮性、血管緊張、心拍数、再を含む生理学的プロセスを調節するのに不可欠です最終塩の流れとインスリン放出22。 Kir2.1の過剰発現は少なく、興奮23,24となるターゲットニューロンの膜電位を高分極します。カンら 、そのネイティブの細胞におけるKir2.1光学的に制御する。Kir2.1への遺伝的に組み込まれた光応答性UAAは、哺乳動物細胞、神経細胞および胚性マウス脳21で表しました。光の短いパルスは、このようにターゲットKir2.1タンパク質を活性化する、天然アミノ酸のCysにUAAを変換することができました。この写真誘導性内向き整流カリウム（PIRK）チャネルタンパク質は、ラット海馬初代神経細胞で発現させた場合には、光活性化に応答してニューロンの発火を抑制しました。また、PIRKチャネルは、胚性マウス新皮質で発現させ、皮質ニューロンにおける光活性PIRK電流を測定しました。哺乳類の脳におけるインビボでのUAA技術の実装を成功させるには、光学的にニューロンタンパク質を制御するための扉を開きます彼らのネイティブ環境で、分子レベルでの神経細胞のプロセスとメカニズムの光学解剖を可能になります。 このプロトコルでは、文化およびin vivoでのマウス胎児の脳内の主要なニューロンへUaasの遺伝子組み込みのための手順について説明します。光応答UAA CMNとKir2.1処理を説明するために使用されます。成功UAA取り込みおよび神経タンパク質活性の光制御を評価するための方法が提供されます。このプロトコルは、遺伝的に神経細胞およびin vivoで Uaasをコードする、および光学的に光応答UAAを介した神経タンパク質の機能を調節するために明確なガイドを提供します。私たちは、このプロトコルは、神経科学と光遺伝学、生物学的研究のためのin vivoでの UAA技術の採用を促進することを期待しています。

<table><tbody><tr><td>カバーグラス、サークル、12 mm、厚さ0.13-0.17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>虹彩へら湾曲</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>解剖ナイフ - 細かい角度の先端</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & micro;m Cell Strainer</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>LED光源 &ndash;ブラックLED 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース、低融点、分析グレード</td><td>プロメガ</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

光刺激は、優れた空間的および時間的解像度で生物学的イベントを制御する非侵襲的な方法です。天然環境で発現する内因性タンパク質を光制御するための新しい方法が望まれています。ここでは、遺伝的にコードされた非天然アミノ酸(Uaa)を使用して、ニューロン内のニューロンタンパク質の機能を光学的に制御するアプローチを紹介します。直交するtRNA/アミノアシル-tRNA合成酵素ペアを使用して琥珀色のコドンを抑制することにより、光反応性Uaa 4,5-ジメトキシ-2-ニトロベンジル-システイン(Cmn)が、内向きに整流するカリウムチャネルであるニューロンタンパク質Kir2.1の細孔に部位特異的に取り込まれます。かさばるCmnはチャネルの細孔を物理的にブロックし、Kir2.1を非導電性にします。光の照明は、Cmnを瞬時に小さな天然アミノ酸Cysに変換し、Kir2.1チャネル機能を活性化します。我々は、これらのpホト誘導性in方向レクト化カリウム(PIRK)チャネルをラット海馬初代ニューロンに発現させ、PIRKの光活性化が活性化されたKir2.1チャネルを通るK+電流の流出によりニューロンの発火を停止することを実証した。また、インウテロエレクトロポレーションを用いて、in vivoのマウス新皮質胚でもPIRKを発現させ、新皮質ニューロンにおけるPIRKの光活性化を示しています。Uaaを遺伝的にコードするものは、標的タンパク質の種類や細胞の位置に制限を課さず、光反応性Uaasのファミリーは、異なる天然アミノ酸残基を調節するために利用可能です。したがって、この技術は、脳内のさまざまなプロセスの光学的調節を達成するために、多くのニューロンタンパク質に一般的に適用される可能性を秘めています。現在のプロトコルは、分子レベルでのニューロンタンパク質活性の光制御を達成するために、in vitroおよびin vivoでニューロンに複雑なUaaを組み込むためのアクセス可能な手順を示しています。

遺伝的に神経細胞におけるタンパク質にUAAを組み込むために、最初の重要なステップは、適切な遺伝子を提供し、神経細胞に効率的に遺伝子を発現するために構築設計することです。 UAAの取り込みのための3つの遺伝子コンポーネントがある：（1）UAA取り込み（2）変異したTAG停止コドンを認識する直交tRNA、及び（3）直交アミノアシルために選択された部位に導入されたTAGアンバー終止コドンを有する標的遺伝子-tRNAシンテターゼは直交tRNAにUAAを充電します。各コンポーネントは、適切なプロモーターによって駆動される必要があります。これら三つの遺伝子カセットは、1つのプラスミドに含まれる、またはいくつかのプラスミドに分離することができます。ニューロンにおけるPIRKを表現するために、光反応性UAA CMNは直交tRNA Leuの CUA / CmnRS（CMN-tRNA合成酵素）CMN 21,29のために特異的であるように進化したペアを使用して、Kir2.1に組み込まれています。 Kir2.1遺伝子の残基Cys1...

ここでは、光反応性の非天然アミノ酸を遺伝子的にコード化することにより、短い光パルスでニューロンタンパク質を選択的に活性化する手順を、培養中または生体内でニューロンで発現するニューロンに提示します。

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

この手順の全体的な目的は、遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いて、ニューロンにおけるニューロンタンパク質の機能を光学的に制御することです。この手法は、脳機能におけるニューロンシグナリングに対する特定のニューロンタンパク質の寄与について、空間的・時間的分解能を持って重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまなニューロンタンパク質に適用できる可能性があり、多様なニューロンプロセスの光学的調節を実現できることです。まず、40 µmのナイロンメッシュでろ過した後、海馬ニューロンを500 µLの増殖培地とともに24ウェルプレート内のカバーガラス上に播種します。その後、ニューロン培養物を35 °C、5% CO₂、95% 空気の加湿インキュベーターで2〜3週間培養します。トランスフェクションの当日、2重蒸留水を用いて2.5 Mの塩化カルシウム溶液を調製し、0.22 µmフィルターで滅菌ろ過します。次に、pH 7の2X BBSを調製し、0.22 micrometreフィルターで滅菌ろ過します。その後、培養成長培地を500 microlitresの新鮮で予熱したトランスフェクション培地と交換します。この際、古い成長培地は廃棄しないでください。トランスフェクション溶液は、チューブをゆっくりと攪拌しながら塩化カルシウムと二回蒸留水を混合し、培養細胞に添加する直前に調製します。チューブを攪拌し続けながら、DNAを溶液にゆっくりと加えます。次に、2X BBSバッファーを滴下します。2X BBSバッファーの調製はリン酸カルシウム法によるトランスフェクションにおける重要なステップであり、新しいDNAコンストラクトや調製物を用いる場合は、2X BBSバッファーの最適pHを6.90から7.15の間で調整することが推奨されます。次に、神経細胞培養の各カバースリップに、トランスフェクション溶液を30 µLずつ直ちに加えます。培養皿を数回揺らして溶液を混ぜ合わせ、35 °Cで45分から1時間インキュベートします。約1時間後、神経細胞を覆うように微細なリン酸カルシウム沈殿の層が観察されるはずです。次に、トランスフェクション用培地を 500 µL の予熱した洗浄バッファーに置換し、35 °C で 15 ～ 20 分間インキュベートします。洗浄後、リン酸カルシウムの沈殿物は消失しているはずです。続いて、洗浄バッファーを 500 µL の新鮮な増殖培地に置換します。その後、培地を保存しておいた元の培地に交換します。次に、1 mMの最終濃度になるように、50 µLの温めた培地にあらかじめ混合した非天然アミノ酸Cmnを培養液に添加します。記録を行う前に、トランスフェクションした培養物を35 °Cで12〜48時間インキュベートします。この手順では、細胞外および細胞内溶液を調製します。本装置では、385 nmの波長で発光するLEDを顕微鏡の横に設置し、焦点から1 cm離れた位置に45度の角度で光を照射するように構成しています。次に、マイクロピペットプラーを用いて、ガラス電極からパッチピペットを数本作製します。その後、インキュベーターからニューロン培養済みのカバーガラスを取り出し、細胞外液で一度洗浄します。リグに細胞外液を十分に灌流します。続いて、標準的なパッチクランプ法を用いて、カバーガラスを電生理学顕微鏡のプラットフォーム上に設置します。M-citrine蛍光タンパク質を導入したニューロンをパッチクランプします。次に、カレントクランプ法を用いてニューロン活性を記録します。まず、静止膜電位を約-72 mVに調整します。次に、ステップ電流を注入し、5～15 Hzで活動電位を連続的に発火させます。記録しながら、ニューロンに単一のLEDパルスを照射し、活動電位の変化をモニタリングします。その後、バスに0.5 mMの塩化バリウムを添加し、活動電位を回復させます。急性脳切片を用いて、新皮質領域からM-cherry GFP蛍光を発するニューロンにパッチクランプを行います。次に、電圧ランプ法を用いてPIRK活性を記録します。具体的には、-100 mVにおけるKir2.1特異的な内向き電流をモニタリングします。次に、記録を行いながらニューロンに単一のLEDパルスを照射し、PIRKタンパク質が活性化されるかを確認します。PIRKが活性化されると、-100 mVにおける内向き電流が著しく増加します。最後に、バス溶液に0.5 mMの塩化バリウムを添加し、PIRKが不活性化されることを検証します。ここでは、健康なラット海馬ニューロン培養の代表的な画像を示します。また、ふっくらとした細胞体と、明瞭な樹状突起および軸索を持つ2つの健康なニューロンを示しています。これらは、in vitroで培養され、CMNを伴わずにPIRK発現のためにトランスフェクションされたラット海馬ニューロン培養のDIC像および蛍光像です。1 mMのCMN存在下において、トランスフェクションされたニューロンはフルレングスのPIRK M-citrineタンパク質を発現させることができ、その結果として緑色蛍光を示します。ここでは、単一の光パルスによって、PIRKを発現している海馬ニューロンの活動を抑制した例を示します。マウス胚性皮質ニューロンのこれらの蛍光画像は、in vivoにおいてCMNがGFPおよびKir2.1タンパク質に正常に組み込まれたことを示しています。このグラフでは、マウス新生皮質ニューロンから記録された電流により、PIRKの光依存的な活性化が示されています。この手法の意義は、特定のニューロンタンパク質の機能不全によって引き起こされる脳疾患（例えば、アンダーセン症候群におけるKir2.1の変異）の治療にまで及びます。なぜなら、この手法を用いることで、Kir2.1の欠損によってどの脳回路が影響を受けているかを明らかにできるためです。この技術を習得すれば、生きたニューロンにおいて、光を用いて極めて高い特異性でニューロンタンパク質の機能を制御することが可能になります。このビデオを視聴することで、ニューロン内のタンパク質に非天然アミノ酸を組み込み、目的とするニューロンタンパク質の光制御を実現する方法について深く理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

ChR2を表現成人生まれのニューロンは嗅覚神経回路の機能に向けての貢献を検討するために、スライスの電気生理学的な準備に操作することができます。...

ニューロンの光刺激のために手ごろな価格のLEDアレイを使用する

リボ核酸抗ターミネーターまたはRAT配列の下流に蛍光レポーター遺伝子を運ぶプラスミドで形質転換した コリネバクテリウムグルタミカム...

Corynebacterium glutamicumにおける遺伝子発現の光遺伝学的制御

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

この記事では、マレイミド色素の代わりに蛍光非天然アミノ酸（fUAA）を用いて、イオンチャネルの構造的再配列を調べる従来の電圧クランプ蛍光光度法（VCF）の強化について説明します。この手順には、 アフリカツメガエル卵母細胞DNA注入、RNA / fUAA共注入および同時電流および蛍光測定が含まれる。...

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA...

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。...

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。...

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

学ぶ 遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御法。海馬ニューロンを用いて、特定タンパク質の神経シグナル伝達への寄与を高い時空間分解能で解明する手法です。

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

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