ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

この手順の全体的な目標は、ニューロン内の遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を使用して、ニューロンタンパク質の機能を光学的に制御することです。この方法は、特定のニューロンタンパク質が脳機能のニューロンシグナル伝達に寄与するという重要な疑問に、空間的な時間分解能で答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまなニューロンプロセスの光学的調節を達成するために、さまざまなニューロンタンパク質に適用できる可能性があることです。

この手順は、40マイクロメートルのナイロンメッシュでろ過した後、500マイクロリットルの成長培地が入った24ウェルプレートのカバースリップに海馬ニューロンをプレーティングすることから始めます。その後、ニューロン培養物を摂氏35度で5%の二酸化炭素、95%の空気加湿インキュベーターで2〜3週間インキュベートします。トランスフェクションの日に、二重蒸留水で新鮮な2.5モルの塩化カルシウム溶液を作り、0.22マイクロメートルのフィルターで滅菌ろ過します。

次に、pH 7で新しい2X BBSを作製し、0.22マイクロメートルのフィルターで滅菌ろ過します。その後、培養増殖培地を500マイクロリットルの新鮮な温めたトランスフェクション培地と交換し、古い増殖培地を廃棄しないでください。トランスフェクション溶液を培養液に加える直前に、塩化カルシウムと二度蒸留水を組み合わせて、チューブをゆっくりと攪拌しながら

チューブを攪拌し続け、DNAを溶液にゆっくりと加えます。次に、2X BBS バッファをドロップワイズに追加します。2X BBSバッファーの調製は、ホソフィー酸カルシウムトランスフェクションにおける重要なステップであり、新しいDNAコンストラクトまたはプレップのために、2X BBSバッファーの最適なpHを6.90〜7.15に較正することをお勧めします。

次に、すぐに30マイクロリットルのトランスフェクション溶液をニューロン培養の各カバースリップに加えます。培養皿を数回揺らして溶液を混合し、摂氏35度で45分から1時間インキュベートします。約1時間後、ニューロンを覆う細かいリン酸カルシウム沈殿物の層が観察されます。

次に、トランスフェクション培地を500マイクロリットルの予熱済み洗浄バッファーと交換し、摂氏35度で15〜20分間インキュベートします。リン酸カルシウムの沈殿物は、洗浄後に消えるはずです。次に、洗浄バッファーを500マイクロリットルの新鮮な成長培地と交換します。

その後、成長培地を保存したオリジナル培地と交換します。次に、50マイクロリットルの温かい成長培地にあらかじめ混合した非天然アミノ酸Cmnを培養物に加えると、最終濃度が1ミリモルになります。トランスフェクションした培養物を摂氏35度で12〜48時間インキュベートしてから記録します。

この手順では、細胞外溶液と細胞内溶液を調製します。私たちのセットアップでは、385ナノメートルの発光を持つLEDが顕微鏡の隣に設置され、焦点から1センチメートル離れたところに45度の角度で光を届けます。次に、マイクロピペットプーラーを使用して、ガラス電極付きのパッチピペットを引っ張ります。

その後、インキュベーターからニューロン培養カバースリップを取り出し、細胞外溶液で一度すすぎます。リグを細胞外溶液でふんだんに使います。その後、標準的なパッチクランプ技術を使用して、カバーガラスを電気生理学顕微鏡プラットフォームに置きます。

M-シトリン蛍光でトランスフェクトしたニューロンにパッチを当てます。次に、電流クランプ法を使用してニューロンの活動を記録します。まず、静止電位を約マイナス72ミリボルトに調整します。

次に、ステップ電流を注入して、5〜15ヘルツの活動電位の連続発火を誘導します。記録中は、単一のLEDパルスをニューロンに送達し、その活動電位の変化を監視します。次に、0.5ミリモルの塩化バリウムを浴に加え、活動電位を回復します。

急性脳スライスの設定では、新皮質領域からのM-cherry GFP蛍光でニューロンにパッチを当てます。次に、電圧ランプ法を使用してPIRKアクティビティを記録します。具体的には、Kir2.1の特定の内向き電流をマイナス100mVで監視します。

次に、記録中に単一のLEDパルスをニューロンに送達し、PIRKタンパク質が活性化されているかどうかを監視します。PIRKが作動すると、マイナス100ミリボルトの内部電流が大幅に増加します。最後に、0.5ミリモルの塩化バリウムを浴に加え、PIRKが不活性化されているかどうかを確認します。

ここに示されているのは、健康なラット海馬ニューロン培養の例示的な写真です。そして、ふっくらとした細胞体と顕著な樹状突起と軸索を示す2つの健康なニューロン。これらは、in vitroでラット海馬ニューロン培養のDICおよび蛍光画像であり、CMNなしでPIRK発現のためにトランスフェクションされたものです。

1ミリモルのCMNの存在下では、トランスフェクトされたニューロンは完全長のPIRK M-シトリンタンパク質を発現することができ、したがって緑色の蛍光を示します。そして、これは、PIRKで発現した海馬ニューロンの活動を抑制する単一の光パルスの例です。マウス胚皮質ニューロンのこれらの蛍光画像は、in vivoでCMNがGFPおよびKir2.1タンパク質にうまく取り込まれていることを示しています。

このグラフでは、PIRKの光依存的な活性化は、マウスの新皮質ニューロンから記録された電流で示されています。この技術の意味は、特定のニューロンタンパク質の機能不全によって引き起こされる脳疾患の治療、たとえば、アンダーセンス症候群の変異Kir2.1の治療にまで及びます。なぜなら、この技術は、どの脳回路がKir2.1欠損の影響を受けているかを明らかにするのに役立つからです。この技術を習得すると、生きたニューロンで光によるニューロンタンパク質の機能を高い特異性で制御するために使用できます。

このビデオを見れば、目的のニューロンタンパク質に対する光制御を実現するために、ニューロンのタンパク質に非天然アミノ酸を組み込む方法について十分に理解できるはずです。