Name: 定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ微生物スライド拡散アッセイと染料放出アッセイを用いた抗菌タンパク質の定性的・定量的評価法。Salmonella entericaやBacillus subtilisなどの病原菌に対する酵素活性を迅速にスクリーニングする実験手法です。

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この作業は、MITREイノベーションプログラム（プロジェクト25MSR621-CA）を通じてMITREコーポレーションによって資金提供されました。著者は、この研究の支援とレビューについて、Mark Maybury博士、Richard Games博士、James Patton博士、Ellen Mac Garrigle博士、Carl Picconatto博士、およびCaroline Garyに感謝します。

細菌やペプチドグリカン基板の作製注：全細胞細菌の基質および精製ペプチドグリカンをマイクロスライド拡散アッセイおよび色素放出アッセイの両方で酵素基質として使用されます。これらの基質は、酵素反応を実施する前に準備を必要とします。以下のプロトコルは、それらの調製を説明しています。 <ol><li>全体の細菌の細胞基質<ol><li> 枯草菌 168 2mLの一晩培養物を栄養ブロスを500mlに接種することによって、細菌の細胞基質を産生する（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ATCC 23857）を。培養は細菌培養の倍増、その結果急速な成長期のように定義され、指数増殖期に達するまで（125 rpm）し振とうしながら30℃でインキュベートします。 サルモネラ菌亜種の栽培について。 エンテリカ （ATCC 10708）、（125 rpm）し振とうしながら37℃で増殖培地として栄養培地を使用しています。 </li&gt; <li>圧力の3気圧下で121℃で10分間オートクレーブ処理により各培養物を熱殺します。 </li><li> 5000×gで20分間遠心分離することにより、加熱死菌基板を収穫。タイプ1の水でペレットを3回洗浄し、最小量の水に再懸濁します。本研究では、1200μlの基質を一時停止します。 </li><li>小分けし、20℃で1.5ミリリットルマイクロチューブや店舗への細菌の細胞基質を300μl。 </li></ol></li><li>精製されたペプチドグリカン基板<ol><li> （ 材料および装置 表を参照）ターゲット基板細菌7-10からペプチドグリカンを精製またはベンダから取得します。アクセサリー細胞壁ポリマーからの粗ペプチドグリカン調製物を精製します。 </li></ol></li></ol>定性的マイクロスライド拡散アッセイ[Lachicaから変更された、 ら 。11] 注：マイクロスライド拡散アッセイでありますサンプル中の抗菌性酵素の存在を検出するための定性的方法。酵素が基質を含むアガロースマトリックスを通って拡散するように酵素が基質を加水分解したように、クリアのゾーンが開発しています。以下のプロトコルは、定性的タンパク質抗菌剤の存在を検出するためのマイクロスライド拡散アッセイの調製及び性能を説明します。 <ol><li>製造業者のプロトコルに従ってビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイキットを使用して評価される抗菌剤、酵素の濃度を決定します。 </li><li>酵素緩衝液としてリン酸緩衝食塩水（PBS）を利用します。しかし、経験的に所定の酵素のための適切なバッファを決定します。 </li><li>反応緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、抗菌性酵素の連続希釈を行います。これらのマイクロスライド拡散アッセイにおいて使用される連続希釈は0頁、10頁、100頁、は1ng、10ngの、100ngの、1μgの、1の最終アッセイタンパク質量を製造しました反応体積あたり0μgの。 </li><li>個々のマイクロチューブへのタンパク質の質量を分注し、反応ウェルをマイクロスライドに加えの準備のためにPBSを用いて20μlにタンパク質のボリュームを調整します。 </li><li> PBS 50ml中のアガロースを0.25gを溶解し、0.5％アガロース溶液を作ります。アガロースが完全に溶解するまで沸騰に溶液を加熱します。重量溶融プロセス中に失われた水を決定し、この溶液に戻って追加します。 </li><li>アガロース溶液に水中10％のアジ化ナトリウムの50μLを加え、水浴中で50℃に溶液の温度を調整します。アジ化ナトリウムは、マイクロスライド拡散アッセイのインキュベーション中に細菌増殖を汚染抑制するために添加されます。生存細胞を基質として使用される場合、アガロース溶液からのアジ化ナトリウムを省略する。 </li><li>氷の上で加熱死菌基板を解凍します。 </li><li>再懸濁アガロース溶液の12ミリリットル中の細菌の基板は、約2.0 MCFの濁度に合わせて等価標準を（ 材料表を参照してください）アーランド。おおよその濁度が達成されるまでアガロースに細菌の基質を加え、ソリューションを通じて白地に黒い線を可視化することにより、ソリューションの濁度を比較してください。 </li><li>すぐに各マイクロスライド（25×75×1ミリメートル3）にアガロース基質溶液3mlをピペット。 </li><li>スライドが固化した後、コルクボーラー（4.8ミリメートル径）を使用して、各マイクロスライドのアガロース基板層に3つのウェルをパンチ。それぞれのウェルにそれぞれ調整されたタンパク質の連続希釈液20μlを追加します。 </li><li>よく、陰性対照にPBS（20μL）またはウシ血清アルブミン（20μlのPBS中5μg）を使用します。陽性対照として、リゾチームなどの基板に適した既知の溶菌酵素を、使用してください。 </li><li> 37°Cまたは酵素の最適活性温度で湿度チャンバ内のスライドをインキュベートします。インキュベーションの長さは濃度に依存し、抗菌酵素の比活性。典型的な反応時間は一晩（約16時間）です。 </li><li>インキュベーション後、間接的な光の下でスライドを観察し、約30cmの焦点距離60 mmレンズとデジタル一眼レフカメラを使用して開発アッセイの画像を取り込みます。 注：指定された基板のためのタンパク質の抗菌剤の酵素活性は、酵素は、アガロース中に拡散としてだけでなく周囲に形成し、加水分解のクリアゾーンの開発と相関しています。 </li><li>酵素活性を修飾するために、各ウェルの周囲に形成領域のサイズを確認します。低い酵素活性を定性的に小さいゾーンに関連しながら、高い酵素活性を定性的に、より大きなゾーンに関するものです。 </li></ol> 3.基質の標識-レマゾールブリリアントブルーR色素標識化[周12から変更されました] 注：染料放出アッセイでは、基質は、共有結合であるリンケdはブリリアントブルーR染料をレマゾールします。以下のプロトコルは、染色された酵素基質の調製を記載します。 <ol><li> 200mMのレマゾールブリリアントブルーR色素（RBB）溶液を作製するために使用されるタイプIの水99 ml中に1gの水酸化ナトリウムを溶解し250mMの水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を作ります。 </li><li>新鮮な250mMのNaOH溶液（ステップ3.1）の98.75ミリリットル±1ミリリットル中1.25グラムのRBBを溶解することにより、200 mMのRBB液を作ります。 </li><li> RBB溶液30mlで0.5グラム湿重量の濃度で熱で死滅させた細菌細胞を再懸濁します。精製されたペプチドグリカンについては、RBB溶液30mlで0.3グラム湿重量の濃度のペプチドグリカンを再サスペンド。 </li><li>穏やかに混合しながら37℃で6時間、回転プラットフォーム上三角フラスコ中の反応混合物をインキュベートします。 </li><li> 4℃のインキュベーターに反応混合物を移し、穏やかに混合しながらさらに12時間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、3000×gで遠心分離することによって染色された基板を収穫30分間。基板ペレットから染料溶液をデカント。 </li><li>遠心分離したタイプIの水で繰り返し（約3〜5回の洗浄）を色素で標識された細胞またはペプチドグリカンを洗浄することにより、基材からの非共有結合した水溶性の染料を削除します。各水の添加により、徹底的にペレットを再懸濁します。 注：結合していない、可溶性染料は、もはや遠心分離後の水洗浄に表示されない場合。基板は、一つの追加の洗浄を与えられるべきです。最後の洗浄の上清が透明になりながら、基板は、青色のままであることに注意してください。 </li><li>後で使用するために-20℃で最小量の水に懸濁染め基板を保管してください。 </li></ol> 4.定量的色素放出アッセイ注：色素放出アッセイの間に、酵素反応のリリースでRBB-染め基質の加水分解は、反応上清中に製品を染め。放出された色素の量の比色測定は、AMO​​を示しています所定の酵素のためのサンプル内に存在する酵素活性のUNT。定量法は、基板全体の異なる酵素の比較を可能にし、酵素反応（ 例えば 、温度、塩分濃度、およびpHを）影響を与える環境条件の変化を可能にします。以下のプロトコルは、定量的にタンパク質の抗菌剤の酵素活性を検出するための色素放出アッセイの調製及び性能を説明します。 <ol><li>色素放出アッセイのための準備<ol><li>冷凍染め基板を室温に戻し、所定の酵素のために経験的に決定されたアッセイ緩​​衝液（PBS）で2回洗浄することを許可します。 </li><li>実行される色素放出アッセイの数で200μlの反応容量を乗算することにより必要とされる基質懸濁液の体積を計算します。 </li><li> （光学密度まで、4.1.2で決定し、アッセイ緩​​衝液の体積に染色された基板を追加することによって、基板の懸濁液を調製2.0のOD）を分光光度計を用いて595nmで達成されます。濃縮液の1希釈：分光光度計の機能的な制限内に留まるために、1のための1.0と2.0のOD 595を測定します 。ブランクとしてアッセイ緩​​衝液を使用してください。 注：反応のための基質の濁度は非常に効率的な酵素の活性レベルと一致するように2.0を超えて上昇させることができます。 </li><li> 1mg / mlの推定濃度でアッセイ緩​​衝液中で評価されるタンパク質の抗菌剤をサスペンド。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってBCAタンパク質アッセイキットのマイクロプレートアッセイを用いて、タンパク質試料の実際の濃度をアッセイすることを決定。 mlのアッセイ緩​​衝液を使用して、/ 1 mgの原料懸濁液の濃度を調整します。 </li></ol></li><li>タンパク質抗菌のための最適なインキュベーション条件を決定する色素放出アッセイを使用して、 <ol><li> 100 ngの/μlに株式タンパク質抗菌サスペンションを希釈します。この濃度はAFを与えます体積あたりのタンパク質1μgの（10μl）をのinal反応マスをアッセイ反応に加えます。 </li><li>溶菌タンパク質に関して評価されるべき熱の範囲を決定します。これらのアッセイにおける熱範囲は5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、および65°Cが含まれていました。 </li><li> 0.5ミリリットルマイクロチューブに反応アッセイを行います。それぞれの熱的条件については、準備された基質懸濁液の200μlに株式タンパク質の10μlを添加します。 </li><li> 1時間に1回反転させることによって混合しながら8時間サーマルサイクラーでインキュベートします。 </li><li>インキュベーションに続いて、エタノールの25μLを加えることによって反応を停止させます。 </li><li> 2分間3000×gの遠心分離により未消化、不溶性基板を取り外し、未消化基板のペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェル平底マイクロプレートに各反応混合物のための反応上清150μlのを転送します。 </li><li>タンパク質antimicrobの酵素活性を測定します可溶性RBB染料の量を決定することによって、与えられた基板にIALは、酵素加水分解後の基板から解離しました。酵素活性を定量化するために、マイクロプレート分光光度計を用いて595nmでの上清の吸光度を測定します。標識された基質からの上清中に放出された可溶性染料により増加した吸光度は、酵素活性の定量的測定です。 注：吸光度の変化を595nmの色素放出反応上清の光学密度は0.01の増加で1 AU結果活性単位（AU）で表されます。酵素以外のすべての反応成分と共にインキュベートブランク反応は、によりインキュベーションにRBB標識基質から放出する任意の染料を減算するために使用されます。最適な酵素温度は、ピーク活性単位の測定値を提供します。 </li><li>繰り返し抗菌酵素の最適なバッファー条件を決定するために、種々のインキュベーション緩衝液を使用して4.2.7を通じて4.2.1ステップ。トンでHESEアッセイは、PBSを使用します。 </li></ol></li><li>タンパク質抗菌のための最適なインキュベーション温度で最小活性濃度を決定するために、色素放出アッセイを使用して、 <ol><li>アッセイ緩​​衝液を使用して株式抗菌タンパク質懸濁液の連続希釈を行います。希釈シリーズの範囲は、抗菌酵素の活性に応じて変化します。これらのアッセイに使用される連続希釈は0頁、10頁、100頁、は1ng、10ngの、100ngの、1μgの、および10μgの最終アッセイタンパク質量を生成しました。 </li><li> 48ウェル平底マイクロプレートの各反応アッセイを行います。各アッセイ条件については、準備された基質懸濁液の200μlに、それぞれのタンパク質懸濁液10μlを追加します。反応緩衝液を用いて、10μLの反応液に加え、タンパク質溶液の体積の変動を調整します。 </li><li>蒸発による体積変化を回避するために、プレートシーリングフィルムでマイクロプレートを密封します。決定された最適な中で、シェーカーインキュベーターでインキュベート振とうしながら16時間抗菌​​所定のタンパク質のためのcubation温度。 </li><li>インキュベーション後、各ウェルにエタノールを25μl加えて反応を停止し、2分間3000×gで遠心分離することによって未消化の基板を除去します。 </li><li>未消化基板のペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェル平底マイクロプレートに各反応混合物の反応上清150μlのを転送します。 </li><li>酵素活性を定量化するために、マイクロプレート分光光度計を用いて595nmでの上清の吸光度を測定します。酵素以外のすべての反応成分と共にインキュベートブランク反応は、によりインキュベーションにRBB標識基質から放出する任意の染料を減算するために使用されます。標識された基質からの上清中に放出された可溶性染料により増加した吸光度は、酵素活性の定量的な尺度を提供します。 注：吸光度の変化は、活性単位（AU）で表され、ここで、1 AU結果に595nmの色素放出反応上清の光学濃度で0.01増加。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。 MITRE社は、複数の連邦政府資金による研究開発センター（FFRDCs）を操作していない非営利会社です。

マイクロスライド拡散アッセイおよび色素放出アッセイは、以前に同定されていないタンパク質の抗菌剤を検出し、特徴づけるための利点を提供します。これらの迅速かつ高感度な方法は、大きな研究資源を投資する前に、目的の酵素を同定するための生物ソースライブラリーのハイスループットスクリーニングを可能にします。高プロファイルの標的酵素が同定されているように、検出アッセイの変動は、急速に酵素を検出するために、または酵素の生化学的特性を決定するために使用することができます。例えば、多段階のタンパク質精製スキーム中、マイクロスライド拡散アッセイは、迅速に目的の酵素を含む画分を検出することができます。また、酵素反応の最適条件は、色素放出アッセイ反応緩衝液およびインキュベーション温度を変化させることによって決定することができます。 マイクロスライド拡散アッセイで検出するために必要な酵素量の範囲は、酵素characteriの関数であり、STICS。アッセイの検出限界は、一般に、色素放出アッセイよりも酵素の多量の使用を必要とします。本研究では、色素放出アッセイ（ 図4）にマイクロスライド拡散アッセイ（ 図1）の検出限界の比較は、マイクロスライド拡散アッセイは、色素放出アッセイよりも感度が低い手法であることが示さ。酵素濃度が問題ではない場合には、マイクロスライドアッセイは、低い労働や設備要求に標的基質に対するタンパク質の抗菌剤の製造のためのライブラリーの迅速な初期スクリーニングを可能にします。多くの努力と装置を必要とするが、色素放出アッセイは、所与の基板に対して同じ又は異なる酵素の色素放出アッセイの間の比較を可能にする定量的な結果が得られ、より高感度で再現性があります。二つの方法が簡単に専門性の高い計測機器を必要とせず、ほとんどの微生物学研究室で行われています。 representaでマイクロスライド拡散アッセイで検出された最小量は1μgの（データは示していない）であった的なアッセイは、対照酵素、αキモトリプシンは、色素放出アッセイを使用して、100 ngの（ 図5）のように低い量で検出されました。 抗菌酵素の定性的な検出アッセイ法としての有用性を提供し、拡散アッセイのバリエーションの数が11,13が報告されています。これらのアッセイの見直しでは、マイクロスライド拡散アッセイは、初期画面として、その比較的高い感度と反応遵守の容易さのために開発されました。タンパク質は、にウェルから拡散するようなアガロースオーバーレイが黄色ブドウ球菌の株によってヌクレアーゼの産生を検出するために使用されたLachica ら 11の仕事、から改変、マイクロスライド拡散アッセイは、放射免疫拡散法14と同様に動作しますアガロース基質を含有します。ラジアルimmunodiffuシオンの方法は、システムが、アガロース内で拡散し、抗原と抗体との間の複合体形成の平衡に達する免疫沈降のゾーンの拡大を停止します。これとは対照的に、マイクロスライド拡散アッセイの基質は、最初に十分に周囲の溶解の継続的拡大ゾーンに拡散するタンパク質抗菌によって消化されます。酵素が活性を失うか、基板がなくなるまでゾーンの増加直径は継続されます。溶解ゾーンの生産速度は、酵素の純度、従って比活性として早くなるか、酵素の濃度が十分に増加しました。 定量的に熱殺菌されたB.に対するタンパク質の抗菌剤の酵素活性を評価するための枯草菌 、色素放出アッセイを選択しました。レマゾールブリリアントブルーR染料（RBB）を使用して比色アッセイは、基質がタンパク質抗菌activiの汎用性と敏感な評価を可能標識TY。容易に595nmで分光光度計で測定することができる水溶性の青色製品のリリースでは、RBB標識基質結果の酵素的加水分解。他のタンパク質の抗菌酵素を特徴付けるために開発さRBB色素放出アッセイのいくつかのバリエーションが、他の基材を使用したアプリケーションのために、このアッセイの柔軟性を示しています。例えば、溶菌活性をリソスタフィンの効果を決定する際に、周は、 ら 、RBB染色ブドウ球菌細胞と基板12とブドウ球菌ペプチドグリカンを用いた色素放出アッセイを報告しました。このRBB色素放出アッセイの適用の変形例では、RBB標識ミクロコッカス・ルテウス基板は、細菌感染症や悪性癌の存在、などの疾患のための診断するための迅速かつ高感度な手段として使用し、画面のために提案された缶血清15でヒトリゾチーム発現レベルと相関します。また、RBB標識された細菌細胞基質を有しますLSOリゾチーム16を検出するためのザイモグラム方法において使用されて。 我々は、酵素生産のための迅速なライブラリースクリーニングを可能にする、低下検出限界、利便性、及び色素放出アッセイの再現性を実証します。アッセイの改変は、温度、pH、および塩分の影響だけでなく、抗菌タンパク質6の活動上の他のタンパク質分解酵素の影響を含む下流の定量的な生化学的特徴アッセイ、を可能にします。また、定量的な色素放出アッセイは、所与の基板に対して複数の酵素の活性を比較するために使用することができます。 RBB色素放出アッセイは、タンパク質抗菌剤の特性評価および検出に加えて、多糖類に対する活性を有する酵素のための有用性を報告しています。 Petterssonのとエリクソンは、セルロース、キシラン、マンナン、および伝票のアモルファス、RBB染め多糖類ビーズを使用して、エンドグリカナーゼ活性を検出するためのアッセイを報告しました17インチこれらの知見の拡大では、 バチルス・チューリンゲンシスのBt-107によって生成されるキチナーゼ酵素の検出のための感度の高い方法は、RBB 18で標識されたコロイド状キチンを使用して開発されました。これらおよび他の研究から、RBB染色基板の市販の供給源は、ケラチン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、ラミナリン、D-キシラン、アゾ大麦グルカン、及びデンプンに対するものを含む、解糖活性の検出に使用するために浮上しています。 本研究では、測色結果を生成するために必要とRBB標識基質と酵素の量を減少させる、マイクロプレートフォーマットにおける色素放出アッセイの有用性を実証します。 図4および図5に示すように 、マイクロ色素放出アッセイは、酵素活性の検出のためのマイクロスライド拡散アッセイより低い検出限界を提供します。解釈の急速な使用に関して、労働者の保護、および使いやすさと、マイクroslide拡散アッセイは、抗菌活性の存在だけでなく、下流のタンパク質の単離および精製工程中の抗菌タンパク質の存在を示すための初期の高スループットスクリーニングに有用性を提供します。これら2つのアッセイの組み合わせは、新規タンパク質の抗菌剤の最初のスクリーニングおよび最終的な特性評価にお互いを補完します

抗菌剤は、ウイルス、真菌、バクテリアなどの幅広い微生物を標的とする上で重要な役割を果たします。さまざまな細菌が産生する抗菌活性は、標的特異性が広域スペクトルから種特異的までさまざまで、これには臨床的に関連する細菌性病原体も含まれます1。自然界では、バクテリオシンやリジンなどのタンパク質抗菌化合物は、自己防衛、複製、および栄養素獲得のための微生物の武器庫です2,3。微生物群集内の個体群動態のメディエーターとして機能するタンパク質抗菌薬は、非生産的で敏感な種よりも生産生物に競争上の優位性を提供します4。組換え酵素およびプロバイオティクスとして、これらのタンパク質は、細菌集団内で抗菌薬耐性が新たに拡大するたびに病原体制御の新たな供給源の必要性が高まるため、経済的および社会的にも重要です5。
新たに発見されたタンパク質抗菌剤の最初の評価には、酵素に固有の基本的な物理的特性を決定することが含まれます。潜在的な抗菌剤を迅速にスクリーニングする方法により、目的の標的基質に対して加水分解活性を持つ候補を選択できます。マイクロスライド拡散アッセイと定量的色素放出アッセイにより、酵素加水分解の検出にさまざまな基質を使用することができます。細菌の細胞壁に対して活性を持つタンパク質抗菌酵素の場合、これらのアッセイの汎用性により、生菌細胞に対する迅速かつ効果的で定性的および定量的なスクリーニング(マイクロスライドアッセイのみ)、全細菌細胞基質を加熱死滅、または標的細菌から精製したペプチドグリカンが可能になります。これらのアッセイは、代替治療薬、栄養補助食品、バイオフィルム産生阻害剤などの分野で使用するための抗菌酵素の発見に有用です。
マイクロスライド拡散アッセイと色素放出アッセイは、新規タンパク質抗菌薬の検出と特性評価のための実証された方法です。マイクロスライド拡散アッセイは、抗菌活性の相対的(定性的)推定値を提供し、酵素濃度と活性の最小限の推論を可能にします。この方法を使用すると、活動は、活性がない場合にゾーン形成が欠如する溶解ゾーンの発達として容易に視覚化されます。ゾーンの発達速度とゾーンの直径は、サンプル中に存在する酵素の量と純度を示しています。ただし、この速度とゾーン内の基質の清澄化の品質は、汚染物質の存在、加水分解反応の完全性、および基質の種類によっても影響を受ける可能性があります。干渉する汚染物質は、ウェルからの酵素拡散速度に影響を与える可能性がありますが、不完全な加水分解や基質タイプの変動は、溶解6の濁ったゾーンを引き起こす可能性があります。
色素放出アッセイは、酵素的に加水分解された基質から反応上清に放出される共有結合したRemazol brilliant blue R色素生成物の量を定量的に評価します。この分析法は、基質の違いに伴うわずかな変動性しか持たないため、マイクロスライド拡散アッセイと比較して加水分解の検出感度を高めることができます。これらの特性により、この分析法は、酵素の生化学的特性の特性評価や、異なる抗菌酵素間の比較のためのアッセイの標準化に有用性を持つことができます。
このプロトコルでは、基本的なマイクロスライド拡散アッセイと色素放出アッセイを実行する方法を提供し、それぞれの検出限界のスケールと変動性を示します。このアッセイは、特性が未評価の土壌細菌分離株の培養上清から精製された未知のタンパク質抗菌剤の基本的な評価を行うために使用されます。アッセイ内の細菌細胞基質に対する活性が観察されたため、これまで特徴付けられていなかった抗菌タンパク質と、制御タンパク質分解酵素であるα-キモトリプシンとの間の反応活性を比較することができます。これらのプロトコルは、さまざまなアプリケーションに対応するために拡張および変更できる 2 つの手法を適用するための基盤を提供します。

<table><tbody><tr><td>48ウェル平底マイクロプレート 低蒸発蓋</td><td>Becton Dickinson</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底マイクロプレート (Costar 3595)</td><td>Corning, Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-キモトリプシン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>枯草菌 168</td><td>アメリカン タイプ カルチャー コレクション</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 タッチ サーマル サイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コルク ボーラー</td><td>フンボルト</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>マクファーランド当量基準 (2.0)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-38-103</td><td></td></tr><tr><td>栄養ブロス</td> フィ<td>ッシャーサイエンティ</td>フィック <td>S25959B</td><td></td></tr><tr><td>ペプチドグリカン Bacillus subtilis 168</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69554-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1x)</td><td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レマゾールブリリアントブルーR染料(RBB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica subsp. enterica</td><td>American Type Culture Collection</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>力価トップス プレカット粘着ポリエチレンフィルム</td><td>多様化</td><td>バイオテクノロジーT-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>超純蒸留水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>名前</strong<></td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</strong<></td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>strong<>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース溶液 50 ml PBS 0.25 g アガロー</td><td></td><td></td>ス <td>溶融 PBS/アガロース 溶液栄養液に 10% アジ化ナトリウムを添加</td></tr><tr><td>培地 4 g 栄養液 500 ml I 型水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM 水 250 mM 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液 1 g NaOH 99 ml I 型水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM レマゾール ブリリアント ブルー R 色素 (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH 溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

新規抗菌タンパク質の潜在的な生産者のための大規模な微生物ライブラリーの初期評価には、より大きな研究努力とリソースを投資する前に、標的酵素をスクリーニングするための定性的および定量的な方法の両方が必要です。このプロトコルの目標は、これらの初期評価を実施するための2つの補完的なアッセイを実証することです。マイクロスライド拡散アッセイは、生存可能な細菌および熱死した細菌標的基質の両方に対するタンパク質分解活性の定性的かつ迅速な評価を可能にする初期または単純な検出スクリーニングを提供します。これに対し、色素放出アッセイの感度と再現性の向上は、タンパク質抗菌剤の加水分解活性に影響を与える環境の影響を評価および比較するための定量的なプラットフォームを提供します。特定の加熱死滅細胞培養基質をRemazol brilliant blue R色素で標識する能力は、この能力を拡大し、色素放出アッセイを調整して目的の酵素活性を特徴付けます。

マイクロスライド拡散アッセイおよび定量的な色素放出アッセイは、新規タンパク質の抗菌剤の初期調査をスクリーニングし、測定するための効果的な方法です。各アッセイは、利点と制限があります。関連して実行しかし、それらは、迅速な初期スクリーニングおよび抗菌剤の基本的な特徴付けを可能にします。 マイクロスライド拡散アッセイは、効率的にタンパク質の抗菌剤を生産、微生物ライブラリーの迅速なスクリーニングを可能にします。酵素濃度レベルが懸念される場合には、検出制約の感度は、反応ウェルより色素放出アッセイに添加される酵素のより多くの量を必要とするアッセイを制限することができます。 図1に示されるように、アッセイの質的な特性は、観察者が各ウェル内に存在する相対的な酵素の量を比較することを可能にします。 図1（a）に示す溶解の現像領域では、（25酵素のμgの）、ゾーンの前縁は、基板の濁ったまたは不完全な溶解を表示しながら、ウェルに最も近いゾーンより完全な基板の溶解を表示します。この現象は、先端の拡散酵素の減少する濃度の積は、ゾーンの直径の正確な測定を複雑にします。 図1で観察されたウェルB（15μgの）、C（10μgの）、D（5μgの）、E（1.0μgのを）、およびF（0.1 ug）で、完全な溶解ゾーンの直径は絶滅に消散します酵素の減少量に相関します。条件F（0.1μgの）のために、アガロース中の酵素濃度は、基質を加水分解し、アガロースを通​​って移動するように拡散する酵素が視覚化されることを可能にする限界未満です。マイクロスライド拡散アッセイはまた、精製された枯草菌 peptiを使用して実行しました。基板としてdoglycan（ 図2）。ゾーンが原因で均等にアガロースに懸濁するペプチドグリカンの消極的に全細胞サルモネラ菌で観察されたものよりも定義されますが、未知の抗菌酵素によるペプチドグリカンの加水分解は明らかです。 色素放出アッセイは、酵素反応に影響を与える環境因子の検出下限と変化を可能にする、マイクロスライド拡散アッセイよりも高感度かつ多用途のアッセイです。代表的なアッセイでは、温度は、抗菌酵素の最適温度を決定するために変化させ、35℃のPBS中（ 図3）であると決定しました。この最適は青色（ 図3B）、ならびに595nmで（ 図3A）での吸光度の測定から誘導活性単位で表すの増加量として、反応上清中ではっきりと見られます。ザ色素放出アッセイの汎用性は、研究者が迅速に所定の酵素のための最適なインキュベーション条件を決定するために、温度だけでなく、反応緩衝液及び緩衝液成分だけでなく、変化させることができます。 未知の抗菌酵素（ 図4）およびα-キモトリプシン制御酵素（ 図5）の活動レベルは、RBB標識枯草菌の熱殺菌された基板に対して、PBS中で35°Cの決定された最適なインキュベーション温度で測定しました。 図4および図5の結果の比較は、未知の抗菌酵素は、Bのほぼ倍の親和性を有することを示します枯草菌基板 。また、α-キモトリプシン制御が完全に熱殺菌B.を消化し ​​ませんでしたウェル内ズブチリス基板（データは示さず）。 α-キモトリプシン制御の活性は、プレートに開始されます未知の抗菌酵素のすべての酵素量全体の活性単位の継続的な上昇（ 図4、 図5）と比較して、auの周りに0.3μgの。これは、未知の酵素が高い持続活性を有することまたはB内の酵素が使用できる切断部位のより多く存在することを示すことができます枯草菌基板 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> 図1：酵素活性 サルモネラ・エンテリカ 全セル基板 に対してマイクロスライド拡散アッセイは、定性的に加熱殺菌サルモネラ・エンテリカ亜種に対する未知のタンパク質の抗菌エンテリカ （ATCC 10708）の活性を評価するために使用されました。それぞれのウェルに添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に懸濁させ、未知の抗菌性のタンパク質塊スライドは25μgの（よくA）、15μgの（よくB）、10μgの（よくC）、5μgの（よくD）、1μgの（よくE）、および0.1μgの（よくF）に含まれます。 PBS単独でのアッセイの陰性対照に用いました。溶解のゾーンは、6時間のインキュベーション後に画像化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> 図2：酵素活性に対する 枯草菌 ペプチドグリカン細胞壁マイクロスライド拡散アッセイは、定性的に枯草菌 168のペプチドグリカンに対する未知のタンパク質の抗菌活性を評価しました。 20μlのPBSに懸濁し、未知の抗菌10μgのはよくマイクロスライドのに加えました。 PBS単独で陰性としましたアッセイ（ウェルB）のための制御。溶解のゾーンは37℃で6時間のインキュベーション後に画像化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> 図3：タンパク質抗菌のための最適な反応温度色素放出アッセイの汎用性は、対象6の酵素の活性に彼らの影響を決定するために、このようなインキュベーション温度およびバッファなどの物理的および化学的パラメータの変化を可能にします。この図に示すように、未知のタンパク質の抗菌剤（1μgの）の活性は、インキュベーション温度の範囲の下でRBB標識熱死滅枯草菌に対するPBSで評価しました。 （A）に活性単位（AU）として表示され、RBB-Bの吸光度加水分解後に上清中に放出さound製品は、マイクロプレート分光光度計を用いて595nmで測定しました。各温度条件で、添加しない酵素との反応は、種々の温度でのインキュベーションから生じる任意の放出された色素の影響を減算するために使用されました。各インキュベーション温度に対応した反応上清は、吸光度測定（B）の前に画像化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> 図4：タンパク質の活動範囲は、抗菌未知のタンパク質の抗微生物の活動範囲は、0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 ngのための一晩のインキュベーション後に活性単位として測定しました。 、BCA PROTによって測定されますEINアッセイ（A）。これらの反応のために、RBB標識B.ズブチリス基板レベルは、酵素の最大量（千NG）との反応が完全に反応潜伏期間内に利用可能なすべての基質を加水分解しなかったことを保証するために595nmで5.0の光学密度を与えるように増加しました。添加しない酵素と対照反応は、単独でのインキュベーションによって引き起こされる放出色素の影響を減算するために使用されました。各酵素の量に対応する反応上清は、吸光度測定（B）の前に画像化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> 図5：α-キモトリプシンのためのα-キモトリプシン活性範囲の活動範囲は、ACTIVとして測定しました0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、及び酵素（A）1000 ngのための一晩のインキュベーション後の性ユニット。これらの反応のために、RBB標識B.ズブチリス基板レベルは、酵素の最大量（千NG）との反応が完全に反応潜伏期間内に利用可能なすべての基質を加水分解しなかったことを保証するために595nmで5.0の光学密度を与えるように増加しました。添加しない酵素と対照反応は、単独でのインキュベーションによって引き起こされる放出色素の影響を減算するために使用されました。各酵素の量に対応する反応上清は、吸光度測定（B）の前に画像化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、酵素の抗菌活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するためのプロトコルを紹介します。マイクロスライド拡散アッセイと色素放出アッセイは、標的細菌基質を利用して、定性的および定量的な酵素活性評価を行います。

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

これらの実験の全体的な目的は、抗菌活性を持つ酵素を迅速にスクリーニングし、その特性を明らかにすることです。マイクロスライド拡散法および色素放出アッセイは、目的の病原細菌などの特定の標的に対して溶菌活性を持つ新規抗菌剤の機能的探索に有用です。これらの手法の主な利点は、実行が簡便であること、実験パラメータの変更に柔軟に対応できること、そしてほとんどの微生物学研究室にある一般的な実験器具で実施できることです。マイクロスライド拡散アッセイを開始する前に、製造元のプロトコルに従い、BCAタンパク質アッセイキットを用いて評価対象となる抗菌酵素の濃度を決定する必要があります。反応緩衝液としてPBSを使用し、抗菌酵素の段階希釈を行います。タンパク質を個々のマイクロ遠心チューブに分注し、PBSを用いて容量を20 millilitersに調整します。次に、0.25 gのアガロースを50 mLのPBSに溶解させ、0.5%アガロース溶液を調製します。アガロースが完全に溶解するまで、この溶液を沸騰させて加熱します。加熱過程で失われた水分量を重量で測定し、溶液に補填します。アッセイのインキュベーション中の雑菌増殖を抑制するため、10%アジ化ナトリウム水溶液を15 µLアガロース溶液に加え、ウォーターバスで溶液の温度を50 °Cに調整します。生存細胞を基質として使用する場合は、アガロース溶液へのアジ化ナトリウムの添加は省略してください。熱死滅させた細菌基質を氷上で解凍します。細菌基質を12 mLのアガロース溶液に再懸濁し、2.0 McFarland相当の濁度標準におおよそ一致させます。溶液を通して白い背景上の黒い線を確認することで濁度を比較し、近似した濁度になるまでアガロースに細菌基質を加えます。直ちに、かつ慎重に、アガロース基質溶液を3 mLずつ各マイクロスライドにピペッティングし、溶液がマイクロスライドから溢れないようにしてください。スライドが凝固した後、直径4.8 mmのコルクボーラーを使用して、各マイクロスライドのアガロース基質層に3つのウェルをパンチします。調整した各タンパク質連続希釈液を 20 µL ずつ、対応するウェルに加えます。陰性コントロールのウェルには、牛血清アルブミンを使用してください。ポジティブコントロールとして、リゾチームなど、基質に適した既知の細菌溶解酵素を使用します。スライドを37 °C、またはその酵素の最適活性温度の加湿チャンバー内でインキュベートします。インキュベーション時間は、抗菌酵素の濃度および比活性によって異なります。典型的な反応時間は約16時間です。インキュベーションが完了したら、間接光の下でスライドを観察し、進行中のアッセイの画像をキャプチャします。焦点距離約30cmに設定した60mmレンズ付きのデジタル一眼レフカメラを使用してください。次のセグメントで実演する色素放出アッセイでは、基質がRemazol Brilliant Blue R色素（RBB）に共有結合しています。まず、200 milliMolarのRBB溶液を調製してこのプロトコルを開始します。1.25 gramsのRBBを、調製したばかりの水酸化ナトリウム溶液に溶解してください。次に、熱殺菌した細菌細胞を、湿重量0.5 gの濃度で30 mLのRBB溶液に再懸濁します。精製ペプチドグリカンを使用する場合は、ペプチドグリカンを湿重量0.3 gの濃度で30 mLのRBB溶液に再懸濁します。以降の手順は使用する基質にかかわらず同一であるため、ここでは細菌細胞のみを用いてラベル化の手順を説明します。反応混合物を回転プラットフォームに乗せ、37 °Cで6時間、緩やかに撹拌しながらインキュベートします。6時間後、反応混合物を4 °Cのインキュベーターに移し、さらに12時間、緩やかに撹拌しながらインキュベートします。インキュベーション完了後、3000 x gで30分間遠心分離し、染色した基質を回収します。基質のペレットから染料溶液をデカントします。ペレットをType I水で十分に再懸濁し、その後、遠心分離を行います。この手順で染料標識した細胞を3〜5回洗浄し、基質から非共有結合性の可溶性染料を除去します。最終洗浄では、染料放出アッセイに使用するペレット分を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。最後の洗浄の上清は透明で、基質が青色のままとなっている必要があります。染色した基質は、必要になるまで最小限の水に懸濁させ、20 °Cで保存してください。色素放出アッセイの準備として、凍結した染色済み基質を室温に戻し、その酵素に対して経験的に決定されたアッセイバッファーで2回洗浄します。本件ではPBSを使用します。必要な基質懸濁液の量を、反応液量200 µLに実施する色素放出アッセイの回数を乗じて算出してください。基質懸濁液を調製するには、まず染色した基質を適切な量のPBSに加えます。1:1希釈を行い、PBSをブランクとして595 nmにおける吸光度の初期測定を行います。595 nmにおける吸光度が2.0に達するまで、染色した基質を懸濁液に段階的に添加します。このデモンストレーションでは、染料放出アッセイを用いて、抗菌タンパク質の最適なインキュベーション条件を決定します。まず、プロトコルの本文に従い、PBSを使用して濃度を1 mg/mLに調整し、抗菌タンパク質のストック懸濁液を調製します。次に、その抗菌タンパク質ストック懸濁液を100 ng/µLの濃度に希釈します。この濃度により、アッセイ反応に添加される液量あたり1 µgのタンパク質という最終反応質量となります。評価対象の温度範囲について、0.5 mLマイクロフュージチューブを用いて反応アッセイを行います。各温度条件において、調製した基質懸濁液200 µLに、ストックタンパク質10 µLを添加してください。サーマルサイクラーで8時間インキュベートし、1時間に1回、転倒混和を行う。インキュベーション後、各マイクロチューブに25 µLのエタノールを加えて反応を停止させる。未消化の不溶性基質を除去するため、3000 x gで2分間遠心分離を行う。その後、未消化基質のペレットを乱さないように注意しながら、各反応混合液の反応上清150 µLを96ウェル平底マイクロプレートに移します。酵素活性を定量するため、マイクロプレート分光光度計を用いて、上清の595 nmにおける吸光度を測定します。標識基質から上清に放出された可溶性色素による吸光度の増加は、酵素活性の定量的測定値となります。未知の抗菌タンパク質について、熱死させたSalmonella enterica全細胞基質に対する活性を定性的に評価するため、マイクロスライド拡散法を用いました。ウェルAからFにかけて抗菌剤を段階的に増量して添加し、陰性対照としてPBSを使用しました。6時間後、各ウェルの周囲に形成された溶菌環の大きさを観察しました。酵素活性が高い場合は定性的にハロー（阻止円）が大きくなり、酵素活性が低い場合は定性的にハローが小さくなります。タンパク質抗菌剤の最適反応温度を決定するために、定量的な色素放出アッセイを用いました。反応上清の青色の濃淡、および595 nmにおける吸光度測定から得られた活性単位から、最適温度は35 °Cであることがわかります。色素放出アッセイは、Bacillus subtilis 熱死基質に対する未知の抗菌タンパク質の活性範囲を決定するためにも使用されました。α-キモトリプシンの活性範囲と比較したところ、この未知の抗菌酵素は基質に対してほぼ2倍の親和性を持つことが明らかになりました。さらに、α-キモトリプシンの活性は0.3 µg付近でプラトーに達し始めますが、未知の酵素の活性はすべての酵素量において上昇し続けました。習得すれば、マイクロスライド拡散法は30分以内に完了できます。色素放出法は1時間以内に完了可能です。各アッセイのインキュベーション時間は、酵素活性およびその濃度によって異なります。これらの手順を拡張し、バッファーのpHや塩分濃度などの反応条件を操作することで、抗菌酵素の酵素活性に影響を与える化学的要因を決定するために、色素放出法を修正することができます。このビデオを視聴することで、マイクロスライド拡散法および色素放出法を用いて、抗菌活性を持つ酵素を迅速にスクリーニングし、特性解析する方法について十分な理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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