分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

これらの実験の全体的な目標は、脂肪細胞の恒常性と分化を解析し、低酸素症と脂肪細胞のアポトーシスのメカニズムを調査することです。この方法は、肥満やII型糖尿病などの代謝分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、それらが基本的で安価な手順であるということです。これは、特定の研究モデルにおける脂肪細胞生物学の分析です。

私の研究室の博士課程の学生であるNicole Hannemannが手順を実演します。in vivoで低酸素症を定量するには、まずマウスの体重を測定します。次に、体重1kgあたり60mgの固体水酸ピモニダゾールを腹腔内に注射します。.

45分後、動物の手足を固定し、腹腔を開きます。空洞から左右の性腺周囲脂肪パッドを採取し、パッドから性腺組織を取り出します。次に、組織の重量を量り、体重あたりの脂肪パッドの重量比をグラム単位で決定します。

脂肪細胞の恒常性の組織学的分析を行うには、まずキシレンで5分間の洗浄を3回行い、続いて100%エタノールで2分間の水分補給を2回、96%エタノールで2分間の再水和を2回行って、脂肪組織切片を脱パラフィンします。次に、切片を蒸留水で5分間洗浄し、室温で10分間ヘマトキシリンで染色します。インキュベーションの最後に、切片をさらに5分間水で洗浄し、続いてエオシン溶液で30秒間染色します。

示したようにセクションを洗います。次に、96%エタノールと100%エタノールで切片をそれぞれ2回、2分間脱水します。続いて、5分間のキシレンインキュベーションを3回行います。

次に、切片を無水封入剤で取り付けます。組織の免疫組織化学的分析のためには、示したように切片を脱パラフィンし、続いて摂氏37度のプロテイナーゼKワーキング溶液で30分間消化します。消化の終わりに、PBSで組織をすすぎ、PBS中の3%過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼを10分間ブロックします。

その後、PBSで5分間を2回洗浄した後、PBS中の10%血清と結合する非特異的抗体をブロックします。次に、目的の組織と目的の抗体を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、PBSで5分間の洗浄を3回行い、切片をすすぎます。

次に、適切なビオチン化二次抗体と組織を室温で1時間インキュベートします。二次抗体標識期間の最後の30分間に、50マイクロリットルのアビジン溶液と50マイクロリットルのビオチン化ペルオキシダーゼHをセクションあたり室温で30分間平衡化します。次に、切片をPBSでそれぞれ5分間ずつ2回洗浄し、室温で100マイクロリットルのアビジンビオチンABC複合体で組織を処理します。

45分後、切片をPBSで2回洗浄し、染色が適切な強度レベルに達するまで、組織をペルオキシダーゼ基質溶液でインキュベートします。次に、切片を蒸留水で5分間洗浄し、室温で10分間ヘマトキシリンで細胞を対比染色します。対比染色後、ティッシュを再度水で洗います。

次に、切片を脱水し、無水封入剤を使用して、カバースリップでサンプルを埋入します。その後、切片を明視野顕微鏡で評価できます。成体のオスマウスの皮膚を上肢、腰部、脇腹から剥がし、皮膚をピンで固定することから始めます。

次に、脂肪細胞の培養のために、後肢の基部に位置する鼠径リンパ節を囲む後皮下脂肪組織を採取します。脂肪形成分化を解析するには、分化した脂肪細胞培養物をドラフトの下に置き、PBSで細胞をやさしく洗浄します。次に、細胞を2mLの10%ホルマリンに60分間固定します。

固定の終わりに、細胞を水で洗浄し、培養物を2ミリリットルの60%イソプロパノールで5分間処理し、続いて2ミリリットルのオイルレッドOワーキング溶液で処理します。5分後、水が透明になるまで細胞を水道水ですすいでください。そして、先ほど示したように、ヘマトキシリンで細胞を対比染色します。

その後、細胞は位相差顕微鏡で100倍の倍率で評価できます。脂肪細胞の脂質は赤く、核は青く見えます。ここでは、正常および高脂肪ダイエットマウスの脂肪パッドのセクションが示されています。

脂肪細胞のサイズと面積の定量化は、高脂肪食で処理された動物の脂肪細胞サイズの増加によって証明されるように、高脂肪食の6週間後の脂肪細胞肥大を明確に示しています。低酸素マーカーピモニダゾールで治療されたマウスでは、脂肪組織の低酸素状態の増加はHIF1α陽性脂肪細胞の増加を伴います。.さらに、ノックアウトおよびコントロールリターメイトからの脂肪切片のトンネル染色は、脂肪細胞のアポトーシスの増加が低酸素および低酸素誘導因子1α発現の存在と相関することを示しています。

予想通り、脂肪細胞におけるHif1aの発現は、低酸素状態の24時間後に増加します。さらに、QPCRによるHif標的遺伝子の定量は、低酸素条件下でのHif1aの発現増加がInos mRNA発現の増加につながることを示しています。しかし、RNA干渉によるHif1または2αのサイレンシングは、低酸素条件下でのアポトーシスから脂肪細胞を救出し、脂肪細胞のアポトーシスにおけるHifαの低酸素感覚調節の役割を確認します。

これらの手順に続いて、グルコースやインスリン抵抗性の決定など、すべてのアッセイを実行して、代謝変化や脂肪細胞機能障害に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、脂肪細胞のアポトーシスと低酸素症の研究の組織学的解析の方法についてよく理解できるはずです。