マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

この手法の全体的な目的は、ビデオイメージングを用いて、マウスの結腸運動における神経調節の変化を特定することです。本手法は、神経細胞の遺伝子におけるわずかな変異が結腸運動に影響を与えるかなど、腸管神経科学分野に関連する重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、組織が中枢神経系の入力がない状態での嚢胞となることであり、その結果、胃腸運動の制御における腸管神経系の関与を調査することが可能になります。

この手法は、脳内のシナプス機能を変化させる遺伝子変異が腸管運動能をも変化させる可能性があるため、自閉症などの神経発達症の治療への応用が期待されます。まず、解剖用ピンセットとハサミを用いて、下腹筋層を覆う表皮を切開します。腹腔を正中線に沿って胸骨まで開きます。

生理食塩水で組織を湿らせ、ピンセットを用いて盲腸を腹部から4〜5cmほど静かに持ち上げます。次に、微細解剖用ハサミを使用して、胃腸組織に触れたり、伸ばしたり、切断したりしないよう注意しながら、腸間膜を切り取りします。膀胱、精巣、およびその他の不要な組織を除去します。

次に、粗い解剖用はさみを使用して、結腸の両側にある骨盤骨の中線から約0.5 cmの位置に2本の垂直な切開を入れ、細いはさみを用いて直腸を隣接する骨盤組織から分離します。結腸から腸間膜を取り除き、生理食塩水が入ったビーカーで結腸組織の全長を洗浄します。糞便ペレットおよびその他の腸内コンテンツを除去するために、まず200 µLピペットの先端から約1 cmを切り落とし、生理食塩水で満たした5 mLシリンジにそのピペットを装着します。

次に、盲腸と直腸を除去した後、組織の向きを定めるため、粘膜に条走が見える結腸の最も近位端に昆虫ピンを刺します。ここで、近位端の組織をそっと掴み、ピペットチップを腔内に挿入し、生理食塩水を結腸内に流して廃棄容器へ排出します。続いて、同じシリンジとピペットチップを用いて、2槽式臓器浴に接続されたチューブ内の不純物を新鮮な生理食塩水で洗浄します。

器官浴を、カルボゲンをバブリングした生理食塩水でチャンバー内が絶えず灌流されるように設定し、温度プローブを用いて食塩水の温度が33～37°Cの間に維持されていることを定期的に確認します。流入リザーバーの圧力を維持するために、中心に内径5mmのガラス管が挿入されたゴムストッパーを使用します。次に、5～7cmに切断した結腸の断片を器官浴チャンバーに完全に浸し、ピンセットと標準的な綿縫製糸を用いて、結腸の近位端を流入管に、遠位端を流出管にカニューレで接続します。

結腸の近位および遠位カニューレーション間の基準距離を決定した後、組織を生理食塩水中で30分間平衡化させます。腸管運動を記録するため、結腸の順応が行われている間に、標準的な実験用レトルトスタンドを用いてビデオカメラを器官浴の10〜15 cm上方に配置し、適切なビデオキャプチャソフトウェアをセットアップします。カメラの準備が整ったら、コントロール条件下で結腸の15分間のビデオセグメントを4回記録します。

次に、目的の薬物を臓器浴に30～60分間持続灌流させ、さらに15分間のビデオセグメントを4回撮影します。最後に、処理液を新鮮な生理食塩水に交換し、1時間のウォッシュアウト期間中にさらに15分間のビデオセグメントを4回記録します。これにより、異なる処理期間に対する結腸の時空間マップを生成することができます。

腸神経系を薬理学的に摂動させた際に、シナプス変異が結腸移行性運動複合体（CMMC）を変化させるかどうかを評価するため、本実験では5-HT3および4受容体アンタゴニストであるトロピセトロンを結腸標本の臓器浴チャンバーに添加しました。トロピセトロンの存在下において、NL3R451Cマウスは野生型リッターメイトと比較してCMMC頻度の低下を示しました。対照条件下では野生型とNL3R451Cの収縮性に有意な差は見られませんでしたが、トロピセトロンは野生型およびNL3R451Cマウスの両方においてCMMC頻度を有意に減少させました。

さらに、トロピセトロンは野生型動物と比較して、NL3R451CマウスのCMMCの頻度に対してより大きな影響を及ぼしました。この手技に習熟すれば、適切に実施することで4時間で完了させることができます。この手技を行う際は、器官浴の温度を一定に維持し、カルボゲンを継続的に供給し、真空装置によって生理食塩水の溢出を防いでください。

この手順に続き、免疫細胞化学などの他の手法を用いることで、「結腸 motility の異常を示すマウスにおいて、神経細胞の割合や細胞数に変化があるか」といった追加の疑問に答えることが可能です。この手法の開発により、モルモット、ウサギ、ラット、その他の種、そして特に今回のケースであるマウスにおいて、腸管 motility に関する多様な研究が可能となりました。このビデオを視聴することで、ビデオイメージングを用いて結腸 motility の神経調節における変化を特定する方法について、十分に理解できるはずです。