昆虫モデルにおける視細胞分光感度の決意からインビボ細胞内記録

この細胞内記録法の全体的な目標は、in vivo の昆虫複眼における個々の光受容体細胞のスペクトル感度を決定することです。この方法では、細胞が感受性を持つ光の波長が、色素のフィルタリングによって影響を受けるかどうかを知ることができます。この技術の主な利点は、個々の光受容体のスペクトル感度を知ることで、動物が見ることができる色の範囲を予測できることです。

記録の準備として、実験の少なくとも45分前にキセノンランプをオンにし、ガラス電極を引っ張る少なくとも30分前にマイクロ電極プーラーをオンにします。次に、すべての録音機器の電源を入れます。デフォルトでシャッターが閉じていて、光が光ファイバーケーブルを通過しないようにしてください。

次に、微小電極プーラーを使用して微細なホウケイ酸ガラス微小電極を引き抜きます。電極を3モルの塩化カリウムで埋め戻します。標本を準備するには、顕微鏡下で、熱いワックスで小さなプラスチックチューブの内側に個々の蝶を貼り付けて、頭が動かなく、チューブの一方の端から突き出るようにします。

次に、吻、触角、翼をワックスで貼り付けます。その後、乾いたワックスで腹部を押さえます。チューブの内側、標本の腹部の後ろに湿ったティッシュを配置して、チューブを加湿し続けます。

標本が完全に動かないことを確認してください。次に、小さなワックスを使用して、磁気ベースに取り付けられたボールとソケットのジョイントを備えた小さなプラットフォームにチューブを取り付けます。解剖顕微鏡で、参照電極として、口の部分から銀線を頭部に挿入します。

実験の前に、ワイヤーをプラットフォームに恒久的に固定します。次に、カミソリの刃を使って左角膜に小さな穴を開け、ワセリンで穴を塞いで乾燥を防ぎます。角膜を切ったら、目の中の血リンパがすぐに固まって電極を挿入できなくなるため、できるだけ早く記録電極を目に挿入してください。

可能であれば、録音が行われるリグで解剖を実行します。次に、ワニ口クリップを使用して、ヘッドステージのアース線を試料プラットフォームの参照電極に接続します。電極を電極ホルダーに取り付けます。

続いて、銀線を微小電極の塩化カリウム溶液に挿入します。グースネックアタッチメント付きの光源を使用して、電極を目の中に下げながらステレオスコープで試料を照らします。電極ホルダーを調整して、微小電極が角膜に以前に開けられた穴の真上にくるようにします。

次に、回路が完成するまで、マイクロマニピュレータを使用して微小電極を眼に下げます。目に入ったら、ファラデーケージの外でステレオスコープを振ります。標本を照らす光源をオフにし、昆虫を暗順応のために10〜20分間暗闇に放置します。

1ナノアンペアの電流を印加し、電圧の変化に注意して電極の抵抗を確認します。抵抗は通常、100〜250メガオームの範囲である必要があります。次に、パルス発生器を作動させて実験中に閃光を照射し、光ファイバーケーブルを眼に向けます。

オシロスコープの電圧を確認してくださいtagライトが点滅するたびに変化します。電圧の負の変化は、電極がまだセルに入っていないことを意味します。最大電圧応答が観察されるまで、光ファイバーケーブルを試料の周りで動かします。

脱分極光応答を生成するには、マイクロマニピュレータを前後に回転させて電極の垂直方向の動きを小さくし、電極ホルダーの基部を軽くたたくか、プリアンプのバズ機能を使用します。偏光除去の光応答がオシロスコープに表示されるまで、微調整を続けます。次に、光ファイバーケーブルを調整して、最大の脱分極信号を見つけます。

マイクロマニピュレーターで微調整を行い、必要に応じてアンプのバズ機能を使用して、電極が細胞を安定して記録していることを確認します。安定した録音では、静止電位の変化がほとんどまたはまったくなく、バックグラウンドノイズが低く、一貫して大きな脱分極応答が得られる必要があります。安静時膜電位がノイズを含まず、時間の経過とともに変化しない安定した記録を行うことが不可欠です。

回答は大きく、肯定的で、過分極があってはなりません。セットアップが安定したら、ソフトウェアを開き、「実験ギャラリー」というダイアログボックスを閉じて、4つのチャネルを持つポップアップウィンドウを開きます。電圧を調整しますtagソフトウェアウィンドウの右上隅にあるスケールを500ミリボルトに。

次に、右下隅にある[開始]をクリックして録音を開始します。チャンネル 3 と 4 を最小化し、X スケールと Y スケールを調整します。その後、実験期間中、ソフトウェアの実行を待ちます。

白色光刺激の場合、最大10の個別の応答を記録し、NDフィルターホイールを応答を引き出す最大ODに設定します。ここでは、3.0 ODと2.0 ODでの応答の変化を示しています。次に、応答ログ強度曲線を提供するために、すべての組み合わせで3.5から0.0 ODまでの同じ数の応答を記録します。干渉フィルターを使用してすべての波長に対する細胞の応答を記録する前に、まずピーク波長をすばやく見つけます。

光路にNDフィルターが入っていない場合は、そこにUV透過フィルターを配置し、応答振幅を短時間観察します。青色の送信フィルター、緑色の送信フィルター、赤色の送信フィルターで手順を繰り返すと、ピーク応答がどこにあるかがある程度わかります。別の干渉フィルターに変更する前に、最大応答を提供するフィルター波長で記録します。

後続のフィルターで記録する間に、光路にフィルターを使わずにセルが白色光の1〜2回の点滅に応答できるようにして、ピーク応答が時間の経過とともに低下しているかどうかを監視するのに役立ちます。次に、他の干渉フィルターを使用して録音し、フィルターごとに最大10の応答を許可します。これは、セルに入る直前に見られる大きな負の電圧変化の例です。

ここに示されているのは、バックグラウンドノイズがほとんどなく、通常は少なくとも40ミリボルトの大きな脱分極応答であるクリーンな録音です。そして、これは、メインピークの後の負の電位変化による、不十分な録音の例です。これも不良録音の一例です。

静止電位は大きな変動を受けており、大量のバックグラウンドノイズが応答の振幅を不明瞭にする可能性があります。これは、1つの録音から得られるスペクトル感度の代表的な例です。細胞タイプは、同様の波長でのピーク感度と、感度スペクトルの全体的な形状によって分類されます。

次に、同じ細胞タイプを平均化し、平均感度を各波長の標準エラーバーでプロットします。このグラフは、昆虫に見られる3つの典型的な細胞タイプのスペクトル感度を示しています。一度マスターすれば、このテクニックは約2時間で完了します。

この手順に続いて、すべての光受容体細胞タイプが色識別に寄与しているかどうかを判断するために、行動実験を行うことができます。