Name: 昆虫モデルにおける視細胞分光感度の決意からインビボ細胞内記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ昆虫複眼の視細胞分光感度測定法。細胞内記録により個々の光受容細胞の応答を測定し、フィルタリング色素の影響を評価して色覚範囲を予測します。

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私たちは励ましのために、私たちに機器を貸し出すためのカルダン腕周囲長、キンバリージャミソン、マシューマクヘンリー、およびラジュMetherateを製造するための後半ルディリンブルフに感謝し、Almutケルバーと健太郎有川。この作品は、ADBに国立科学財団（NSF）大学院研究KJMへのフェローシップとNSF助成金IOS-1257627によってサポートされていました

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

細胞内記録が原因関与する多くの技術的な手順に習得するのが困難な技術であることができます。成功した実験のために、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。まず、実験が行われた正常振動絶縁テーブルを有することが重要です。多くの研究者が完全に優れた振動絶縁を与え、ベースから卓上を分離する空気テーブルを使用します。私たちのセットアップは、マイクロマニピュレーター/電極ホルダ/試料ステージ装置を置かれる、上部のサンドボックスと厚い大理石のテーブルが含まれます。これは、社内のガスまたは圧縮空気へのアクセスが制限である場合は特に、空気テーブルに効果的な、より手頃な価格の代替手段です。追加の振動吸収対策は、このような受動的なエアサスペンション、またはテーブル脚（ 例えば 、開かれたテニスボール、自転車のチューブ、厚いゲルパッド）にクッション性元素の添加としてもよいです。また、実験は内側にあることが不可欠です正しく接地されたすべてとファラデーケージ。ファラデーケージは、ケージ内で作業するときは削除され、記録時に容易に交換することができます前面に金属メッシュスクリーンを持っている必要があります。周囲の電気的ノイズ（主AC電源から、特に5...

例えば、神経細胞などの細胞の電気的特性は、電圧又は電流の変化として、細胞膜を横切るイオンの流れを測定することによって観察されます。電気種々の技術は、細胞内の生体事象を測定するために開発されてきました。動物の眼で見られるニューロンはアクセス可能であり、その回路は、これらの細胞を電気生理学的研究のための良い候補を作り、多くの場合、脳内のよりも複雑ではありません。目の中の電気生理学の一般的なアプリケーションは、電図（ERG）1,2および微小電極の細胞内記録を含みます。 ERGは、動物の眼内または上に電極を配置し、光刺激を印加し、全ての周辺セル3-6の応答の和として電圧の変化を測定することを含みます。一つは、個々の光受容細胞の分光感度を特徴付けるにおいて特に興味がある場合、多くの場合、複数の細胞型は、同時に与えられた刺激とは異なる強度で応答します。したがって眼におけるスペクトル的に類似した光受容体細胞のいくつかの異なる種類がある場合は特にERGデータから特定の細胞型の感度を決定することは困難です。 1つの可能な解決法は、眼の過半数R1-6細胞で発現関心の感光体（オプシン）遺伝子を有するトランスジェニックショウジョウバエを作成し、ERGを7を実行することです。この方法の潜在的な欠点は、感光体タンパク質8、およびトランスジェニック動物の作製およびスクリーニングのための長い時間枠の低発現に何が含まれていません。スペクトル的に別個の光受容体の少ない種類の目のために、着色されたフィルタを使用して、目の適応は、それによって分光感度極大9の推定を可能にして、ERGにいくつかの細胞型の寄与を低下させることを支援することができます。 細胞内記録は、微細な電極は、セルをimpales別の技術であり、刺激が適用されます。電極レコードだけがINDIVidual細胞の応答の記録と、複数の個々の細胞を分析して、生理学的に異なる細胞型の特定の感度10-14を得ることができるようにします。我々のプロトコルは、分光感度の分析に焦点を当てているが、シャープな電極を有する細胞内記録の基本的な原理は、他​​のアプリケーションに修正可能です。例えば、試料の異なる調製物を用い、かつシャープな石英電極を用いて、1は、提起された課題に応じて、脳内の視神経葉や他の地域でより深いから記録することができます。例えば、個々の光受容体細胞15の応答時間は、視神経内の細胞活性は、19にも同様の技術を用いて記録することができ、または色刺激は、偏光20と置き換えることができる16（薄層、髄質またはlobula 17）、脳18または他の神経節のローブ-22または運動は23,24を刺激しました。 光情報伝達、光による処理エネルギーが吸収され、電気信号に変換され、ほぼすべての今日の動物門25に共通の古代の特色です。視細胞で見られ、視覚的な光伝達を開始する責任視覚色素はロドプシンです。すべての動物におけるロドプシンは、網膜または類似の分子26,27由来するオプシンタンパク質、7膜貫通Gタンパク質共役受容体ファミリーのメンバー、および関連する発色団で構成されています。オプシンのアミノ酸配列と発色団の構造は、光の異なる波長にロドプシンの吸光度に影響を与えます。光子は、発色団に吸収されるとロドプシンは、最終的には膜結合型イオンチャンネル28の開口部につながる細胞内のGタンパク質のカスケードを開始する、活性化。ほとんどのニューロンとは異なり、光受容体細胞を光刺激の変化に応答振幅の相対的な変化として測定することができる段階的な電位変化を受けます。一般的に与えられました感光体の種類が唯一のオプシン遺伝子を発現する（例外は8,10,29-31存在しますが）。洗練されたカラービジョンは、多くの脊椎動物と節足動物に見られる種類のもので、それぞれが1つまたは時折それ以上のロドプシン型を発現する光受容細胞の数百または数千の複雑な目で達成されます。視覚情報は、色や動きの完全な画像の認識結果として、眼と脳内の複雑な下流の神経シグナリングを介して感光体モザイクを超える応答を比較することによって捕捉されます。 細胞内記録を介して異なる波長の光を光受容細胞の生の応答を測定した後、その分光感度を算出することができます。この計算は、光受容体細胞の応答は、それが32を吸収した光子の特定の特性にそれが吸収する光子の数に依存するが、ではないことを述べてUnivarianceの原理に基づいています。 absoである任意の光子応答の同じ種類を誘導するロドプシンによってrbed。実際には、これは、細胞の生の応答振幅が原因（より多くの光子が吸収する）、 またはそのピーク感度（その波長を吸収するロドプシンの確率が高い）に向けて波長のシフトに光強度の増加のいずれかに増加することを意味します。我々は、既知の強度と異なる波長での応答に同じ波長と同じ強度が、未知の相対感度で細胞応答を関連で、この原理を利用しています。細胞型は、しばしば波長におけるそれらの感度ピークによって識別されます。 ここでは、より広い研究コミュニティには、この方法は、よりアクセスしやすくに焦点を当てて、細胞内記録と蝶の眼における光受容体の分光感度の分析のための1つの方法を示します。細胞内記録は、特に昆虫における色覚に関して、文献に共通のままであるが、我々はthaのを発見しました材料および方法のトンの記述は、通常、技術の再生を可能にするにはあまりにも短いです。私たちは、その簡単に複製を可能にする目的で、ビデオ形式で、この方法を提示します。我々はまた、容易に入手可能で手頃な価格の機器を用いた手法について説明します。私たちは、新しい、複雑な技術を最適化する際、研究を遅く頻繁に報告されていない一般的な注意事項に取り組みます。

<table><tbody><tr><td>蝶の蛹</td><td></td><td></td><td>利用可能ないくつかの地元の種は、出荷のためにUSDAの許可が必要です。カロライナバイオサプライは、追加の許可を必要とせずに米国内で注文することができるいくつかの昆虫種を持っています</td></tr><tr><td>大きなプラスチックシリンダー</td><td></td><td></td><td>加湿されたままの任意のチャンバーは動作します</td></tr><tr><td>昆虫ピン、サイズ2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100%デザートメスキートハニー</td><td>トレーダージョーズ</td><td></td><td>任意の蜂蜜やスクロース溶液はキ</td></tr><tr><td>セノンアークランプ</td><td>オリエルで動作しますインスツルメンツ</td><td>66003</td><td>オリエルはニューポート・コーポレーションの</td></tr><tr><td>ユニバーサル電源</td>の一部になりました <td>オリエル・インスツルメンツ</td><td>68805</td><td>オリエルはニューポート・コーポレーション</td></tr><tr><td>のオプティカル・トラック</td>の一部になりました <td>オリエル・インスツルメンツ</td><td>11190</td><td>オリエルはニューポート・コーポレーション</td></tr>の<tr><td>レイルキャリアの一部になりました (2x)</td><td>オリエル・インスツルメンツ</td><td>11641</td><td>オリエルはニューポート・コーポレーション</td></tr><tr><td>の一部になりましたレイルキャリア、小型(4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Orielは、Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor、8-32オスから1/4-20オス、10個入りパック</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optical Mounting Post、1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in.Diameter Posts, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Condenser lens assembly</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Convex silica lens, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>6ポジションフィルターホイール、x2</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>フィルターホイールマウントハブ</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>凹型シリカレンズ、25.4 mm</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>SPC034</td><td></td></tr>コリ<tr><td>メーターホルダー</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>77612</td><td></td></tr>コリ<tr><td>メーティングビームプローブ</td><td>ニューポートコーポレーション</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>フェルールコンバータ、SMA終端から11 mm標準フェルール</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>このアダプタにより、光ファイバをコリメータホルダーに適合させることができます&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu;m径UV-visファイバーオブティックケーブル</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel は現在</td></tr>、<tr><td>ドライブユニット</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV溶融シリカメタリックNDフィルター、0.1 OD</td>ニュー<td>ポート</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UVフューズドシリカメタリックNDフィルター、0.3 OD</td><td>ニューポート</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UVフューズドシリカメタリックNDフィルター、0.5 OD</td><td>を備えたシャッターの一部ですニューポート</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV溶融シリカメタリックNDフィルター、1.0 OD</td><td>ニューポート</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV溶融シリカメタリックNDフィルター、2.0 OD</td>ニュー<td>ポート</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV溶融シリカメタリックNDフィルター、3.0</td><td>ODニューポート</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Calランプ</td><td>オーシャンオプティクス</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>分光計</td><td>オーシャンオプ</td>ティクス<td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuiteソフトウェア</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルタ、300 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、310 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、320 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、330 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、340 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、350 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、360 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、370 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、380 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、390 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、400 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、410 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、420 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、430 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、440 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、450 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、460 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、470 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、480 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、492 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、500 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、510 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、520 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、532 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、540 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、550 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、560 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、570 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、580 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、589 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、600 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、610 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、620 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、632 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、640 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、650 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、660 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、671 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、680 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、690 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>干渉バンドパスフィルター、700 nm&nbsp;</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td></td><td></td><td>接地可能で実験的なセットアップに適した金属構造であれば、どんな構造でも機能します。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡、6倍、12倍、25倍、50倍倍 倍</td>率 <td>ワイルド・ヘールブルッグ</td><td>ワイルドM5</td><td>任意の実体顕微鏡は、</td></tr><tr><td>スイングアームと重いベースを備えた顕微鏡スタンド</td>を行います <td>マクベイン・インスツルメンツ</td><td></td><td>アーム付きの任意の重いベースは</td></tr><tr><td>、カルダンアーム</td><td></td><td></td>を行います <td>カスタムビルド、Figure 4</td></tr><tr><td>Fiber-lite高強度イルミネーター</td><td>を参照してください Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>照明試料用</td></tr><tr><td>ファイバーライトグースネックライトガイド</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>どんなグースネックライトガイドでも</td></tr><tr><td>大理石のテーブル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>隆起した木製のテーブル</td><td></td><td></td><td>穴は、砂場が下の大理石のテーブルに載るように、このテーブルを通して切られるべきです</td></tr><tr><td>砂</td><td></td><td></td>で満たされた木箱 <td>カスタムメイド、砂</td></tr><tr><td>の入った任意の箱マニピュレーター</td><td>カール・ツァイス - イエナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試料ステージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>接地<td></td><td></td><td></td><td>用ワニ口クリップワイヤー</td></tr><tr><td>絶縁銅線</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>銀線、直径0.125mm</td><td>ワールド精密機器</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNCケーブル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ付きプリアンプ</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug ノイズリデューサー</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ、30 MHz、2 CH、デュアルトレース、Altトリガー、プローブなし</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab ハードウェア 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchartソフトウェア</td><td>ADI機器</td><td>Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz パルス発生器</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>フィラメント付きホウ珪酸ガラスキャピラリー</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スロット付きプラスチックチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低融点ワックス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>はんだごて</td><td>ウェラー</td><td></td><td></td>プラットフォーム、</tr><tr><td>ボールとソケットの磁気ベース付き</td><td>ハマの写真とビデオ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダブルエッジ炭素鋼、壊れやすいカミソリの刃</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロソフトエクセル</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

昆虫モデルにおける視細胞分光感度の決意から<em&gt;インビボ</em&gt;細胞内記録

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

細胞内記録は、単一の細胞が与えられた刺激に応答することができる方法を決定するために使用される強力な手法です。ビジョン研究では、細胞内記録は、歴史的に今日でも使用されている異なる光刺激に対する個々の光受容細胞の感度を研究するために使用される一般的な技術となっています。しかし、目に細胞内記録実験を複製することを望む研究者のための文献で詳細な方法論の不足が残っています。ここでは、より一般的には目の生理機能を調べるためのモデルとして昆虫を提示します。昆虫視細胞は、眼の表面付近に位置するので、簡単に行くことができている、とビジョンに関与する機構の多くは、動物門を越えて保存されています。私たちは、電子が少し前に経験を持つ研究者へのこの技術は、よりアクセスしやすくすることを目標に、蝶の眼における光受容体細胞のin vivoでの細胞内記録のための基本的な手順を説明しますlectrophysiology。我々は、単一の細胞内へのガラス微小電極、最後に記録手順自体を挿入する方法、記録のためのライブ蝶を準備する方法、必要な基本的な設備を導入します。我々はまた、個々の細胞型の分光感度を測定するための生のレスポンスデータの基本的な分析を説明します。我々のプロトコルは、分光感度を決定することに焦点を当てているが、他の刺激（ 例えば 、偏光）及び方法のバリエーションは、このセットアップに適用可能です。

録画設定の多くの要素については、書面による説明は十分な詳細情報を提供していません。 図1は、完全な記録のセットアップに含まれるコンポーネントの概略図です。 図2において、スペクトルは補正係数が必要とされる理由の感覚、何この補正を計算するために必要とさを与えるために、白色光、各干渉フィルタのためにプロットされている。 図3は、写真を示し、カルダンアームの図は、これらのために使用されます実験。 図4は、記録ステージとマイクロマニピュレーターを示す合成画像である。 図5は、実験のために蝶の製造におけるいくつかのステップを示しています。 記録が開始されると、光のフラッシュに応答して、電圧の負の変化は、電極は、 図6aのように、細胞の外にあることを意味します。応答の強さは、電極の距離によって異なります視細胞、および光フラッシュの入射角度に傾...

細胞内記録の電気生理学的技術を実証し、バタフライの複眼における単一の光受容体細胞の分光感度を決定するために使用されます。

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

この細胞内記録法の全体的な目的は、昆虫の複眼における個々の光受容細胞の分光感度をin vivoで決定することです。この手法により、細胞が感応する光の波長がフィルタリング色素によって影響を受けているかどうかを判断できます。この技術の主な利点は、個々の光受容細胞の分光感度を明らかにすることで、その動物がどの範囲の色を視覚的に認識できるかを予測できる点にあります。記録の準備として、実験の少なくとも45分前にキセノンランプを点灯させ、ガラス電極を製作する少なくとも30分前にマイクロ電極プラーを起動してください。次に、すべての記録装置の電源を入れます。デフォルトでシャッターが閉じられており、光ファイバーケーブルに光が通過しない状態であることを確認してください。次に、マイクロエレクトロードプラーを用いて、細いホウケイ酸ガラス製微小電極を製作します。電極内部に3 Mの塩化カリウムを満たします。検体を準備するために、顕微鏡下で、個々のチョウを小型プラスチックチューブの中にホットワックスで固定し、頭部がチューブの一端から突き出し、動かない状態にします。次に、口器、触角、および翅をワックスで固定します。その後、腹部を乾燥したワックスで押さえます。標本の腹部の後ろ側に濡れたティッシュを入れ、チューブ内を加湿状態に保ちます。検体が完全に固定されていることを確認します。次に、ワックスの小片を用いて、チューブを磁気ベースに取り付けられたボールジョイント付きの小型プラットフォームに固定します。解剖顕微鏡下で、参照電極として銀線を口部から頭部に挿入します。実験の前に、ワイヤーをプラットフォームに完全に固定します。次に、カミソリで左側の角膜に小さな穴を開け、乾燥を防ぐためにその穴をワセリンで封止します。角膜を切開すると、眼内の血リンパが急速に凝固して電極の挿入が不可能になるため、速やかに記録電極を眼内に挿入してください。可能であれば、記録を行うリグ内で解剖を行ってください。次に、ワニ口クリップを使用して、ヘッドステージの接地線を試料プラットフォーム上の参照電極に接続します。電極を電極ホルダーに取り付けます。次に、マイクロ電極内の塩化カリウム溶液に銀線を挿入します。ステレオ顕微鏡下で眼球に電極を挿入する際は、グースネックアタッチメント付きの光源を使用して試料を照らしてください。電極ホルダーを調整し、マイクロ電極が角膜にあらかじめ開けておいた孔の真上に位置するようにします。次に、回路が形成されるまで、マイクロマニピュレーターを用いてマイクロ電極を眼内に挿入します。眼内に挿入したら、ステレオスコープをファラデーケージの外側に移動させます。標本を照らしている光源を消し、暗順応させるため、昆虫を10～20分間暗所に置きます。1 nanoampの電流を流し、電圧の変化を確認して電極の抵抗を測定します。抵抗値は通常、100から250 megaohmsの範囲内である必要があります。次に、パルスジェネレーターを起動して実験期間中に光フラッシュを照射し、ファイバー optic ケーブルを目的に向けます。光フラッシュごとの電圧変化をオシロスコープで確認します。電圧が負に変化している場合は、電極がまだ細胞内に進入していないことを意味します。最大電圧応答が観察されるまで、試料の周りで光ファイバーケーブルを移動させてください。脱分極的な光応答を誘発させるために、電極ホルダーの底部を軽く叩くか、プリアンプのバズ機能を使用しながら、マイクロマニピュレーターを前後に回転させて電極を垂直方向にわずかに移動させます。オシロスコープに脱分極的な光応答が現れるまで、微調整を繰り返します。その後、光ファイバーケーブルを調整して、最大の脱分極信号が得られる位置を探します。マイクロマニピュレーターを用いて微調整を行い、必要に応じてアンプのバズ機能を使用して、電極が細胞を安定して記録しているかを確認します。安定した記録とは、静止電位の変化がほとんどなく、バックグラウンドノイズが低く、一貫して大きな脱分極応答が得られる状態を指します。静止膜電位にノイズがなく、経時的に変化しない安定した記録を得ることが不可欠です。応答は大きく正の値であり、過分極が見られない必要があります。セットアップが安定したら、ソフトウェアを起動し、「Experiments Gallery」というダイアログボックスを閉じて、4つのチャンネルが表示されるポップアップウィンドウを開きます。ソフトウェアウィンドウの右上隅にある電圧スケールを500 millivoltsに調整します。次に、右下のStartをクリックして記録を開始します。チャンネル3と4を最小化し、XおよびYスケールを調整します。その後、実験時間の間、ソフトウェアを動作させます。白色光刺激では、応答が誘発される最高OD値にNDフィルターホイールを設定し、最大10個の個別の応答を記録します。ここでは、3.0 ODおよび2.0 ODにおける応答の変化を示しています。次に、応答の対数強度曲線を算出するため、3.5から0.0 ODまであらゆる組み合わせで同数の応答を記録します。干渉フィルターを用いて全波長に対する細胞の応答を記録する前に、まず迅速にピーク波長を特定します。光路にNDフィルターを配置しない状態で、UV透過フィルターを設置し、応答振幅を短時間観察します。同様の手順を、青色透過フィルター、緑色透過フィルター、および赤色透過フィルターで繰り返し、応答のピークがどこにあるかを確認します。別の干渉フィルターに変更する前に、最大応答が得られたフィルターの波長を記録してください。フィルターを切り替えて記録を行う間に、光路にフィルターを挟まずに1〜2回の白色光フラッシュを照射して細胞に反応させ、ピーク応答が経時的に低下していないかを確認します。その後、他の干渉フィルターを用いて記録を行い、フィルターごとに最大10回の応答を取得します。これは、細胞内に進入する直前に見られる大きな負の電位変化の例です。ここに示すのは、背景ノイズが少なく、通常少なくとも40 millivoltsの大きな脱分極応答が得られている良好な記録です。そして、こちらはメインピーク後の電位が負方向に変化しているため、不十分な記録の例となります。これもまた、不適切などの記録例です。静止電位に大きな変動が生じており、多量の背景ノイズによって応答の振幅が不明瞭になる場合があります。これは、単一の記録から得られた分光感度の代表例です。細胞型は、同様の波長におけるピーク感度および感度スペクトルの全体的な形状によって分類されます。その後、同じ細胞型を平均し、各波長における平均感度を標準誤差バーと共にプロットします。このグラフは、昆虫に見られる3つの代表的な細胞型の分光感度を示しています。この手法に習熟すれば、約2時間で完了させることができます。この手順に従って行動実験を行うことで、すべての光受容細胞タイプが色識別に関与しているかどうかを判定することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、動けなくなったショウジョウバエの眼の光受容体活動の電気生理学的記録のプロトコルを概説し、光刺激に応答した電圧変化の正確な測定を可能にします。...

光刺激に対するショウジョウバエ網膜光受容体の電圧応答の電気生理学的記録

このビデオは、全細胞構成を確立することにより、ショウジョウバエのommatidiumの光受容体ニューロンの電気的活動を記録する方法を示しています。これは、光パルスによる一過性受容体電位チャネルの活性化を強調し、測定可能な量子バンプをもたらします。...

ショウジョウバエの光受容体からの全細胞電圧クランプ記録

このビデオは、蝶の眼に光受容体細胞をin...

蝶の光受容体細胞スペクトル感度のin vivo細胞内記録

出典:Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-tagged Proteins. J. Vis. Exp.

ショウジョウバエの視細胞における膜タンパク質輸送の研究

Sharp微小電極は、生きたショウジョウバエの光受容体および視覚介在ニューロン出力の正確な電気生理学的特性評価を可能にします。ここでは、この方法を使用して、制御された光刺激に対する個々の細胞の高品質な電圧応答を記録する方法を示します。この手法は、昆虫の複眼における神経情報処理の研究に最適です。...

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。...

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。...

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

概日時間の関数としてのザリガニ光受容体の脱感作と感度回復の研究のためのプロトコルが提示される。...

光刺激の送達時のザリガニ光受容体の脱感作と回復

我々は、(i)光子吸収後の光色素分子内の電荷変位と光受容体におけるそれらの膨大な量を利用すること、および(ii)ロドプシンおよびメタロドプシン光顔料状態の吸収スペクトルの違いを利用すること、の電気生理学的に双安定光顔料を特徴付けるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、双安定な光色素系に影響を及ぼす変異をスクリーニングするのに有用である。...

ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

このビデオでは、E13ラット背側脊髄から交連神経細胞を細かく分析し、文化に方法を示しています。解離交連ニューロンの軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムを研究するのに便利です。...

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

学ぶ昆虫複眼の視細胞分光感度測定法。細胞内記録により個々の光受容細胞の応答を測定し、フィルタリング色素の影響を評価して色覚範囲を予測します。

昆虫モデルにおける視細胞分光感度の決意から

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